专利名称：：一种液相蛋白芯片的制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种液相蛋白芯片的制备方法。技术背景生物芯片是上世纪90年代初发展起来的一种生物检测技术，其原理是在约l2cn^大小的玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶或者金属等支持介质上，以微阵列的形式在不同位置固定上不同的生物分子探针(蛋白质、核酸等)，这些探针分子可以与溶液中的目的分子相互作用(如杂交、抗原-抗体结合反应等)，反应完成后通过洗片洗去未反应的分子。目的分子可以事先标记，也可以在与探针分子反应后进行染色，然后通过信号收集设备(如荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、芯片扫描仪等)检测反应信号的有无或强弱，经计算机数据分析后得到相关的生物信息。由于生物芯片高通量、高效率、并行化的特点，极大简化和縮短了实验研究进程，随着人类基因组计划提前完成和后基因组计划启动，生物芯片迅速在生物学领域得到较广泛的应用。根据芯片表面固定的分子及检测对象的不同，一般可将其分为基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片几类。虽然多数生物芯片的基片采用价格便宜的玻璃片，但是由于芯片制备需要专门的设备和技术、制备过程比较复杂、样品的准备与标记较为繁琐等多种因素，因而造成芯片的成本较高，而结果的重复性较差。另外，芯片使用过程是在基片的表面点加含有目的分子的溶液，目的分子需经过较长距离的扩散才能与探针在固-液相界面相互作用，因此反应检侧时间较长，灵敏度有待进一步提高。1997年，一种兼具核酸和蛋白质等生物分子分析功能的新一代高通量检测技术平台诞生了，它就是由美国Luminex公司开发出来的xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling)技术，基于该技术的液相芯片(也称为微球体悬浮芯片，suspensionarray)是继基因芯片、蛋白芯片之后的新型生物芯片。它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和荧光信号来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同生物学反应。具体说来，液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球(microspheres,直径为5.55.6pm)为主要基质构成，每一种微球都有一个独特的色彩编号，或称光学编码。在微球的制造过程中，按照精确的比例掺入了红色和橙色两种荧光染料(这两种染料各有IO种不同区分)，从而把微球分为100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。每种微球上可分别固定不同的探针分子，如各种蛋白、肽、多糖、脂类、寡核苷酸等生物分子，然后将这100种微球混合后悬浮于一个液相体系中，加入待测样品，不同的探针可以和样品中的不同目的分子结合，并使固定有探针的微球携带上报告分子藻红蛋白(R-Phycoerythrin)。反应结束后，仪器Luminex100可同时对100种微球上的100种分子进行实时分析。Luminex100是采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红绿双色激光同时对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。其中635nm红色激光激发的是微球内的红色和橙色分类荧光分子，根据微球分类荧光信号强度的不同将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型，即定性。绿色激光激发的是结合在微球表面上的橙色报告荧光分子，目的是确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量，即定量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，高速数字信号处理器将微球上的荧光信号强度转化为对应的数字信号，就可以确定被结合的目的分子的种类和数量，完成对反应的实时、定性和定量分析。液相芯片技术与传统免疫学、核酸检测方法相比具有以下几个显著优点(1)高通量从理论上说，如果不存在交叉反应，检测的通量等于微球的种类数，目前最多可达到100种。这远胜过一次只能检测1个项目的传统免疫分析法。(2)样本用量少由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应，所以检测多指标时大大节省了样本用量，非常适合分析小体积稀有样品。(3)操作简单、快速由于是基于液相反应动力学，因此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。进行免疫学分析时，若使用高亲和力抗体，23小时内即完成检测，而核酸杂交分析在PCR扩增后1小时内可得到结果。(4)检测范围广可达35个数量级，样品无需浓縮或稀释。