专利名称：Abo血型反定型试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂，特别是血液检测试剂，具体是用于ABO血型的反定型血液检测试剂。
背景技术：
红细胞血型是最早发现的人类血型，为人类一种遗传标记，对人类学、遗传学、输血、配型、器官移植和新生儿免疫疾具有重要意义。自Landsteinor(1900)发现ABO血型以来，Hoktoen早在1907年就提出了血型鉴定对输血治疗的重要性，Ottenberg等在1908年进一步提出了供受体血液交叉配合实验的概念，更强调血型鉴定对临床输血的深远意义。由于ABO血型在输血中的重要性，正确鉴定ABO血型是安全输血的保证。ABO血型鉴定的原理是基于抗原-抗体反应产生细胞凝集，使用抗A、抗B血型定型试剂检测红细胞抗原称之距定型；用A血型和B血型红细胞检测血清中抗体称之反定型。人ABO血型由红细胞抗原和血浆(血清)中抗体所决定，其正反定型结果相符，同时对照也必须成立，才能正确地判断ABO血型。
ABO血型不相容输血几乎毫无例外要发生严重地即发性溶血性输血反应症状。正确的血型检定方法和合格的血型试剂是同等重要的。英国药典中特别强调“检测ABO血型要检测红细胞抗原和血清或血浆中抗体两个方面”。这是因为人ABO血型是由细胞表面抗原和血液中抗体两者决定的，两者都检测即正反定型，才能正确地判定ABO血型。为了增加ABO正定型的可靠程度，在准确进行正定型的同时必须进行反定型试验，即用已知血型标准红细胞作为试剂检测受检血清中的血型抗体。{中华人民共和国药典}2005年版，对于健康献血员血型检测标准中明确指出用国家药品监督管理当局批准的抗A、抗B血型定型试剂测定，ABO血型以正反定型法鉴定。为了提高血液质量，减少ABO血型定型差错事故的发生，在进行正定型的同时还必须进行反定型。
进行反定型测定需要提供一种反定型测定试剂，该试剂内含A、B、O血型的红细胞，和一种具有缓冲能力红细胞保存液，该保存液可将红细胞悬浮，并有效保存，使用时将该试剂和血液样本混合，观察凝集现象，即可得出阳性或阴性结果。
现有的红细胞保存液如阿氏液，其组成为绿霉素0.33克枸橼酸单水(C6H8O7·H2O)0.55克葡萄糖(C6H12O6)，20.5克肌苷(inosine)2.0克硫酸新霉素(Neomycin sulphate)0.5克氯化钠4.2克橡橼酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)8.0克蒸馏水至1000ml该保存液的PH为6.8±0.2，渗透压为340±10mOsm/kg。
用阿氏液制备的血型反定型试剂在4℃可保存一个月，除去运输分配时间，到达最终使用者手里就只有2周左右的有效期，还不考虑长途运输对细胞膜的稳定性及细胞活力的影响，检测的成本对于很多使用者来说是很高的。
另如日本的MAP液、AS-5液等，都因为保存血型红细胞的保存期短(仅为1月)、血型红细胞的颜面色变深发黑而不理想。
本发明提供的血型反定型试剂，不仅从延长红细胞保存期方面研究，还通过营养体系、缓冲体系、防腐体系、过滤洗涤红细胞、分光光度计调控红细胞浓度(保持批和批之间一致性)等方面来开研制血型反定型试剂，使得红细胞浓度得到标准化，且经过对红细胞进行处理，用含有多种化学试剂的保养液，不仅延长了红细胞的保存期和红细胞的新鲜度，同时还保持了红细胞上ABO抗原的强度。我们为了血型反定型试剂保存时间短、易发生溶血、浓度调控等问题，分别从三方面进行改进(1)对血型反定型试剂进行检测处理，包括各种传染源的检测、非红细胞血液成分的去除、幼稚红细胞及红细胞碎片的去除。
(2)研制优质高效的血型红细胞保存液，包括缓冲体系(调节并维持适合的PH值)、营养体系(保持红细胞活力、颜色鲜红、调节红细胞沉降及悬浮难易程度等)、渗透压调节体系(防止红细胞溶血、稳定红细胞膜的完整、保持抗原活性)和防腐体系(防止试剂红细胞滋生细菌而变质)。
(3)利用透光原理，利用分光光度计准确调节血型反定型试剂的浓度，保证标准化的浓度。我们研制的血型反定型试剂，不仅具有凝集反应强、无溶血现象、无前带现象的特性，还具有较强的抗干扰能力，可以在开放状态下保存且稳定性较好。
