专利名称：阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，属医药技术领域。
背景技术：
阿仑膦酸钠(Alendronate Sodium)属于第三代二膦酸盐类骨吸收抑制剂，具有良好的防治骨质疏松作用，不良反应少，作用持久，易于推广应用等突出优点。
鉴于阿仑膦酸钠具有上述诸多突出优点，所以临床开发成为热门，评价阿仑膦酸钠不同制剂的生物等效性对于阿仑膦酸钠的新药开发和新药评价非常重要。目前，在生物等效性研究领域中，普遍采用体内药代动力学方法评价，测定血药浓度再进行双处理、两周期随机交叉实验设计的方法，即以药时曲线下面积(auc)、峰浓度(cmax)和达峰时间(tmax)为参数，通过多因素方差分析、双单侧t-检验和计算90％可信区间来评价药物的生物等效性。但由于口服阿仑膦酸钠后血浆浓度极低，不适合进行体内药代动力学评价，上述方法在评价阿仑膦酸钠不同制剂的生物等效性时无法应用。目前阿仑膦酸钠的各种剂型的开发和疗效评价处于一种无规则状态，或者完全按新药做全面的临床，无谓增加了研发时间和成本的投入；或者就干脆全免，不对其进行评价，这样给患者用药带来了隐患，上述情况成为目前阿仑膦酸钠各种新剂型、规格在开发和评价中存在的制约因素。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术之缺陷提供一种评价阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法。
实现本发明目的的技术方案本发明的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法主要包括以下步骤(1)采集尿样；(2)尿样预处理；(3)尿样衍生化；(4)尿样测定。
上述采集尿样的步骤是对服用定量受试制剂与或参比制剂的受试者，按如下时间间隔进行取样的服药前的1.5-1小时、服药后的0-0.25、0.25-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12、12-24、24-36小时；其中每次取尿样量为1-10ml。
上述采集尿样的步骤是按如下方法进行取样的在服药前的1.5-1小时，取尿样10ml为空白；在服药后的0.25小时，取尿样10ml；在服药后的1小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的2小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的3小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的4小时，补水150mL，低脂、低钙标准餐，取尿样10ml；在服药后的6小时，取尿样10ml；在服药后的8小时，取尿样10ml；在服药后的12小时，取尿样10ml；在服药后的24小时，取尿样10ml；在服药后的36小时，取尿样10ml。
上述采集尿样的步骤中，受试者禁食过夜，服用定量受试制剂或参比制剂，300mL温水送服，保持站立30分钟，且服药后15分钟禁尿上述尿样预处理的步骤按下述步骤操作①向尿样中加入缓冲液强力振摇；②再加入CaCl2溶液强力振摇；③再加入NaOH试液强力振摇，置于离心机上离心分离，得到沉淀物；④向步骤③得到的沉淀物中加入醋酸试液，振荡；⑤再加入水，振摇；⑥再加入NaOH溶液，振摇，置于离心机上离心分离，得到沉淀物；⑦向步骤⑥得到的沉淀物中加入醋酸试液，振荡；⑧再加入钙离子鳌合剂，振荡；⑨再加入柠檬酸盐，振荡，得到尿样预处理的终溶液；上述步骤①中的缓冲液为KH2PO4缓冲液或NaH2PO4缓冲液；上述步骤⑧中的钙离子鳌合剂为EGTA柠檬酸钠或EDTA柠檬酸钠。
上述的尿样预处理步骤的步骤①中所加入的缓冲液为KH2PO4，所加入缓冲液的浓度为0.1M、体积为200μL；尿样预处理步骤的步骤②中所加入的CaCl2溶液的浓度为0.1M、体积为200μL；尿样预处理步骤的步骤③中所加入的NaOH试液的浓度为1M、体积为400μL，置于离心机上分离时，离心机的转速为每分钟4000转，离心时间为10分钟，有乳白色沉淀产生，分离时将离心管轻轻倾斜，以防止因振荡而使离心沉淀物的损失、擦去离心管口余液；尿样预处理步骤的步骤④中所加入的醋酸试液的浓度为2M、体积为400μL，加液时用力将沉淀冲起使之易于溶解，然后在涡旋振荡器上振荡一分钟；尿样预处理步骤的步骤⑤中所加入的水为10mL；尿样预处理步骤的步骤⑥中所加入的NaOH溶液的浓度为1M、体积为2mL，离心时，离心机的转速为每分钟4000转，离心时间为10分钟，有乳白色沉淀产生，分离时将离心管轻轻倾斜，以防止因振荡而使离心沉淀物的损失、擦去离心管口余液；尿样预处理步骤的步骤⑦中所加入的醋酸试液的浓度为2M、体积为400μL，振荡器为涡旋振荡器，振荡时间为一分钟；尿样预处理步骤的步骤⑧中所加入的EDTA柠檬酸钠的浓度为0.2M、体积为600μL，振荡方式为涡旋振荡；尿样预处理步骤的步骤⑨中所加入的柠檬酸钠的浓度为2M、体积为100μL，振荡方式为涡旋振荡。