(5)准确性好由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要象ELISA检测中样本需多倍稀释，从而减小了误差。(6)重复性好这是由于第一，与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比，液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏；第二，每种微球检测100个，最终取荧光强度的中值作为结果，这相当于对每个样本重复检测了100次，而ELISA仅为双复孔或三复孔。(7)费用低同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动(比ELISA法低10100倍)，降低检测成本，同时还提高了分析效率，通过少量样本即可获得大里fe息o与平面芯片(基因芯片、蛋白芯片)相比，液相芯片技术也更胜一筹(1)灵敏度更高微球表面积大，每个微球上可固定大约100，000个捕获抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度。最低检测浓度可达到l(T13g/mL。(2)特异性强只读取单个微球上的荧光信号，信噪比高。(3)重复性更好不存在平面芯片因其固有的生产工艺问题而影响重复性的现象。(4)更加灵活使用者自行组合或自行制备固定探针的微球和标记分子即可满足不同检测项目的需要，而平面芯片则需要另行制作一张新的芯片。液相芯片技术以其高通量、快速、灵活、准确、灵敏、操作简便、重复性好、可定性定量等显著优点成为一种极具吸引力的大规模生物检测平台，几乎可用于任何分子相互作用的检测。迄今为止不到十年的时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具。其主要用途有筛选过敏原、检测自身抗体、生物标志物、细胞因子、激素、HLA、病原微生物、基因突变等以及基因表达分析、酶/底物研究、DNA-蛋白相互作用分析等。癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)是临床常用的肿瘤标志物，前者血清含量升高主要见于消化道肿瘤尤其是结肠癌，而后者是原发性肝癌最灵敏、最特异的标志。检测肿瘤标志物对于肿瘤的早期诊断、良恶性鉴别、临床分期、疗效监测和预后判断具有重要价值。这两种肿瘤标志物也是健康体检和肿瘤筛査中最常用的指标。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与肝硬变、肝癌的发病密切相关，并已从多方面得到证实。临床上我国肝癌患者中约85%有乙肝病毒感染史。流行病学调查发现，肝癌高发区人群HBsAg阳性率高于肝癌低发区。病理学检查也发现肝癌患者HBsAg阳性率显著高于对照组。所以目前乙型肝炎-肝硬变-肝癌的致病模式已为人们所认识。由于在慢性乙肝病毒携带者(HBsAg阳性)中，肝癌发生的危险性比HBsAg阴性者高约200倍，因此，有人建议高危人群(肝炎高发区的居民和有肝炎病史或HBsAg阳性者)应定期检测AFP。检测CEA、AFP、HBsAg的传统方法有酶联免疫吸附测定、放射免疫测定法、化学发光免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定等。这些方法存在一个共同缺陷均为单指标检测，信息量小，需检测多个项目时标本用量大、检测费用高，而且均有其局限性(如标记步骤复杂、试剂和仪器昂贵、操作繁琐、灵敏度低、重复性差、易污染等)。
发明内容本发明的目的是提供一种可联合检测人血清CEA、AFP、HBsAg的液相蛋白芯片，包括其制备方法。本发明在3种具有不同荧光编码的微球上分别偶联CEA、AFP、HBsAg的特异性抗体(捕获抗体)，偶联反应中的微球为2.5><106个，捕获抗体浓度为28pg/ml，室温反应2小时。本发明中针对CEA、AFP、HBsAg的检测抗体采用生物素或者藻红蛋白标记。本发明的另一目的是提供一种液相蛋白芯片的使用方法。本发明中液相蛋白芯片的使用方法包括(1)配制含有3种抗体偶联微球的混合液；(2)在96孔滤膜板中分别加入25pi抗原标准品和1:25稀释的血清样品；(3)各孔加入25^微球混合液，室温振摇反应60分钟；(4)洗涤液洗板3次；(5)各孔加入25pl生物素标记抗体混合液或者藻红蛋白标记抗体混合液，室温振摇反应60分钟；(若第5步加入藻红蛋白标记抗体混合液，则省略第6、7步)(6)洗涤液洗板3次；(7)各孔加入25藻红蛋白标记的链霉亲和素，室温振摇反应1530分钟；(8)洗涤液洗板3次，用125pl洗涤液重悬微球；(9)在仪器上检测荧光信号，进行数据分析。本发明联合检测人血清CEA、AFP、HBsAg水平，可用于健康体检以及高危人群的普查。联合检测这3项与肿瘤发生密切相关的指标可起到对机体健康状况的预警作用，有助于肿瘤的及早发现和及时治疗。本发明的优点是采用最新的xMAP技术，每次仅需lpl标本，即可在34小时内同时完成血清CEA、AFP、HBsAg水平的三项检测。不仅大大节省了标本和试剂用量，而且减少了操作时间，提高了检测效率。仪器在检测荧光信号后自动根据标准品的浓度作出标准曲线，计算得出待测物浓度，实现定性和定量分析。此外，本发明使用96孔滤膜板代替微量滴定板作为反应容器，每步反应完成后洗去未结合的分子，可降低背景荧光，提高灵敏度和检测范围，而且重复性更好，结果更为准确可靠。