专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 无机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动 态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降 低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每 100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35~~40。当二者乘积大于40时，钙 和磷以骨盐形式沉积在骨组织，〉70时，可发生转移性钙化。当乘积 <35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用， 引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状 旁腺激素^:降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分 析磷酸盐阴离子(H2P041—， HP042—)。常用的方法有磷钼酸还原法，非 还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度 法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐 的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中 加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类
很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米
吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂 聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm 有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用 下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量/ 连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340mn波长处吸光度的 变化，得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现 该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在 紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定， 而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明无机磷浓度测定方法原理如下
磷黢根+蔗糖蔗糖磷酸化酶D-果糖+葡萄糖-1-磷酸 果糖+辅酶果糖脱氢酶脱氢果糖+还原型辅酶 这种方法应甩蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases ; EC 2.4.1.7)酶(偶)联果糖脱氢酶(Fructose dehydrogenase ; EC 1.1.1.124; EC U.99.11)酶促反应速率比色法/终点法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反 应产生果糠，再通过(偶)联合果糖脱氢酶的作用，最终将辅酶(在
340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测 量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算无机磷的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/
测定试剂盒较为理想
缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
蔗糖 30 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 12000 U/L
果糖脱氢酶 16000 U/L
本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓沖液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖。 试剂2
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。 辅酶、,蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位
置可以不跟。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2
缓冲液、蔗糖。 试剂3
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。 辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂
3中的位置可以不限。试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后
使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷浓度的方法，其辅
酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
蔗糖 30 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 12000 U/L
果糖脱氢酶 16000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂-, 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷 样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟 时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷 的浓度大小。 实施例二
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 40 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定齐u
蔗糖磷酸化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3000 U/L果糖脱氢酶 20000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始
吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷 样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升 反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷 的浓度大小。 实施例三
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
试剂
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
蔗糖磷酸化酶
3 mmol/L
10Ommol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 24000 U/L
果糖脱氢酶 36000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反 应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长 405nm，被测无机磷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右， 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷 的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种酶比色法及酶联法的无机磷(磷酸根)的浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+蔗糖 蔗糖磷酸化酶 D-果糖+葡萄糖-1-磷酸果糖+辅酶 果糖脱氢酶 脱氢果糖+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出无机磷的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——50 mmol/L辅酶 1--6 mmol/L蔗糖 1--50mmol/L蔗糖磷酸化酶 1000——80000 U/L果糖脱氢酶 1000"~~"80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成 单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成。辅酶、蔗糖、 蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成 多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓 冲液、蔗糖组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果 糖脱氢酶组成。辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1一4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101173941SQ200610097318
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司