上述尿样衍生化步骤要随时测定随时衍生化，尿样衍生化步骤是按如下步骤操作①向尿样预处理的终溶液中加入碳酸钠溶液，调节PH值9-10，振荡；②再加衍生化试剂，涡旋振荡后于黑暗处放置10-60分钟；③再加入柠檬酸试剂，涡旋振荡，在酸环境下终止反应；④再加入二氯甲烷，振摇，置于离心机上离心，去除衍生化试剂，分层而得到上清液；上述步骤②中所加入的衍生化试剂为FMOC-Cl或FMOC-NH2。
上述尿样衍生化步骤中的步骤①中所取的尿样预处理终溶液为500ul，所加入的碳酸钠溶液的浓度为2M，振荡方式为涡旋振荡，振荡时间为两分钟；尿样衍生化步骤中的步骤②中所加入的衍生化试剂的浓度为100mg/mL、体积为20μL，涡旋振荡后的放置时间为30分钟；尿样衍生化步骤中的步骤⑧中所加入的柠檬酸试剂的浓度为2M、体积为50μL，涡旋振荡的时间为1分钟，酸环境由调节pH值得到；尿样衍生化步骤中的步骤④中所加入的二氯甲烷为5mL，离心时，离心机的转速为每分钟2000转，离心时间为5分钟(5)取上清液100μL进样，进行检测。
上述尿样测定步骤的测定条件是色谱条件Waters公司515泵，Shimazu型荧光检测器；色谱柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流动相(缓冲液25mM柠檬酸+25mM焦磷酸钠)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱温40℃；流速1.0mL/min；激发波长260nm；发射波长310nm。
由于口服阿仑膦酸钠制剂后血药浓度极低，不适合进行体内药代动力学评价。本发明提供一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，该方法以服药36小时内阿仑膦酸钠经尿排泄量作为合理的研究参数，可以弥补阿仑膦酸钠血药浓度低不适于做生物等效性评价的缺陷。分别给受试者服用受试制剂和参比制剂后，以本发明提供的一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法测得尿样的Ae0-36和Rmax作为基础药代动力学参数，计算Ae0-36和Rmax的个体内比率(受试制剂/参比制剂)90％的置信区间，再将此区间与相应的生物等效性研究可接受范围(80％-125％)相比，判断是否具有生物等效性。
对本发明所述的一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法进行了如下评价(1)对照溶液线性(溶液+Alendronate对照品溶液)
1、加入30000ng/mL(30μg/mL)alendronate stock体积μL2、加入0.2M柠檬酸钠体积μL3、衍生化之前浓度ng/mL4、衍生阶段稀释倍数5、alendronatse终浓度ng/mL(2)尿样线性(尿样+Alendronate对照品溶液)
1、加入Alendronate stock solution in 0.2M柠檬酸钠体积μL2、Alendronate尿药浓度ng/mL3、加入0.2M柠檬酸钠体积μL4、最终用2M HAc溶解体积μL5、加入0.2M EDTA-柠檬酸钠体积μL6、加入2M柠檬酸钠体积μL7、大约的终体积μL乙酸溶后体积约为650μL8、衍生化阶段加入溶液总体积μL；9、终浓度ng/mL(大约)；500mL到760mL；(2025mL，上样溶液较尿液浓缩倍数4.9876)加入Na2CO3后，测pH值，9到10之间。
将上述对照溶液、尿样进行浓度测定，进而绘制标准曲线。图1为对照溶液的标准曲线，线性关系为y＝9.609644x-84.507904，相关系数R2＝0.999699；图2为尿样的标准曲线，线性关系为y＝48.405341x+169.114480，相关系数R2＝0.999408。
通过对比可以得出以下结论本发明所述一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法其中阿仑膦酸钠尿样浓度的测定方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、专一、可靠，能够进一步进行阿仑膦酸钠不同制剂生物等效性的评价。