为了达到保证血型反定型试剂性质稳定的目的，我们成功研制了一种标准化的红细胞保存液体系及血型反定型试剂的制备方法，不仅延长了血型红细胞在2-8℃条件下的保存时间，同时还保持了红细胞上ABO抗原的强度以及红细胞的新鲜度，不发生溶血并易于沉降和悬浮。
发明内容
本发明提供一种新的ABO血型反定型试剂，该试剂是通过对保存液的配方的改进达到发明目的的。
本发明在阿氏液的基础上，分别改进其缓冲体系，即从单一的枸橼酸盐缓冲体系变为枸橼酸盐-磷酸盐双缓冲体系，可以更好的维持保存体系PH值的稳定。增加腺嘌呤为营养成分，使得红细胞在保存过程中含氧量高，保持鲜红的颜面色。防腐系统不采用任何化学防腐剂如叠氮钠、硫柳汞等成分，因为化学防腐剂会影响红细胞含氧量，导致红细胞颜面色变深发黑。此外添加EDTA二钠盐，来防止血型红细胞在补体诱导作用下产生溶血现象。本发明根据现有技术，做了大量的筛选，提供了新的保存液配方，特别是加入稳定剂EDTA二钠，采用单水葡萄糖，氯霉素，以及通过调整各组分的比例，使本发明优点更加突出。
本发明的血型反定型试剂保存液，优选的配方如下枸橼酸三钠10-20克磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.3-0.5克磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.5-0.9克乙二胺四乙酸二钠 0.8-1.2克氯化钠(NaCl)6-10克单水葡萄糖(Glucose) 15-25克腺嘌呤(Adenine) 0.3-0.5克肌苷(Inosine) 2-3克氯霉素(Chloramphenicol)0.5-0.8克以上组分用蒸馏水定容至2升。
最优选的配方如下枸橼酸三钠 14.705克磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.408克磷酸氢二钠(Na2HPO4) 0.716克乙二胺四乙酸二钠 1.0克氯化钠(NaCl) 8.182克单水葡萄糖(Glucose)19.810克腺嘌呤(Adenine)0.405克肌苷(Inosine) 2.682克氯霉素(Chloramphenicol)0.66克以上组分用蒸馏水定容至2升。
本发明的血型反定型试剂，是将经过准确鉴定了A、B、O血型的红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为2-4％，用此血型反定型试剂检测标准定型试剂，其效价均不低于1∶128。在2-8℃条件下有效期不低于2个月，该血型反定型试剂用稀释8倍后的标准定型试剂检测，血型红细胞凝集强度达到3+以上。其中所述A血型，也可以是A1血型。
本发明的血型反定型试剂，其中细胞营养体系采用糖类(葡萄糖)及核苷酸(腺嘌呤)以及能量物质股苷作为添加剂，不仅可以延缓血型红细胞溶血，防止抗原强度减弱，维持血型红细胞膜的稳定，保证血型红细胞的新鲜度(含氧量)时糖类可以有效的控制血型红细胞的沉速度，使血型红细胞易于悬浮，避免红细胞聚集粘合。
本发明的血型反定型试剂，其中缓冲体系和渗透压维持体系采用盐类(磷酸盐、柠檬酸盐和氯化钠)来维持体系的PH值在6.8-6.9。磷酸-柠檬酸盐缓冲体系，与已有记载的单一枸橼酸缓冲体系相比，缓冲能力更强，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围内，同时保证了保存液的离子强度。保存液还具有较好的渗透压调节能力，利用盐类来调节渗透压与血型红细胞在体内的致性，防止血型红细胞溶血。
本发明的血型反定型试剂，其中防腐体系采用抗生素(氯霉素)防腐系统，不采用化学防腐剂。通过一定量的抗生素的协同作用，有效防止细菌的污染，控制了血型红细胞无杂菌生长，保证试剂无菌状态。
本发明的血型反定型试剂，其中EDTA二钠盐EDTA可以通过抑制补体活化来防止检测新鲜血清时血型红细胞发生溶血，从而使血型定型结果更加容易判断。