鉴于液相芯片无与伦比的技术优势，可以预见，快速、灵敏、高通量的液相蛋白芯片将是今后临床检验和疾病诊断试剂的发展方向之一。图1是本发明联合检测CEA、AFP、HBsAg的标准曲线。具体实施方式实施例l:液相蛋白芯片的制备1、抗体偶联微球的制备(1)取2.5><106个羧基化微球(购自Luminex公司)于1.5ml微量离心管中，13，000转/分离心4分钟，弃上清。(2)加入100pl去离子水，漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。13,000转/分离心4分钟，弃上清。(3)加入100^d活化缓冲液(0.1mol/LNaH2P04,pH6.2)，漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。13,000转/分离心4分钟，弃上清。(4)加入80pl活化缓冲液，漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。(5)分别称取适量N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和碳二亚胺(EDC)，用去离子水配成50mg/ml的浓度(现配现用)。(6)在微球悬液中加入10piSulfo-NHS溶液，轻轻混匀后，马上加入10plEDC溶液，轻轻混匀，室温下避光静置20分钟，中间混匀一次。(7)将微球13,000转/分离心4分钟，弃上清。(8)加入150pl交联缓冲液(50mmol/L2-吗啉乙磺酸(MES)，pH5.0)，漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。13,000转/分离心4分钟，弃上清。(9)重复步骤8—次。(10)加入100^d交联缓冲液，漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。(11)在已活化的微球悬液中加入14pg捕获抗体(预先经透析或过柱去除叠氮钠、杂蛋白等)，并用交联缓冲液补足体积至500^1，混匀，室温避光温和振荡2小时。(12)将微球13,000转/分离心4分钟，弃上清。(13)加入500pl封闭液(0.8o/oNaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HP04,0.024%KH2P04,1%BSA,0.05%Tween20,0.05%叠氮钠，pH7.4)，室温避光振荡30分钟。(14)将微球13，000转/分离心4分钟，弃上清。(15)将微球用500plPBS-TBN(0.8%NaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HPO4,0.024%KH2P04，0.1%BSA，0.02%Tween20，0.05%叠氮钠，pH7.4)洗涤2次。(16)最后加入400600^ilPBS-TBN,漩涡振荡并超声处理20秒使微球重悬。(17)取少量微球悬液用水适当稀释后，显微镜下计数微球个数，计算微球悬液的浓度。(18)将抗体偶联微球4'C避光保存。2、生物素标记抗体的制备(1)取0.5lmg抗体加入带滤膜离心管(MicroconYM-50，购自Milliporc公司)中，8,000转/分离心5分钟。(2)用50mmoI/LNaHCO3(pH8.8)反复洗涤5次并调整浓度至2mg/ml。(3)用二甲基甲酰胺(DMF)配制IOmg/m性物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯，并取适量加入单抗溶液中，使生物素与单抗的质量比为1:5，混匀，室温静置60分钟。(4)反应结束后，将反应物于PBS中透析24小时，除去游离的生物素。(5)将生物素标记抗体分装，4'C保存。3、藻红蛋白标记抗体的制备(1)取0.51mg抗体加入带滤膜离心管(MicroconYM-50,购自Millipore公司)中，8,000转/分离心5分钟。(2)用PBS(0.8%NaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HPO4，0.024%KH2P04，pH7.4)反复洗涤5次并调整浓度至l10mg/ml。(3)在纯化后的抗体溶液中加入1mol/L二硫苏糖醇(DTT)，使DTT终浓度为20mmol/L,盖紧微量离心管盖，混匀，室温静置30分钟。(4)将经DTT处理的抗体过SephadexG-25层析柱，洗脱液为50mmol/LMES，2mmol/LEDTA(pH6.0)，收集流出液，立即进行以下操作。(5)在每1mg抗体中加入3.2mg活化藻红蛋白U0mg/ml，购自Prozyme公司)，混匀，室温避光振荡反应60分钟。(6)在每lmg抗体中加入34吗N-乙烷基顺丁烯抱亚胺(NEM，10mg/ml)，混匀，室温避光振荡反应20分钟。(7)将反应物用SephacrylS-300层析柱进行纯化，PBS洗脱。首先是藻红蛋白标记抗体出峰，其后依次是游离藻红蛋白和未标记抗体。(8)收集标记抗体，fC避光保存。实施例2:反应所需溶液的制备1、标准品稀释液的制备按以下配方配制标准品稀释液0.8%NaCl，0.02%KCl,0.29%Na2HP04,0.024%KH2P04，1.57.5%BSA，0.01%Tween20，0.05%叠氮钠,pH7.4。