图1为对照溶液的标准曲线图2为尿样的标准曲线具体实施方式
选取受试者1对分成A、B两组，禁食过夜，受试者A组服用“固邦”(受试制剂，石药集团欧意药业生产，规格10mg/片)10mg×4片；受试者B组服用“福善美”(参比制剂，默沙东公司生产，规格10mg/片)10mg×4片；分别以300mL温水送服，保持站立30分钟，直至服药后15分钟禁尿，服药36小时内按以下步骤操作取尿样
各时间段所取尿样做如下处理
(1)尿样预处理
(2)随测随衍生化
在色谱条件Waters公司515泵，Shimazu型荧光检测器；色谱柱Kromasil C184.6×150cm 5μM反向柱；流动相缓冲液(25mM柠檬酸+25mM焦磷酸钠)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱温40℃；流速1.0mL/min；激发波长260nm；发射波长310nm条件下进行检测，并选取A、B组具有代表性数据各一组如下一、A组受试制剂结果
二、B组参比制剂结果
通过对药物动力学参数进行统计分析，受试制剂和参比制剂平均Ae0-36分别为96.23±60.81μg和102.88±57.52μg；平均Rmax分别为35.36±22.88μg/h和36.15±21.07μg/h；而Tmax分别为0.583±0.858h和0.529±0.856h。两种药物制剂的药代动力学参数未发现显著差异。基础参数Ae0-36和Rmax的个体内比率的90％置信区间分别为0.96-1.11和1.01-1.17，在生物等效性试验可接受范围内。因此可以得出结论受试制剂与参比制剂具有生物等效性。
权利要求
1.一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于主要包括以下步骤(1)采集尿样；(2)尿样预处理；(3)尿样衍生化；(4)尿样测定。
2.根据权利要求1所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于采集尿样的步骤是对服用定量受试制剂或参比制剂的受试者，按如下时间间隔进行取样的服药前的1.5-1小时、服药后的0-0.25、0.25-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12、12-24、24-36小时；其中每次取尿样量为1-10ml。
3.根据权利要求2所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于采集尿样的步骤是按如下方法进行取样的在服药前的1.5-1小时，取尿样10ml为空白；在服药后的0.25小时，取尿样10ml；在服药后的1小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的2小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的3小时，补水150ml，取尿样10ml；在服药后的4小时，补水150mL，低脂、低钙标准餐，取尿样10ml；在服药后的6小时，取尿样10ml；在服药后的8小时，取尿样10ml；在服药后的12小时，取尿样10ml；在服药后的24小时，取尿样10ml；在服药后的36小时，取尿样10ml。
4.根据权利要求3所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于采集尿样的步骤中，受试者禁食过夜，服用定量受试制剂或参比制剂，300mL温水送服，保持站立30分钟，且服药后15分钟禁尿。
5.根据权利要求1至4之一所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于尿样预处理的步骤按下述步骤操作①向尿样中加入缓冲液强力振摇；②再加入CaCl2溶液强力振摇；③再加入NaOH试液强力振摇，置于离心机上离心分离，得到沉淀物；④向步骤③得到的沉淀物中加入醋酸试液，振荡；⑤再加入水，振摇；⑥再加入NaOH溶液，振摇，置于离心机上离心分离，得到沉淀物；⑦向步骤⑥得到的沉淀物中加入醋酸试液，振荡；⑧再加入钙离子鳌合剂，振荡；⑨再加入柠檬酸盐，振荡，得到尿样预处理的终溶液；上述步骤①中的缓冲液为KH2PO4缓冲液或NaH2PO4缓冲液；上述步骤⑧中的钙离子鳌合剂为EGTA柠檬酸钠或EDTA柠檬酸钠。
