专利名称：以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测被测样品中的抗双链DNA抗体的方法，尤其涉及一种 采用酶联免疫吸附法检测被测样品中的抗双链DNA抗体的方法。
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是临床上较为常见的一种自身免疫性疾病，患者突 出表现是存在多种自身抗体，其中最重要的是抗双链DNA抗体。这是一种能够 与天然DNA结合的自身抗体，几乎仅在SLE患者中可检测到该抗体。抗双链DNA 抗体滴度的消长与SLE患者的病情变化相关，随着疾病活动的控制，抗双链DNA 抗体的滴度可以下降或消失。早期的间接血凝、补体结合试验和对流免疫电泳等方法因灵敏度和特异性 差而被淘汰，现在应用较广泛的检测方法大致有如下几种免疫荧光法(IFT)、 免疫印迹法(Immunoblot assay)、放射免疫法(RIA)、斑点免疫金渗滤法(DIGFA)、 胶体金层析法和酶联免疫吸附法(ELISA)。免疫荧光法(IFA)是将已稀释血清与实验基质进行温育，令特异性抗体与 实验基质中相应抗原结合，然后再与荧光标记的第二抗体温育，最后在荧光显 微镜下观察相应部位的特异性荧光模式。IFA法只能作为临床诊断的参考，不能 作为确诊的重要依据。另外这种方法还需要一台质量较好的荧光显微镜，对操 作人员要较高，操作复杂耗时长且存在其他干扰物质，易出现假阳性。免疫印迹法(I腿unoblot assay)是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白及多 肽与免疫反应的高特异性相结合的一项技术，但其制备方法繁琐、成本相对较 高。放射免疫法(RIA)是以同位素标记的双链DNA与检测样品中的抗双链DNA 抗体结合，易产生放射性污染，且有其他干扰物质易产生假阳性；检测需要特 殊的仪器设备，检测时间长；不能实现单项检测。 胶体金免疫层析法是将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材 料等组合在一起制备为免疫层析诊断试纸条。该方法只能进行定性检测。酶联免疫吸附法(ELISA)是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化 作用相结合发展建立的一种非放射性标记免疫分析方法。该法是将纯化的DNA 抗原包被在固相载体上，与一定稀释度的待测血清反应，然后与HRP标记的二 抗(抗人IgG， IgA, IgM或抗人IgG.A.M的混合物)反应，HRP可于显色液发生 显色反应，在酶标仪上采用双波段(450nm、 630nm)测定其吸光度。由于ELISA 具有灵敏度高、特异性强、酶免疫试剂的性质比较稳定，操作方法简便快速、 无放射性污染以及应用范围广等很多优点，是目前应用最为广泛的一项免疫学 实验。由于纯化的或重组的抗原生产技术的成熟，商品化用于抗双链DNA抗体 检测的高质量ELISA试剂盒已日渐增多。由于该检测方法的灵敏度高、特异性 强、可量化且排除了人为的主观判断，费用低廉，是目前国外大多数自身免疫 诊断检测实验室的首选检测方法。但是国外一些公司生产的试剂盒价格昂贵， 无法推广和大量使用。目前国内还没有自行生产的应用间接ELISA法检测抗双 链DNA抗体的试剂盒面市。目前，现有的检测抗双链DNA抗体的方法存在以下不足1、 检测步骤繁琐，检测时间长，如RIA法及IFA法。2、 检测试剂需要冷藏，如RIA法、IFA法、免疫印迹法和斑点免疫金渗滤法。3、 检测需要特殊的仪器设备，如IFA法需荧光电镜检测，RIA法需Y-计数 仪或Y-闪烁计数仪检测。4、 检测时存在放射性污染，如RIA法。5、 只能进行定性而不能进行定量检测，如胶体金免疫层析法，RIA法、IFA 法和斑点免疫金滤法。6、 检测方法本身存在很强的主观性，如IFA法、胶体金免疫层析法均需人 工读图，存在很强的主观判断因素。7、 目前国内大多数实验室对抗双链DNA抗体的传统ELISA检测方法还处于 定性阶段。虽然抗双链DNA抗体的传统ELISA检测方法快速简便，较为准确， 但是作为临床诊断还存在不足的方面，如检出的灵敏度差。因为传统ELISA法
的载体为聚苯乙烯板，反应只在微孔表面进行，从而限制了该方法的检测灵敏度。故目前国内主要采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤法定性的检测抗双链DNA抗体。组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组 成己经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但其应 用中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到抗双链DNA抗体检测方 面的内容。发明内容本发明目的是提供一种检测抗双链DNA抗体的方法，其解决了现有检测抗 双链DNA抗体的灵敏度差的缺点。 本发明的技术解决方案是一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方法，包括以下步骤l]DNA在金磁微粒表面的固定取金磁微粒加入离心管中，磁性分离弃上清 后，用偶联缓冲液洗涤金磁微粒，磁性分离弃上清后加入纯化的天然双链DNA 或者质粒DNA及偶联缓冲液于金磁微粒中，在20 40。