本发明的血型反定型试剂，其中配制的血型红细胞保存液需要经过除菌过滤，方法为使用不锈钢高压过滤器滤膜0.45μl，121℃下0.15Mpa高压蒸汽灭菌30分钟，并记录过滤开始时间、结束时间和过滤。
本发明的血型反定型试剂，其中血型红细胞的浓度调节采用如下方法用血型红细胞保存液洗涤4次的压积红细胞一次，弃上清液。血型红细胞保存液稀释悬浮血型红细胞，将血型红细胞浓度调节为2-4％。
本发明的红细胞保存液，可以较长时间地保存和稳定血型红细胞，从而实现血型反定型试剂的标准化生产，更好地满足准确鉴定ABO血型的要求。
本发明还提供本发明的血型反定试剂的制备方法，该方法可以达到保证血型反定型试剂性质稳定的目的。
本发明的血型反定型试剂的制备方法包括以下步骤(1)按比例配制红细胞保存液；(2)红细胞经过过滤和洗涤处理，去除其中已发生凝集的红细胞和蛋白成分；(3)用保存液调节红细胞的浓度。
对筛选得到的原料血型红细胞样本首先要进行筛选和处理，血液用经国家食品药品监督管理局批准的试剂盒检测，HBsAg、HCV抗体、HIV-1/HIV-2抗体、梅毒血清学检测应为阴性。丙氨酸氨基转移酶(ALT)值应在正常值范围内，选择在48小时内采集的合格的人A，B，O血型红细胞血型红细胞无溶血现象。用经国家食品药品监督管理局批准的抗A、抗B血型定型试剂鉴定ABO血型，并以正反定型法鉴定。选择抗原性合格的A血型、B血型和O血型红细胞，不使用亚型血。血型红细胞经直接抗人球蛋白试验，结果应为阴性。然后过滤，可用滤器过滤或滤纸过滤，目的是去除原料血液中的白细胞、血小板以及已经凝集的红细胞凝结块，防止已凝集颗粒混在血型反定型试剂中，产生假的凝集反应；然后通过洗涤去除非细胞成分的血浆蛋白，包括血型抗体成分，同时进一步去除部分白细胞和血小板，防止其破裂后产生的细胞碎片及内容物对试剂产生不良影响。最后用经除菌过滤的保存液调节红细胞的浓度，配制成适合定型使用的标准浓度血型反定型试剂。
具体配制方法如下血型红细胞保存液配制缓冲体系采用磷酸-柠檬酸盐缓冲体系，使体系的PH值维持在6.8-6.9。
营养体系采用糖类及核苷酸作为添加剂，可以保证血型红细胞的新鲜度，有效地控制血型红细胞的沉降速度，易于血型红细胞悬浮，避免血型红细胞聚集粘合。
渗透压调节体系利用盐类来调节，使得其渗透压与血型红细胞在体内的一致，防止血型红细胞溶血屏用一定量的大分子物来稳定血型红细胞膜。
防腐系统采用抗生素(氯霉素)，不采用化学防腐剂。
配制的血型红细胞保存液除菌过滤。
血型红细胞去脂、过滤、洗涤、压积、配制；血液采用白细胞滤器去除白细胞，以防止白细胞溶解所释放出的酶及产生的碎片对制品产生不良影响。
压积血型红细胞的制备全血去血浆，同型混合；A1血型、B血型、O血型血液三人份或以上，分别去血浆，等比例同型混合。
洗涤离心分别用适量生理氯化钠溶液洗涤血型红红胞三次。再用适量保存液洗涤血型红细胞一次。最后1次2000r/min离心5分钟，弃上清，沉淀即为压积血型红细胞。
配制分别用红细胞保存液将压积红细胞配制成浓度为2-4％血型红细胞悬液。半成品检定无菌试验按{中国生物制品规程}现行版通则{生物制品无菌试验规程}A3.2.3项进行。
特异性材料待检试剂(血型红细胞悬液浓度2-4％)。
抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)用经国家药品监督管理局批准的试剂，批批检合格。
抗A1、抗AB(O型10人份血清混合)和抗H。
正常AB型人血清(10人份混合)。
生理氯化钠溶液是指在22±1℃，PH7.0±0.2时8.5-9.0g/LNaCL(0.145M-0.154M)。
试验(试管法)(1)A1型红细胞试剂 按每列5支试管排列，各加入抗A、抗A1、抗B各0.1ml，然后在各试管中分别加入待检2-4％A1血型红细胞0.1ml，置18-22℃孵育15分钟，1000rpm离心1分钟，同时用AB型血清和生理氯化钠溶液做对照，肉眼观察结果。
(2)B型红细胞试剂 按每列4支试管排列，各加入抗A、抗B各0.1ml，然后在各试管中分别加入待检2-4％B血型红细胞0.1ml，置18-22℃孵育15分钟，1000rpm离心1分钟，同时用AB型血清和生理氯化钠溶液做对照，肉眼观察结果。