2、标准品的制备分别取适量含高浓度CEA、AFP、HBsAg抗原的贮存液，用标准品稀释液按下表所示浓度配制同时含有上述3种抗原的标准品16(Std1Std6)，标准品7(Std7)为不含任何抗原的标准品稀释液。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、分析缓冲液的制备按以下配方配制分析缓冲液0.8%NaCl，0.02%KC1,0.29%Na2HPO4,0.024%KH2P04，1%BSA，0.05%叠氮钠，pH7.4。4、洗涤液的制备按以下配方配制洗漆液-0.80/oNaCl,0.02%KC1，0.29%Na2HP04，0.024%KH2P04，0.05%Tween20，pH7.4。实施例3:液相蛋白芯片的使用方法1、将CEA、AFP、HBsAg的抗体偶联微球漩涡振荡并超声处理20秒，使其重悬。2、各取适量微球悬液，用分析缓冲液配制成每nl含有80100个不同荧光编码微球的稀释微球混合液。3、在96孔滤膜板(MultiScreenMABVN1.2nm)所需反应孔中加入100nl/孔的分析缓冲液预湿，其余孔用封板膜封住，真空抽滤去除液体。4、在滤膜板标准品孔(可设双复孔)、样品孔中分别加入25nl/孔的标准品和血清标本(预先用标准品稀释液稀释25倍)。5、在上述孔中加入25nl/孔的稀释微球混合液。6、封板膜封住反应孔，室温避光振荡孵育60分钟。7、真空抽滤去除孔内液体，用100pl/孔的洗涤液洗板3次并抽干。8、用分析缓冲液配制含有CEA、AFP、HBsAg3种生物素标记抗体的混合液或者3种藻红蛋白标记抗体的混合液，浓度均为12pg/ml。9、加入25pl/孔的生物素标记抗体混合液或者藻红蛋白标记抗体混合液，封板膜封住反应孔，室温避光振荡孵育60分钟。(若第9步加入藻红蛋白标记抗体混合液，则省略第1012步)10、真空抽滤去除孔内液体，用100)al/孔的洗涤液洗板3次并抽干。11、用分析缓冲液配制20pg/ml藻红蛋白标记的链霉亲和素(SA-PE)溶液。12、加入25nl/孔的SA-PE，封板膜封住反应孔，室温避光振荡孵育1530分钟。13、真空抽滤去除孔内液体，用100pl/孔的洗涤液洗板3次并抽干。14、加入125nl/孔的洗涤液重悬微球。15、在Bio-Plex检测系统或LuminexlOO上读取各孔荧光值，根据标准品浓度得出待测物浓度值。权利要求1、一种液相蛋白芯片，主要由偶联特异抗体的微球和标记生物素或藻红蛋白的检测抗体组成，其特征在于，所用微球大小相同，而具有不同荧光编码，检测的目标蛋白为癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg),检测反应在96孔滤膜板中进行。2、如权利要求l所述的一种液相蛋白芯片，其特征在于，微球为直径5.55.6nm的聚苯乙烯微球，其内部用两种荧光染料按不同比例染色，因而具有不同的荧光编码。3、如权利要求l所述的一种液相蛋白芯片，其特征在于，特异抗体是通过与微球上的羧基发生缩合反应而偶联至微球上。4、如权利要求l所述的一种液相蛋白芯片，其特征在于，偶联于微球的捕获抗体及用于标记的检测抗体是针对CEA、AFP和HBsAg的特异性单克隆抗体。5、如权利要求1所述的一种液相蛋白芯片，其特征在于，检测抗体可采用生物素或者藻红蛋白标记。6、如权利要求1所述的一种液相蛋白芯片，其特征在于，检测灵敏度分别为CEA8.90pg/ml、AFP0.013U/ml、HBsAg0.24ng/ml。7、如权利要求1所述的一种液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，反应在96孔滤膜板中进行，每步反应完成后用洗涤液洗板3次。8、如权利要求1所述的一种液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，血清标本用量为1^，可同时定性定量分析CEA、AFP和HBsAg。9、如权利要求1所述的一种液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，用Bio-Plex检测系统或LuminexlOO检测荧光信号，自动做出标准曲线，并得出标本中待测物的浓度。全文摘要本发明涉及生物
技术领域：
。本发明公开了一种可同时检测人血清癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)的液相蛋白芯片及其制备和使用方法，它将CEA、AFP和HBsAg的特异性抗体偶联在不同的荧光微球上，利用生物素或者藻红蛋白标记的检测抗体以双抗体夹心法快速定性和定量分析上述三项指标。检测时使用滤膜板，每步反应完成后洗板3次，从而增强信号，提高灵敏度。本发明不仅具有灵敏度高、特异性强、结果稳定、重复性好等优点，而且操作简便，一次只需1μl血清标本即可同时检测三项指标，适用于健康体检和高危人群的普查及临床检测，有助于肿瘤的早期诊断和早期治疗。文档编号G01N33/546GK101144815SQ20061012211公开日2008年3月19日申请日期2006年9月13日优先权日2006年9月13日发明者吴英松,明李,玮陈申请人:广州市达瑞抗体工程技术有限公司