C条件下充分反应20 40min，形成金磁微粒-DNA复合物；或者将全血、唾液、精液或质粒制成溶液体 系，用金磁微粒从中提取DNA并使其固定在金磁微粒表面；2]金磁微粒的封闭将金磁微粒磁性分离弃上清后，加入封闭剂于离心管 中，在20 40。C条件下充分反应1 2h，取出，4""C过夜；3]金磁微粒的清洗用清洗缓冲液清洗封闭后的金磁微粒；4]金磁微粒的保存将清洗完毕的金磁微粒加入保存缓冲液，4'C保存，备用；5]抗双链DNA抗体的检测以清洗后的金磁微粒表面的DNA为抗原，运用 间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测抗双链DNA抗体。上述加入的金磁微粒质量为0. 5 5mg;上述加入的DNA质量为5 25 u g。 上述偶联缓冲液为0. 5X 10X的pH=5. 0 8.0的PBS，或者5mM 10M的 pH二9. 0 11. 0的CBS，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的Tris-HCl缓冲液，或 者5mM 10M的pH=3. 6 5. 6的醋酸盐缓冲液，或者5mM 10M的pH=3. 0 7. 0
的柠檬酸盐缓冲液，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的TBS缓冲液，或者为10 25之间的聚乙二醇(PEG) 6000 10000加入0. 5 5. OM的盐，所述盐可以是氯 化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯等；所述封闭剂为 无关蛋白和上述偶联缓冲液的混合溶液，所述无关蛋白为1% 10%的牛血清白蛋 白、1% 10%赖氨酸、1% 10%脱脂奶粉、1% 10%乙醇胺或1% 10%动物血清中 的一种或多种；所述清洗缓冲液为偶联缓冲液或者含有0. 02% 0. 2%吐温的偶联 缓冲液；所述保存缓冲液为偶联缓冲液或者加入防腐剂和保护剂的偶联缓冲液， 所述防腐剂为0. 01% 0. 1%的叠氮纳或者0. 01% 0. 1%的硫柳汞，所述保护剂为 0. 05% 1%的BSA、 0. 05% 1%的动物血清或者0. 05% 1%的蛋白酶抑制剂。上述偶联缓冲液优选10%的PEG 8000和2. 5 M的氯化钠的混合溶液；封闭 剂优选0. 1M的pH=7. 0的PBS缓冲液、2%的BSA、 5%的小牛血清的混合溶液；清 洗缓冲液优选0. 1M的pH=7. 0的PBS缓冲液、0. 5%的吐温-20的混合溶液；保存 缓冲液优选0. 1M的pH=7. 0的PBS缓冲液。上述抗双链DNA抗体的检测可运用间接ELISA法，包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2孔，阳性对 照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照l孔；2]加抗原每孔各加入30" L的已固定DNA的金磁微粒；3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50uL，阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100"L摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;5]洗涤:磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加酶分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检样品试管孔中各 加入50 100 ii L酶标的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉-,9]显色反应每个试管孔各加显色液A、 B各50 100uL，轻摇混匀后置生 化培养箱中显色5 15min;IO]结果判定每个试管孔各加终止液100 200uL，轻摇混匀，磁性分离 2分钟后，从每个试管孔中各取100uL上清液转移至酶标条中，在酶标仪上采 用450nm和630nm双波段测定各试管孔0D值。上述抗双链DNA抗体的检测还可采用免疫荧光法，包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2孔，阳性对 照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的己固定DNA的金磁微粒；3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50uL，阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100pL摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;5]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加荧光标记的抗人IgG:分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检 样品试管孔中各加入50 100 u L FITC标记的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤:磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST, 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉；9]结果判定将获得的特异免疫荧光复合物置于显微镜下观察判定结果。