6.根据权利要求5所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于所述的尿样预处理步骤的步骤①中所加入的缓冲液为KH2PO4，所加入缓冲液的浓度为0.1M、体积为200μL；尿样预处理步骤的步骤②中所加入的CaCl2溶液的浓度为0.1M、体积为200μL；尿样预处理步骤的步骤③中所加入的NaOH试液的浓度为1M、体积为400μL，置于离心机上分离时，离心机的转速为每分钟4000转，离心时间为10分钟，有乳白色沉淀产生，分离时将离心管轻轻倾斜，以防止因振荡而使离心沉淀物的损失、擦去离心管口余液；尿样预处理步骤的步骤④中所加入的醋酸试液的浓度为2M、体积为400μL，加液时用力将沉淀冲起使之易于溶解，然后在涡旋振荡器上振荡一分钟；尿样预处理步骤的步骤⑤中所加入的水为10mL；尿样预处理步骤的步骤⑥中所加入的NaOH溶液的浓度为1M、体积为2mL，离心时，离心机的转速为每分钟4000转，离心时间为10分钟，有乳白色沉淀产生，分离时将离心管轻轻倾斜，以防止因振荡而使离心沉淀物的损失、擦去离心管口余液；尿样预处理步骤的步骤⑦中所加入的醋酸试液的浓度为2M、体积为400μL，振荡器为涡旋振荡器，振荡时间为一分钟；尿样预处理步骤的步骤⑧中所加入的EDTA柠檬酸钠的浓度为0.2M、体积为600μL，振荡方式为涡旋振荡；尿样预处理步骤的步骤⑨中所加入的柠檬酸钠的浓度为2M、体积为100μL，振荡方式为涡旋振荡。
7.根据权利要求1至4之一所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于尿样衍生化步骤要随时测定随时衍生化，尿样衍生化步骤是按如下步骤操作①向尿样预处理的终溶液中加入碳酸钠溶液，调节PH值9-10，振荡；②再加衍生化试剂，涡旋振荡后于黑暗处放置10-60分钟；③再加入柠檬酸试剂，涡旋振荡，在酸环境下终止反应；④再加入二氯甲烷，振摇，置于离心机上离心，去除衍生化试剂，分层而得到上清液；上述步骤②中所加入的衍生化试剂为FMOC-Cl或FMOC-NH2。
8.根据权利要求6所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于所述的尿样衍生化步骤中的步骤①中所取的尿样预处理终溶液为500ul，所加入的碳酸钠溶液的浓度为2M，振荡方式为涡旋振荡，振荡时间为两分钟；尿样衍生化步骤中的步骤②中所加入的衍生化试剂的浓度为100mg/mL、体积为20μL，涡旋振荡后的放置时间为30分钟；尿样衍生化步骤中的步骤③中所加入的柠檬酸试剂的浓度为2M、体积为50μL，涡旋振荡的时间为1分钟，酸环境由调节pH值得到；尿样衍生化步骤中的步骤④中所加入的二氯甲烷为5mL，离心时，离心机的转速为每分钟2000转，离心时间为5分钟(5)取上清液100μL进样，进行检测。
9.根据权利要求1至4之一所述的阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于尿样测定步骤的测定条件是色谱条件Waters公司515泵，Shimazu型荧光检测器；色谱柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流动相(缓冲液25mM柠檬酸+25mM焦磷酸钠)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱温40℃；流速1.0mL/min；激发波长260nm；发射波长310nm。
10.根据权利要求8所述的一种阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，其特征在于尿样测定步骤的测定条件是色谱条件Waters公司515泵，Shimazu型荧光检测器；色谱柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流动相(缓冲液25mM柠檬酸+25mM焦磷酸钠)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱 温40℃；流速1.0mL/min；激发波长260nm；发射波长310nm。
全文摘要
本发明提供一种评价阿仑膦酸钠生物等效性的检测方法，是以服用受试制剂与参比制剂后的尿样为检测对象，该方法主要包括以下步骤(1)采集定量尿样；(2)尿样预处理；(3)尿样衍生化；(4)尿样测定。本发明提供的检测方法，线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、专一、可靠，能够进一步进行阿仑膦酸钠不同制剂生物等效性的评价。
文档编号G01N30/00GK1908659SQ20061010968
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月17日 优先权日2006年8月17日
发明者郭卫芹, 张 育, 李国聪, 周杰, 高志峰 申请人:石家庄欧意药业有限公司