(3)O型红细胞试剂 按每列6支试管排列，各加入抗H、抗A、抗B、抗AB0.1ml，然后在各试管中分别加入待检2-4％O血型红细胞0.1ml，置18-22℃孵育15分钟，1000rpm离心1分钟，同时用AB型血清和生理氯化钠溶液做对照，肉眼观察结果。
结果判定A1型红细胞与抗A和抗A1试剂发生凝集反应，与抗B试剂、AB型人血清和生理氯化钠溶液不发生凝集反应。
B型红细胞与抗B试剂发生凝集反应，与抗A试剂、AB型人血清和生理氯化钠溶液不发生凝集反应。
O细胞与抗H发生凝集反应，与抗A、抗B、抗AB、AB型人血清、生理氯化钠溶液不发生凝集反应。
“/”表示不进行此单项试验“+”表示结果阳性“-”表示结果阴性抗原性检测试剂，抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)，用经国家药品监督管理局批准的试剂，批批检合格，效价为1∶128。
抗H血型定型试剂。
待检血型红细胞(2-4％)。
试验将试管排成2列，每列9支(O细胞每列3支)，自第2管起每支加入0.2ml生理氯化钠溶液，向第一支和第二支试管中分别加入0.2ml的内控品试剂，从第二管开始将内控标准抗A、抗B或抗H试剂作2倍系列稀释，每样品稀释两排。向前后排的每支试管中分别加待检的2-4％对应的血型红细胞0.2ml(如内控品抗A用来检测A1型人血红细胞)，摇匀，置18-22℃15分钟，1000rpm离心1分钟，同时用生理氯化钠溶液替代内控品抗A、抗B或抗H试剂做阴性对照肉眼观察结果。
结果判定分别判定待检试剂与相应抗体试剂产生不弱于3+凝集强度的最高稀释度和不弱于1+凝集强度的最高稀释度，2列试管相同作为待检试剂的测定结果，并应符合下表要求如2列终点相差1管且符合要求则以稀释低的判为终点，如2列终点相差1管且有1列结果不符合要求则需取双倍待检试剂复试，复试结果不得有1列度管终点不符合要求。
血型红细胞浓度的检测取20ml待检血型红细胞悬液，于1000rpm离心1分钟，去除上清液后得到压积红细胞，测量压积红细胞的体积，计算其在20ml血型红细胞悬液中所占的体积百分比。要求人血红细胞的浓度为2-4％。
溶血指标检测采用过氧化物酶的方法检测上清液中血红蛋白的含量，在波长510nm下测量，要求血红蛋白浓度不高于0.29g/L。
试验步骤按照下表顺序和体积加入试剂
结果判定游离血红蛋白浓度＝(测定管吸收值/标准管吸收值)X标准品浓度游离血红蛋白浓度≤0.29g/L为合格。
分装将血型红细胞悬液进行分装。
A1血型红细胞试剂、B血型红细胞试剂、O血型红细胞试剂，每支装量为10ml。
成品检定物理检查外观A1血型红细胞试剂试剂底部的红细胞应为鲜红色，上清液澄明，轻轻振摇，红细胞易悬浮，无微聚物呀异物。
B血型红细胞试剂试剂底部的红细胞应为鲜红色，上清液澄明，轻轻摇，红细胞易悬浮，无微聚物或异物。
O血型红细胞试剂试剂底部的红细胞应为鲜红色，上清液澄明，轻轻振摇，红细胞易悬浮，无微聚物或异物。
特异性抗原性检测亲和力材料(1)抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)(2)(2)按照2.2.7.1(2)项要求制成10％血型细胞悬液。
试验将约0.05ml抗A、抗B试剂置洁净瓷板或玻片上，加等体积相应10％血型红细胞悬液，立即混匀，面直径要求在10mm以上，滴水血型红细胞悬液即刻记录肉眼可见凝集时间及3分钟时凝集块的大小。
结果判定 在3分钟内凝集块必须达到1mm2以上，亲和力凝集时间应符合下表要求
本发明的试剂适用于试管法、微量板法(自动化血型定型系统)、凝胶卡检测血浆或血清中的ABO系统的抗体。
1、试管法本品与受检者血浆或血清按1∶1比例混合，摇匀。于900g离心15秒，或室温静置1小时。检查是否溶血，溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染。轻轻摇晃，观察凝集情况并立即记录结果。