上述抗双链DNA抗体的检测还可釆用化学发光法，包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2孔，阳性对 照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照1孑L;2]加抗原每孔各加入30ii L的己固定DNA的金磁微粒； 3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50uL、阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100uL摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;5]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 y L 0. OIM PBST, 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加酶分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检样品试管孔中各 加入50 100 u L HRP标记的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤:磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 " L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉；9]显色反应将金磁微粒从试管内转入酶标孔中，每个酶标孔各加入发光 物质100 200u L;10]结果判定将酶标孔置于化学发光检测仪中测样品、阳性对照、阴性对照及空白孔的信号值。与现有的抗双链DNA抗体检测方法相比较，本发明具有的优点是1、 包被效率高。本发明在金磁微粒表面包被天然DNA或质粒DNA或运用金 磁微粒从人全血、唾液、精液或质粒中提取DNA作为抗原。因金磁微粒具有较 大的比表面积，因此具有更大的固定容量，单位质量的金磁微粒能够包被较大 量的DNA。比如对抗体的包被，lmg的金磁微粒能够固定0.3mg以上的抗体。由 于此种金磁微粒对生物分子的固定化容量的强大，可高效率的吸附溶液中的DNA 抗原。2、 检测的灵敏度和特异性高。本发明以金磁微粒作为检测抗双链DNA抗体 的载体基质。金磁微粒兼具超顺磁性，磁粒在磁场的作用下易于分离和金、银 表面极易与巯基化生物活性物质结合而易被修饰的优点使得该磁粒具有极强的 对外加磁场的响应性和较大的对生物活性分子的固定容量，且整个检测过程中 金磁微粒悬浮于液相中，其较大的比表面积使得在实验过程中可最大限度的检 测到抗双链DNA抗体。而传统ELISA法的载体为聚苯乙烯板，反应只在微孔表 面进行，从而降低了该方法的检测灵敏度。本发明方法的整个检测过程在液相 中进行，金磁微粒整个球面上的DNA抗原均参与反应，因此与传统方法相比， 本方法的灵敏度和特异性均有很大提高。3、 可量化且排除了人为的主观判断。根据酶标仪的检测结果及临界值的比 较，依据具体数据判断检测结果的阴性或阳性而排除了现在国内医院常用的胶 体金免疫层析法、间接免疫荧光法、免疫印迹法等根据肉眼观察试验结果的人 为主观判断。4、 酶免疫试剂的性质比较稳定。免疫荧光法(IFA)是将已稀释血清与实 验基质进行温育，令特异性抗体与实验基质中相应抗原结合，然后再与荧光标 记的第二抗体温育，最后在荧光显微镜下观察相应部位的特异性荧光模式。其 中实验基质现在较常用的是H印-2细胞，无法长期保存。放射免疫法(RIA)是 以同位素标记的双链DNA与检测样品中的抗双链DNA抗体结合，因同位素的具 半衰期，所以该试剂无法长期保存。5、 对被检测样品的影响小。本发明方法所用的各种缓冲液的pH值接近中 性，与传统的ELISA检测方法所用的碱性缓冲液相比，对被测样品的影响减小。
图1是金磁微粒吸附DNA前后溶液的对比UV图；其中虚线表示包被前DNA 紫外测定结果，实线表示包被后DNA紫外测定结果。图2是金磁微粒为载体运用间接ELISA法检测含有抗双链DNA抗体的血液 样品与阴性对照和空白0D值的比较。
具体实施方式
实施例1、在金磁微粒表面包被双链DNA检测抗双链DNA抗体 l]双链DNA固定在金磁微粒表面及金磁微粒的封闭和保存取lmg的金磁 微粒于2mL离心管中，磁性分离，弃上清。用偶联缓冲液(20%的PEG 8000和 2. 5 M的氯化钠的混合溶液)洗涤金磁微粒直至金磁微粒的保存环境达到偶联缓 冲液的pH或盐浓度，每次偶联缓冲液洗漆用量为400 "L。磁性分离弃上清后 加入14 u g的双链DNA及200 u L上述偶联缓冲液于金磁微粒中，37°C, 180rpm 反应30min。磁性分离弃上清后，加入lmL的封闭剂(0. 01M的pH=7. 4的PBS 缓冲液和10%的小牛血清的混合溶液)于离心管中，37-C，180rpm反应lh，取出， 4'C过夜后用lmL的清洗缓冲液(0. 01M的pH=7. 4的PBS缓冲液、0. 05%的吐温-20的混合溶液)清洗封闭的金磁微粒。清洗完毕后，加入lmL的保存缓冲液 (0.01M的p^7.4的PBS缓冲液)保存包被完毕的金磁微粒，4"C保存，备用。