专利名称：一种磷霉素产生菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体为一种抗生素产生菌—磷霉素产生菌株的筛选方法。
背景技术：
磷霉素[(-)-顺-(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，FOM]是一种广谱抗生素。它具有独特的化学结构与抗菌作用机制，与其他抗生素或抗菌药之间不仅没有交叉耐药性，而且多数呈现协同作用。同时，因为磷霉素还具有理化特性稳定、安全低毒、无抗原性(无需试敏)等优点，现已广泛用于临床治疗，被国际医学界和药学界称为二十一世纪的新抗生素。
FOM可以经过微生物转化作用获得。传统的磷霉素产生菌株筛选方法是采用振荡培养方法筛选转化菌株，即在振荡培养后，把发酵液离心，获取上清液作为特测定样品，然后以生物鉴定盘鉴定上清液是否产生抑菌圈，从而判断是否有抗生素存在。这种方法的缺点是当发酵液中抗生素含量较低时，在生物鉴定盘上检测不到抗生素(如磷霉素)的存在，从而导致筛选工作失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、高效的磷霉素产生菌株的筛选方法，采用本发明可以提高单位体积发酵液中磷霉素的含量，从而提高鉴定的灵敏性。
本发明的技术方案是一种磷霉素产生菌株的筛选方法，首先，对摇床培养后的菌株发酵液进行冷冻浓缩；然后，利用牛津杯在生物鉴定盘或平板上鉴定发酵液对敏感菌的抗性，以初步确定是否为抗生素产生菌；所述冷冻浓缩的步骤如下(1)冷却剂的制备冷却剂采用体积浓度4～10％的乙醇，将乙醇在-30℃～-10℃的冰箱里预冷30min～1小时，得到已结冰的乙醇-冰冷却剂；(2)发酵液的预处理将发酵液放到冰箱冷冻室中，冷却到0～10℃；(3)冷冻浓缩将已预冷却到0～10℃的发酵液放置到乙醇-冰冷却剂中，于真空度为10～20Pa、冷冻温度为-30℃～-10℃下，冷冻15min～2小时，至干燥形成浓缩液为止。
所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，在生物鉴定盘或平板的培养表面放置牛津杯，使牛津杯与培养基接触无空隙，向牛津杯中加入浓缩液，置28～37℃培养20～36小时，观察抑菌圈的有无及抑菌圈直径的大小；从而，在生物鉴定盘或平板上鉴定发酵液对敏感菌的抗性，以初步确定是否为抗生素产生菌。
所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，采用右旋磷霉素为底物培养待测菌株，利用大肠杆菌为生物鉴定的指示菌。
所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，在初步确定是否为抗生素产生菌之后，再利用薄层层析进一步来验证发酵液中是否存在磷霉素。
所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，利用薄层层析分析磷霉素，展开剂组分为正丁醇、乙酸、水，按体积比3∶1∶1混合，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定盘或平板上，待浸润后取下，28～37℃培养16～24小时至生物鉴定盘或平板上产生抑菌圈；比较样品与磷霉素标准品的Rf值，验证产生的抗生素是否为磷霉素。
所述的乙醇-冰冷却剂中，冰为碎冰，冰粒直径1mm～5mm。
所述培养后的菌株发酵液，经过离心收集上清液，将上清液置于搅拌器上搅拌均匀后，再对其进行冷冻浓缩。
所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，冷冻浓缩后的浓缩液浓度为原来的2～10倍。
本发明的有益效果是1.本发明筛以右旋磷霉素为底物，在营养琼脂平板上接种待测菌株，保持适合的温度和湿度，培养一定时间，挑取单菌落获得纯培养。然后对纯培养进行摇瓶培养复筛，取发酵液离心后，把上清液冷冻浓缩，然后利用牛津杯在生物鉴定盘或平板上鉴定其对敏感菌的抗性，以初步确定是否为抗生素产生菌(如磷霉素产生菌株)。该方法的关键是控制冷冻浓缩条件，增加单位体积发酵液中抗生素(如磷霉素)的含量，提高鉴定灵敏度和效率。
2.本发明采用的冷冻浓缩方法现已广泛应用于果汁、啤酒、咖啡、牛奶、中草药等的制作过程中。本发明将磷霉素生物转化菌株发酵液冷冻浓缩的方法应用于筛选过程中，经研究发现，冷冻浓缩法也可以用于抗生素产生菌的筛选过程，从而成为一种灵敏、高效的抗生素产生菌筛选新技术，灵敏度和鉴定效率都有大幅度的提高。
3.本发明培养后的菌株发酵液，经过离心收集上清液，将上清液置于搅拌器上搅拌均匀后，再对其进行冷冻浓缩，得到均一的浓缩液，从而提高浓缩效率。
4.本发明具有不使抗生素失活、操作简单、成本低等优点，对于增加单位体积发酵液中磷霉素的浓度和提高磷霉素转化菌株的鉴定效率非常适用。
具体实施例方式
本发明的具体操作步骤如下1.指示菌培养与悬液的配制指示菌为大肠杆菌(E.coli)，中国科学院沈阳应用生态研究所保藏。
按重量百分数计，指示菌培养基组成牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水。加热溶解后，调pH 7.0～7.2。装入茄型瓶90mL，121℃湿热灭菌(本发明湿热灭菌可采用蒸气等)20min后，摆斜面备用。
指示菌培养37℃培养24小时，菌苔呈半透明至白色。