2、微量板法向微量板中按照1∶1比例分别加入25-50ul与标记相应血型红细胞和被检者血清或血浆。用手轻轻扣拍或用微量板震荡仪来轻微并充分的混合孔中内容物，于700g离心30秒。检查是否溶血，溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染。用手轻轻扣拍或用微量板机械震荡仪悬浮红细胞扣，观察凝集情况并记录结果。
3、凝胶卡法向卡式定型的反定型管中加入待检试剂50ul(血型红细胞悬液浓度0.8％)。再加入受检者人血清或血浆25ul。卡式血型专用离心机中离心，肉眼或自动卡判读仪判读结果。
对试验结果的解释将已知的A1血型、B血型、O血型红细胞试剂与受检者的血浆或血清混合后，如下表所示与A1血型及O血型红细胞试剂不发生凝集而和B血型红细胞试剂发生凝集者即为A型血型与A1血型红细胞试剂发生凝集而和B血型及O血型红细胞试剂不凝集者即为B型血型；与A1血型及B血型红细胞试剂发生凝集而和O血型红细胞试剂不发生凝集者即为O型血型；与A1、B和O血型红细胞试剂均不发生凝集者即为AB型血型。
注“+”有凝集反应，“-”无凝集反应(该试验方法的局限性)本试验仅作为反定型检测ABO血型用。
本发明的试剂，经过临床实验，证明效果优良。
河北省血液中心和内蒙古自治区血液中心采用本发明的ABO血型反定型试剂(人血红细胞)，批号20050904、20050905、20050906，和比对试剂采用反定型试剂Reagent Red Blood Cells(Pooled Cells)，IMMUCOR.INC生产，批号42221，正定型试剂采用长春博德生物技术有限公司生产的抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)，批号20050303，平等检测6184例献血员(少数民族762名)符合率100％。
中国人民开装警察部队总医院采用本发明的ABO血型反定型试剂(人血红细胞)，批号20050904、20050905、20050906，和比对试剂采用反定型试剂Reagent Red Blood Cells(Pooled Cells)，IMMUCOR.INC生产，批号42221，正定型试剂采用长春博德生物技术有限公司生产的抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)，批号20050303，平行检测1680例住院病人，符合率100％。
中国人发武装警察部队总医院对武装警察健康体检人员采用本发明的ABO血型反定型试剂(人血红细胞)，批号20050904、20050905、20050906，比对试剂采用反定型试剂(IMMUCOR.INC生产的Reagent Red Blood Cells(PooledCells)，批号42221，正定型试剂采用长春博德生物技术有限公司生产的抗A、抗B血型定型试剂，批号20050303，平行检测，共检测1990例，符合率100％。
本发明的血型反定型试剂，分别被制备成A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂，装成每支10ml，其标签A1血型红细胞试剂为(蓝色)，B血型红细胞试剂为(黄色)，O血型红细胞试剂为(红色)，ABO血型反定型试剂(人血红细胞)。
本发明将A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂三种试剂合在一起包装，它们的标签分别为蓝色，黄色，红色，每一包装各1支，每支10ml，标签为ABO血型反定型试剂(人血红细胞)3×10ml，专供鉴定人ABO血型反定型用，该试剂经过药品监督部门批准使用，批准文号国药准字。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1保存液的配制枸橼酸三钠14.705克磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.408克磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.716克乙二胺四乙酸二钠 1.0克氯化钠(NaCl) 8.182克单水葡萄糖(Glucose) 19.810克腺嘌呤(Adenine)0.405克肌苷(Inosine) 2.682克氯霉素(Chloramphenicol)0.66克以上组分用蒸馏水定容至2升。