2]抗双链DNA抗体的检测:分别取30 ii L已包被的金磁微粒放入试管孔，摇 匀；分别取50uL的待检样品放入待检样品试管孔，摇匀；在阳性对照试管孔 中加入50uL阳性对照血清，摇匀；在阴性对照试管孔中加入50uL阴性对照 血清，摇匀；空白孔暂不加任何液体；37°C， 180rpm反应30min后取出，磁性 分离2min，弃上清后，每支试管中各加入500uL 0.01M PBST,充分摇匀，磁性 分离2min，弃上清。重复此步骤4遍后，分别在阳性对照试管孔、阴性对照试 管孔和待检样品试管孔中各加入50uL酶标的抗人IgG; 37°C，180rpm反应 30min后取出，磁性分离2min，弃上清，在每支试管孔中各加入500y L 0. 01M PBST，充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤4遍直至不参与抗体反 应的抗人IgG都洗掉；每支试管孔中各加入50 u L显色液A和50 u L显色液B， 轻摇混匀后置生化培养箱中37"C显色5min，每试管孔各加2M H2S(^ 100 u L，轻 摇混匀，磁性分离2分钟后，从试管中各取100uL上清液转移至酶标条中，在 酶标仪上采用双波段(450nm、 630nm)测定各管OD值。检测完毕后，运用洗脱 缓冲液(1X的pH-7.2的TE缓冲液)洗脱包被在金磁微粒表面的DNA，并在金 磁微粒加入保存缓冲液(0.01M的pH二7.4的PBS缓冲液)中保存。由图1可看出，应用金磁微粒在适当的溶液体系中可以从全血、唾液、精 液、组织等样品中纯化DNA并且吸附在金磁微粒表面作为包被抗原使用时，金 磁微粒吸附DNA前后溶液的存在很明显的对比UV图，说明金磁微粒可以从全血、 唾液、精液、组织等样品中大量的纯化DNA。由图2可看出，应用本发明测定的 阳性血样与阴性血样及空白的检测结果之间存在明显的差别。金磁微粒表面包被的经纯化的天然双链DNA或质粒DNA抗原为自行制备或 购自商品化的产品，实验过程中所用二抗为商品化产品。本发明原理1.抗双链DNA抗体是一种能够与天然DNA结合的自身抗体，几乎仅在SLE 患者中可检测到该抗体(Ruffatti A， Calligaro A， Ross D et al. Anti-double stranded DNA antibodies in the healthy elderly: prevalence and characteristics. J Clin Immunol. 1990; 10:300—303; Kadlubowski M， Jackson M, Yap PL and Neil G. Lack of specificity for antibodies to double stranded DNA found in four commercial kits. J Clin Path. 1991; 44: 248-250)。 抗双链DNA抗体滴度的消长与SLE患者的病情变化相关(BorgEJ, Horst G, Hum EJ et al. Measurement of increases in anti-double stranded DNA antibody level as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus: a long term, prospective study. Arth Rhe亂 1990; 33:634-643)，本发明所述的以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方法，是 在金磁微粒表面包被上天然双链DNA或质粒DNA抗原后应用ELISA方法、化学 发光法或免疫荧光法检测待测血清，或者运用金磁微粒从人全血、唾液、精液 或质粒中提取DNA，然后在体系中加入被检血清直接检测。中国发明专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别对组装型磁性复合微 粒和核/壳结构的Fe304/Au超顺磁性复合微粒进行了公开。以下把这两种磁性微 粒称为金磁微粒。金磁微粒由具有超顺磁性的核心部分和外层部分构成，核心 部分由Fe304、 Y_Fe203、 Fe、 Co、 Ni或Fe与其它金属元素形成具有超顺磁性 的正铁酸盐磁性微粒构成，外壳部分由纳米级贵金属颗粒或单质金、银壳层构 成，平均直径为0.05 100 um。由于金、银等金属单质可以高效吸附蛋白、核 酸等物质的性质，故可把天然双链DNA或质粒DNA包被在金磁微粒表面且运用 金磁微粒可从血液、精液、唾液、微生物及动物组织等中高效提取双链DNA。此 时DNA包被在金磁微粒表面可作为间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检 测抗双链DNA抗体的抗原。2、 加入待检血液样品，通过37。C温育，若样品中含有抗双链DNA抗体(一 抗)，抗原抗体之间可发生特异性结合，血液样品中的抗体通过抗原也连接在了 金磁微粒表面，而未发生抗原抗体特异性反应的其他蛋白和杂质可通过洗涤过 程去除。3、 加入酶(HRP)标记或荧光标记的抗人IgG (二抗)，通过37。C温育，一 抗和二抗发生特异性结合从而使二抗也连接在了金磁微粒表面，通过洗涤过程 去除未参与反应的二抗。4、 加入显色液或发光物质后，HRP催化显色液中的过氧化物(本实验所用 的过氧化物为四甲基联苯胺)或发光物质催化HRP发生反应产生有色的产物， 在450nm处测间接ELISA法中的最高吸收峰或在化学发光检测仪上检测化学发 光法中的信号值。所测的OD值或信号值越大，表明金磁微粒上连有的HRP标记 的二抗越多，从而表明了血液样品中含有的一抗越多，也就表明了患者病情越 严重。