指示菌悬液的制备把100mL灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的空锥瓶中，测定吸光度(O.D.值)为0.54～0.57。
2.磷霉素生物转化菌株的初筛与复筛以右旋磷霉素为唯一碳源的选择培养基的组成按重量百分数计，右旋磷霉素0.5％，(NH4)2SO40.5％，NaCl 0.2％，KCl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.01％，FeSO4·7H2O 0.01％，KH2PO40.05％，琼脂2％，余量为自来水，pH 7.5。121℃湿热灭菌20min。
肉汤斜面培养基组成按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，琼脂2％，pH 7.5，余量为自来水。121℃湿热灭菌20min。
初筛培养基的组成按重量百分比数计，右旋磷霉素0.5％，蛋白胨0.1％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO40.5％，FeSO4·7H2O 0.01％，琼脂2％，余量为自来水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。
复筛培养基的组成按重量百分比数计，右旋磷霉素0.5％，蛋白胨0.1％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO40.5，余量为自来水，pH 7.5。121℃湿热灭菌20min。
取1.0g土样，加至100mL选择培养基中，30℃摇床振荡培养2周。将选择培养基融化后，于直径为90mm的培养皿中倒入25mL，静置凝固。将上述土壤悬液系列稀释到10-3、10-4、10-5，取各稀释度土壤悬液0.1mL涂布于选择培养基平板，30℃培养2～4天。挑取单菌落分别点种于不含碳源的对照平板和选择培养基平板，再经30℃培养2～4天，挑取仅在选择培养基平板上生长的菌落，接种到肉汤斜面培养基。
将斜面菌种挑取两环接入到装有30mL初筛培养基的250mL三角瓶中，于30℃，180转/分摇床振荡培养24小时后，以体积比1％接菌量接种到复筛培养基中，继续振荡培养3～5天。然后，发酵液12000转/分离心5min，收集上清液。
3.磷霉素生物转化菌株发酵液的冷冻浓缩冷却剂的制备乙醇(体积浓度4％)在-20℃的冰箱里预冷30min～1小时，形成结冰的乙醇-冰冷却剂，冰应为碎冰，冰粒直径1mm～2mm，有利于在短时间内形成均一的冷却剂。
磷霉素转化菌株发酵液的冷冻浓缩将摇床培养后的20mL上清液，置于50mL烧杯中，在转速400转/分的搅拌器上搅拌10min，然后将得到的发酵液放到冰箱冷冻室中，冷却到6℃。将已预冷却到6℃的发酵液装进容器后，放置到已结冰的乙醇-冰冷却剂中，于真空度为10～20Pa、冷冻温度为-20℃下冷冻浓缩15min～2小时，至干燥形成浓缩液为止，浓缩比2∶1～10∶1。
4.磷霉素生物转化菌株的筛选生物鉴定培养基及其平板的制备按重量百分数计，培养基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水，pH 7.0～7.2；培养基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH 7.0～7.2。培养基I、培养基II均在121℃灭菌20min。
将20mL融化的培养基I倒入直径为90mm的培养皿中制成下层平板；再将4mL融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌悬液1mL，迅速混匀后倒入培养皿，制成上层平板。待冷却凝固后，于每个平板的培养表面放置6个消毒牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)，使牛津杯在半径为2.8cm的圆面上成60度角的间距。轻轻加压，使牛津杯与培养基接触无空隙。然后，向牛津杯中加入浓缩液1mL，置30℃培养20～36小时，至产生明显的敏感菌菌落，观察抑菌圈的有无及抑菌圈直径的大小。通过鉴定其对敏感菌的抗性，可以初步确定是否为抗生素产生菌。
5.磷霉素转化菌株的鉴定上述产生抑菌圈且抑菌圈直径较大(直径0.2～2mm)的，可能为磷霉素转化效率较高的菌株，并利用薄层层析进一步来验证发酵液中是否存在左旋磷霉素。薄层层析方法具体如下展开剂为正丁醇、乙酸、水按体积比3∶1∶1混合，将展开后的层析板风干，置于上述20×30cm的生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16小时至生物鉴定盘上或平板上产生抑菌圈，含有磷霉素部分产生抑菌圈。由抑菌圈位置计算相对迁移率即Rf值(比移值)，定性分析发酵液中是否存在左旋磷霉素。
实施例将本实验室采集的土样，取1g加至100mL选择培养基中，30℃摇床振荡培养2周。将选择培养基融化后，于直径为90mm的培养皿中倒入25mL，静置凝固。将上述土壤悬液系列稀释到10-3、10-4、10-5，取各稀释度土壤隐液0.1mL涂布于选择培养基平板，30℃培养3天。挑取单菌落分别点种于不含碳源的对照平板和选择培养基平板，再经30℃培养3天，挑取仅在选择培养基平板上生长的菌落，接种到肉汤斜面培养基。