制备将上述组分混合用蒸馏水溶解并定容，使用不锈钢高压过滤器滤膜0.45μl，121℃下0.15Mpa高压蒸汽灭菌30分钟。
将经过准确鉴定了A血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了B血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了O血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
分别制成A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂三种试剂合在一起包装，每一包装中三种试剂各1支，每支10ml，标签A1血型红细胞试剂为(蓝色)，B血型红细胞试剂为(黄色)，O血型红细胞试剂为(红色)ABO血型反定型试剂(人血红细胞)3×10ml，专供鉴定人ABO血型反定型用，该试剂经过药品监督部门批准使用，批准文号国药准字。
实施例2保存液的配制枸橼酸三钠10克磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.3克磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.5克乙二胺四乙酸二钠 0.8克氯化钠(NaCl)6克单水葡萄糖(Glucose) 15克腺嘌呤(Adenine) 0.3克肌苷(Inosine) 2克氯霉素(Chloramphenicol) 0.5克以上组分用蒸馏水定容至2升。
制备将上述组分混合用蒸馏水溶解并定容，使用不锈钢高压过滤器滤膜0.45μl，121℃下0.15Mpa高压蒸汽灭菌30分钟。
将经过准确鉴定了A血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了B血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了O血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
分别制成A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂三种试剂合在一起包装，每一包装中三种试剂各1支，每支10ml，标签为ABO血型反定型试剂(人血红细胞)3×10ml，专供鉴定人ABO血型反定型用，该试剂经过药品监督部门批准使用，批准文号国药准字。
实施例3保存液的配制枸橼酸三钠20克磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.5克磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.9克乙二胺四乙酸二钠 1.2克氯化钠(NaCl)10克单水葡萄糖(Glucose) 25克腺嘌呤(Adenine) 0.5克肌苷(Inosine) 3克氯霉素(Chloramphenicol) 0.8克以上组分用蒸馏水定容至2升。
制备将上述组分混合用蒸馏水溶解并定容，使用不锈钢高压过滤器滤膜0.45μl，121℃下0.15Mpa高压蒸汽灭菌30分钟。
将经过准确鉴定了A血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了B血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
将经过准确鉴定了O血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，血型红细胞浓度为3％。