免疫荧光法中在显微镜下观察判定结果。5、选用纯化的天然双链DNA或者质粒DNA的原则目前认为双链DNA的包被和与抗ds-DNA抗体的结合与双链DNA的空间构象发生重排有关，尤其与双链 DNA分子的完整与否关系很大，再者双链DM分子量越大结合力越强。有报道大 于60pb的DNA才能与DNA抗体牢固结合，而与种属来源无关。金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包 覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性 纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复 合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe:A、 Y- FeA等铁的氧化物粒子，单质Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚 集体是指经修饰后形成的Fe:,O,、 Y- Fe必,等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后 形成的单质Fe、 Co、 Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形 成的正铁酸盐粒子聚集体。
权利要求
1、一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤1]DNA在金磁微粒表面的固定取金磁微粒加入离心管中，磁性分离弃上清后，用偶联缓冲液洗涤金磁微粒，磁性分离弃上清后加入纯化的天然双链DNA或者质粒DNA及偶联缓冲液于金磁微粒中，在20～40℃条件下充分反应20～40min，形成金磁微粒-DNA复合物；或者将全血、唾液、精液或质粒制成溶液体系，用金磁微粒从中提取DNA并使其固定在金磁微粒表面；2]金磁微粒的封闭将金磁微粒磁性分离弃上清后，加入封闭剂于离心管中，在20～40℃条件下充分反应1～2h，取出，4℃过夜；3]金磁微粒的清洗用清洗缓冲液清洗封闭后的金磁微粒；4]金磁微粒的保存将清洗完毕的金磁微粒加入保存缓冲液，4℃保存，备用；5]抗双链DNA抗体的检测以清洗后的金磁微粒表面的DNA为抗原，运用间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测抗双链DNA抗体。
2、 根据权利要求1所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方 法，其特征在于所述加入的金磁微粒质量为0. 5 5mg;所述加入的DNA质量 为5 25 p g。
3、 根据权利要求1或2所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体 的方法，其特征在于所述偶联缓冲液为0.5X 10X的pH二5.0 8.0的PBS， 或者5raM 10M的pH二9. 0 11.0的CBS，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的 Tris-HC1缓冲液，或者5mM 10M的p^3.6 5.6的醋酸盐缓冲液，或者5mM 10M的pH二3. 0 7. 0的柠檬酸盐缓冲液，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的TBS 缓冲液，或者为10 25之间的聚乙二醇(PEG) 6000 10000加入0. 5 5.0M的 盐，所述盐可以是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化 铯等；所述封闭剂为无关蛋白和上述偶联缓冲液的混合溶液，所述无关蛋白为 1% 10%的牛血清白蛋白、1% 10%赖氨酸、1% 10%脱脂奶粉、1% 10%乙醇胺 或1% 10%动物血清中的一种或多种；所述清洗缓冲液为偶联缓冲液或者含有0. 02% 0. 2%吐温的偶联缓冲液；所述保存缓冲液为偶联缓冲液或者加入防腐剂 和保护剂的偶联缓冲液，所述防腐剂为0. 01% 0. 1%的叠氮纳或者0. 01% 0. 1% 的硫柳汞，所述保护剂为0.059& iy。的BSA、 0.05% 1%的动物血清或者0.05% 1%的蛋白酶抑制剂。
4、 根据权利要求3所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方 法，其特征在于所述偶联缓冲液为10%的PEG 8000和2. 5 M的氯化钠的混合 溶液；所述封闭剂为0. 1M的pH=7. 0的PBS缓冲液、2%的BSA、 5%的小牛血清的 混合溶液；所述清洗缓冲液为0. 1M的pH二7. 0的PBS缓冲液、0. 5%的吐温-20的 混合溶液；所述保存缓冲液为0. 1M的pH二7. 0的PBS缓冲液。