将斜面菌种挑取两环接入到装有30mL初筛培养基的250mL三角瓶中，于30℃，180转/分摇床振荡培养24小时后，以体积比1％接菌量接种到复筛培养基中，继续振荡培养4天。然后，发酵液12000转/分离心5min，收集上清液。
取摇床培养后收集的上清液20mL，置于50mL烧杯中，在转速400转/分的搅拌器上搅拌10min，然后将得到的发酵液放到冰箱冷冻室中，冷却到6℃。将已预冷却到6℃的发酵液放置到已结冰的乙醇-冰冷却剂中，于真空度为15Pa、冷冻温度为-20℃下，冷冻15min，至干燥形成浓缩液，终浓度为原来的7倍。
将1mL浓缩液加入到内径6mm、外径8mm、高10mm的消毒牛津杯中，牛津杯置于含有双层培养基的平板上，下层培养基为生物鉴定培养基I，上层培养基为含有指示菌悬液的生物鉴定培养基II，每个平板上放6个牛津杯，且使牛津杯在半径为2.8cm的圆面上成60度角的间距。30℃培养24小时，观察抑菌圈的有无及抑菌圈直径的大小。对照不加冷冻浓缩液，其中有8株具有明显的抑菌圈。
利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇、乙酸、水按体积比3∶1∶1混合，将展开后的层析板风干，置于20×30cm的生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16小时。含有磷霉素的部分产生抑菌圈。比较样品与磷霉素标准品的Rf，样品的Rf值为3.52，标准品的Rf值为3.53，验证产生的抗生素为磷霉素。
权利要求
1.一种磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是首先，对摇床培养后的菌株发酵液进行冷冻浓缩；然后，利用牛津杯在生物鉴定盘或平板上鉴定发酵液对敏感菌的抗性，以初步确定是否为抗生素产生菌；所述冷冻浓缩的步骤如下(1)冷却剂的制备冷却剂采用体积浓度4～10％的乙醇，将乙醇在-30℃～-10℃的冰箱里预冷30min～1小时，得到已结冰的乙醇-冰冷却剂；(2)发酵液的预处理将发酵液放到冰箱冷冻室中，冷却到0～10℃；(3)冷冻浓缩将已预冷却到0～10℃的发酵液放置到乙醇-冰冷却剂中，于真空度为10～20Pa、冷冻温度为-30℃～-10℃下，冷冻15min～2小时，至干燥形成浓缩液为止。
2.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是在生物鉴定盘或平板的培养表面放置牛津杯，使牛津杯与培养基接触无空隙，向牛津杯中加入浓缩液，置28～37℃培养20～36小时，观察抑菌圈的有无及抑菌圈直径的大小；从而，在生物鉴定盘或平板上鉴定发酵液对敏感菌的抗性，以初步确定是否为抗生素产生菌。
3.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是采用右旋磷霉素为底物培养待测菌株，利用大肠杆菌为生物鉴定的指示菌。
4.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是在初步确定是否为抗生素产生菌之后，再利用薄层层析进一步来验证发酵液中是否存在磷霉素。
5.按照权利要求4所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是利用薄层层析分析磷霉素，展开剂组分为正丁醇、乙酸、水，按体积比3∶1∶1混合，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定盘或平板上，待浸润后取下，28～37℃培养16～24小时至生物鉴定盘或平板上产生抑菌圈；比较样品与磷霉素标准品的Rf值，验证产生的抗生素是否为磷霉素。
6.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是所述的乙醇-冰冷却剂中，冰为碎冰，冰粒直径1mm～5mm。
7.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是所述培养后的菌株发酵液，经过离心收集上清液，将上清液置于搅拌器上搅拌均匀后，再对其进行冷冻浓缩。
8.按照权利要求1所述的磷霉素产生菌株的筛选方法，其特征是冷冻浓缩后的浓缩液浓度为原来的2～10倍。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体为一种磷霉素产生菌株的筛选方法，将磷霉素生物转化菌株发酵液冷冻浓缩的方法应用于筛选过程中，冷冻浓缩是将预冷却到0～10℃的菌株发酵液放置到－30℃～－10℃的乙醇－冰冷却剂中，于真空度为10～20Pa、冷冻温度为－30℃～－10℃下，冷冻15min～2小时，至干燥形成浓缩液。本发明以右旋磷霉素为底物培养待鉴定菌株，以大肠杆菌作为生物鉴定的指示菌，在把发酵液进行冷冻浓缩后，利用牛津杯在生物鉴定盘(或平板)上鉴定发酵液可否产生抑菌圈，从而达到筛选磷霉素生物转化菌株的目的。本发明具有不使抗生素失活、操作简单、成本低等优点，对于增加单位体积发酵液中磷霉素的浓度和提高磷霉素转化菌株的鉴定灵敏度和效率非常适用。
文档编号G01N30/00GK1974786SQ20061013474
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者周丽沙, 徐慧, 李佰广, 张颖, 李慧, 任瑞霞, 张忠泽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所