分别制成A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂三种试剂合在一起包装，每一包装中三种试剂各1支，每支10ml，标签A1血型红细胞试剂为(蓝色)，B血型红细胞试剂为(黄色)，O血型红细胞试剂为(红色)，ABO血型反定型试剂(人血红细胞)3×10ml，专供鉴定人ABO血型反定型用，该试剂可标准化大规模生产。可见本项目具有较大的社会效益。
该试剂经过药品监督部门批准使用，批准文号国药准字。
权利要求
1.一种ABO血型反定型试剂，其特征在于，该试剂由A、B、O血型的红细胞和细胞保存液混合配制而成。
2.权利要求1的反定型试剂，其中细胞保存液的配方组成如下枸橼酸三钠10-20克磷酸二氢钾0.3-0.5克磷酸氢二钠0.5-0.9克乙二胺四乙酸二钠 0.8-1.2克氯化钠6-10克单水葡萄糖15-25克腺嘌呤0.3-0.5克肌苷2-3克氯霉素0.5-0.8克以上组分用蒸馏水定容至2升。
3.权利要求1的反定型试剂，其特征在于，其中保存液的配方组成如下最优选的配方如下枸橼酸三钠14.705克磷酸二氢钾0.408克磷酸氢二钠0.716克乙二胺四乙酸二钠1.0克氯化钠8.182克单水葡萄糖19.810克腺嘌呤0.405克肌苷2.682克氯霉素0.66克以上组分用蒸馏水定容至2升。
4.权利要求1的反定型试剂，其特征在于，其中A、B、O血型的红细胞经过去脂、过滤、洗涤、过程得到。
5.权利要求1的反定型试剂，其特征在于，通过将经过准确鉴定了A、B、O血型的血型红细胞加入上述保存液中调配，使红细胞浓度为2-4％。
6.权利要求1的反定型试剂的制备方法，其特征在于，经过以下步骤(1)按比例配制红细胞保存液；(2)红细胞经过过滤和洗涤处理，去除其中已发生凝集的红细胞和蛋白成分；(3)用保存液调节红细胞的浓度。
7.权利要求6的制备方法，其特征在于，经过以下步骤对筛选得到的原料血型红细胞样本进行过滤，用滤器过滤或滤纸过滤，然后通过洗涤去除非细胞成分的血浆蛋白，包括血型抗体成分，同时进一步去除部分白细胞和血小板，防止其破裂后产生的细胞碎片及内容物对试剂产生不良影响，最后用经除菌过滤的保存液将压积红细胞配制成浓度为2-4％血型红细胞悬液。
8.权利要求6的制备方法，其特征在于，配制红细胞保存液经过将组分混合用蒸馏水溶解并定容，使用不锈钢高压过滤器滤膜0.45μl，121℃下0.15Mpa高压蒸汽灭菌30分钟的步骤。
9.含有权利要求1的反定型试剂的包装盒，其特征在于，该包装盒是将制成的A1血型红细胞试剂，B血型红细胞试剂，O血型红细胞试剂三种试剂合在一起包装，每一包装中三种试剂各1支，每支10ml，标签A1血型红细胞试剂为(蓝色)，B血型红细胞试剂为(黄色)，O血型红细胞试剂为(红色)，ABO血型反定型试剂3×10ml，专供鉴定人ABO血型反定型用。
10.权利要求1的反定型试剂的使用方法，其特征在于，该方法包括将已知的A1血型、B血型、O血型红细胞试剂与受检者的血浆或血清混合，其判断标准为1)与A1血型及O血型红细胞试剂不发生凝集而和B血型红细胞试剂发生凝集者即为A型血型；2)与A1血型红细胞试剂发生凝集而和B血型及O血型红细胞试剂不凝集者即为B型血型；3)与A1血型及B血型红细胞试剂发生凝集而和O血型红细胞试剂不发生凝集者即为O型血型；4)与A1、B和O血型红细胞试剂均不发生凝集者即为AB型血型。
全文摘要
本发明涉及一种ABO血型反定型试剂，本发明在阿氏液的基础上，分别改进其缓冲体系，即从单一的枸橼酸盐缓冲体系变为枸橼酸盐－磷酸盐双缓冲体系，可以更好的维持保存体系pH值的稳定；增加腺嘌呤为营养成分，使得红细胞在保存过程中含氧量高，保持鲜红的颜面色；防腐系统不采用任何化学防腐剂如叠氮钠、硫柳汞等成分，因为化学防腐剂会影响红细胞含氧量，导致红细胞颜面色变深发黑；此外添加EDTA二钠盐，来防止血型红细胞在补体诱导作用下产生溶血现象；本发明根据现有技术，做了大量的筛选，提供了新的保存液配方，特别是加入稳定剂EDTA二钠，采用单水葡萄糖，氯霉素，以及通过调整各组分的比例，使本发明优点更加突出。
文档编号G01N33/52GK1924583SQ20061010407
公开日2007年3月7日 申请日期2006年8月2日 优先权日2006年8月2日
发明者张志 , 曹健荣, 温重秋 申请人:北京金豪制药有限公司