5、 根据权利要求1所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方 法，其特征在于所述抗双链DNA抗体的检测包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2孔，阳性对 照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的已固定DNA的金磁微粒；3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50uL，阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100uL摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;5]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 " L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加酶分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检样品试管孔中各 加入50 100 u L酶标的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉；9]显色反应每个试管孔各加显色液A、 B各50 100uL，轻摇混匀后置生 化培养箱中显色5 15min;IO]结果判定每个试管孔各加终止液100 200uL,轻摇混匀，磁性分离 2分钟后，从每个试管孔中各取100uL上清液转移至酶标条中，在酶标仪上采 用450nm和630nm双波段测定各试管孔OD值。
6、 根据权利要求1所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方 法，其特征在于所述抗双链DNA抗体的检测包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2 L，阳性对照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照l孔；2]加抗原每孔各加入30y L的已固定DNA的金磁微粒；3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50uL，阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100yL摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;5]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加荧光标记的抗人IgG:分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检 样品试管孔中各加入50 100u L FITC标记的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 U L 0. 01M PBST, 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉；9]结果判定将获得的特异免疫荧光复合物置于显微镜下观察判定结果。
7、 根据权利要求1所述的一种以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方 法，其特征在于所述抗双链DNA抗体的检测包括以下步骤l]编号将试管置于磁性分离器上，分别设待检样品试管孔2孔，阳性对 照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的已固定DNA的金磁微粒； 3]加样分别在待检样品试管孔中加入待测样品50ixL、阳性对照孔、阴性 对照孔各加入阴、阳对照50 100uL摇匀；4]温育覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min; 5]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗原抗体反应的物 质都洗掉；6]加酶分别在阳性对照试管孔、阴性对照试管孔和待检样品试管孔中各 加入50 100uL HRP标记的抗人IgG;7]抗体反应覆盖所有的试管孔，放入生化培养箱中反应至少15min;8]洗涤磁性分离2min，弃上清，在每支试管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分摇匀，磁性分离2min，弃上清；重复此步骤直至不参与抗体反应的抗人IgG 都洗掉；9]显色反应将金磁微粒从试管内转入酶标孔中，每个酶标孔各加入发光 物质100 200uL;10]结果判定将酶标孔置于化学发光检测仪中测样品、阳性对照、阴性对 照及空白孔的信号值。
全文摘要
本发明涉及一种以金磁微粒为载体，运用间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测抗双链DNA抗体的方法。本方法包括以下步骤(1)将金磁微粒与双链DNA相混合，在一定条件下双链DNA固定在金磁微粒表面或运用金磁微粒从人全血、唾液、精液或质粒中提取DNA并固定在金磁微粒表面；其中金磁微粒由具有超顺磁性的核心部分和组装层部分构成，核心部分为磁性微粒，组装层部分为纳米级贵金属颗粒；(2)运用间接ELISA法、免疫荧光法或化学发光法检测待测样品中存在的抗双链DNA抗体。本发明检测方法具有高度特异性、灵敏度高、费用低廉、操作简便快速、以及应用范围广等优点。
文档编号G01N33/551GK101165491SQ200610104758
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者崔亚丽, 芳 李, 超 陈 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司