专利名称：：在人肝脏组织中表达的两种蛋白质的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种免疫组化检测方法；具体的说，涉及对两种在人肝细胞癌肿瘤组织中上调表达的蛋白质HOP(Hsp70/Hsp90-organizingprotein)和核不均一核糖体蛋白Cl/C2(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinCl/C2，hnRNPCl/C2)的检测方法，以及用于该方法的试剂盒。
背景技术：
：肝细胞癌是世界范围内的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和死亡率，在2000年有56万新发病例和基本同等的死亡病例、肝细胞癌在亚洲和非洲的流行率较高，在中国的死亡率最高。考虑到现在对肝细胞癌仍缺乏有效的诊治手段，对肝细胞癌的重要癌变相关分子进行发掘仍然很迫切并且必要。肝细胞癌发生的多种危险因素，如HBV/HCV感染、酒精和黄曲霉毒素暴露等都己在大量的研究中得到确定，并且致癌过程中的某些步骤近年来得到了阐述，如黄曲霉毒素暴露可引起p53的249位Ser突变。但是这些因素是怎样以及按什么顺序在分子水平发生作用的，还不甚明了2。一般认为，慢性肝损伤、再生和硬化会促进肝实质细胞恶性变，细胞原癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因组的不稳定性，包括DNA错配修复缺失和染色质分离受损、生长因子和血管生成因子的过表达、端粒酶激活都会促使肝细胞癌的发生。并且，一些调控细胞增殖、复制周期、死亡、分化和基因组完整性的通路，在肝细胞癌中发生了异常改变，而其中重要的节点分子，如p53的变化则会同时影响多个细胞过程和调控通路。蛋白质组学成为全面分析蛋白质表达变化的有力研究工具，已广泛应用到疾病特别是肿瘤研究之中。基于人体组织的差异蛋白质组学分析，可以对肝细胞癌发病机制提供更直接的信息，并有可能提供用于临床疾病筛选的标志物。韩国进行了较多相关分析3—6，发现了如肌氨酸脱氢酶、肝脏羧酸酯酶、肽酰脯氨酰异构酶A和核纤层蛋白Bl等的表达变化、曰本发现了a烯醇酶、巴豆酸酶、P原肌球蛋白、酮己糖激酶、肝型醛縮酶和精氨酸酶18'9的改变，以及4种热休克蛋白70家族成员的同时高表达、新加坡研究小组发现了肝细胞癌中甲基化循环相关酶的下调'、台湾发现了14-3-3gamma蛋白上调12;香港发现分子伴侣Hsp27、Hsp70和GRP78上调并与某些临床特征相关13;上海实验室发现增殖细胞抗原和stathmin1的差异表达14，湖南湘雅医院做了2DE表达模式的分析15等。对肝脏细胞癌发生过程中具有标志性变化的蛋白质建立一种检测方法有助于肿瘤的临床和研究检测。
发明内容本发明的目的是为肝癌的早期发现提供一种易于检测、可信度高的临床标志物，以及检测该标志物的方法和试剂盒。发明人发现了两种在人肝细胞癌肿瘤组织中上调表达的蛋白质HOP(Hsp70/Hsp90-organizingprotein)和核不均一核糖体蛋白C1/C2(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinCl/C2，hnRNPCl/C2)，提供了检测此两种蛋白质的方法和试剂盒，可用于临床和研究的检测。本发明通过以下原理得以实现发明人通过荧光差异双向电泳—MALDI-TOF/TOF的方法在人肝细胞癌肿瘤组织中发现两种上调表达的蛋白质HOP(Hsp70/Hsp90-organizingprotein)和核不均一核糖体蛋白C1/C2(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinCl/C2，hnRNPCl/C2)，鉴定结果如图1和图2所示。荧光差异双向电泳是在定量蛋白质组学方面的一个进步，优于传统的双向电泳，它与代谢同位素标记方法有很好的相关性16。该方法鉴定的这2种差异蛋白得到了Westernblot和70对肝细胞癌肿瘤样本免疫组化验证，具有很高的可信性。对上述2种差异蛋白质进行了如下验证(1)对HOP在12例人肝细胞癌组织中进行了Westernblot检测，发现它在所有12例肿瘤组织中都上调(如图3.A所示)；(2)对核不均一核糖体蛋白Cl/C2在12例人肝细胞癌组织中进行了Westernblot检测，发现它的~67kDa形式在12例肿瘤中均有表达而非肿瘤中不表达或极弱表达，另外一种~42kDa形式在大多数肿瘤中有上调表达(如图3.B所示)；(3)对HOP在70例人肝细胞癌组织中进行了免疫组化检测，该蛋白在肿瘤组织中相较非肿瘤组织有明显高表达(如图4所示)，在肿瘤组织中的阳性率达到100%(70〃0)，配对非肿瘤组织只有6%(4/70)。(4)对核不均一核糖体蛋白Cl/C2在70例人肝细胞癌组织中进行了免疫组化检测，该蛋白在肿瘤组织中相较非肿瘤组织有明显高表达(如图4所示)，在肿瘤组织中的阳性率达到100%(70/70),配对非肿瘤组织只有7%(5/70)。(5)在配对非肿瘤组织中，HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2的双阳性率仅为1.4X(1〃0)。上述两种蛋白质在人肝细胞癌肿瘤组织中相较非肿瘤组织有明显高表达，因此在肝细胞癌临床检验方面具有应用价值。本发明提供了一种用于上述两种蛋白质的免疫组化检测方法，包括如下步骤(a)准备待检测组织的石蜡切片，脱蜡水化，3%11202室温孵育，抗原热修复；(b)封闭液封闭后，HOP和/或核不均一核糖体蛋白Cl/C2—抗工作液孵育；(c)用带有生物标记的二抗工作液孵育，酶底物显色；(d)复染，脱水，透明，封片。所用试剂为本领域技术人员所熟知的各种试剂。例如，步骤b中封闭液可选用BSA或羊血清；步骤c中所使用二抗的生物标记可采用辣根过氧化物酶法或生物素一酶标链霉亲和素(SP法)或其它方法；酶显色底物可以是3,3,—二基联苯胶(DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)等。HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2—抗以及生物标记的二抗可使用商品化产品。为便于操作，本发明还提供了一种用于上述两种蛋白质检测的免疫组化试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测的多种组分。例如，该试剂盒的组分包含(a)封闭液；(b)HOP和/或核不均一核糖体蛋白Cl/C2—抗；(C)生物标记的二抗；(d)显色试剂。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，所述封闭液可以是BSA或羊血清；二抗的生物标记可以是辣根过氧化物酶标记或生物素一酶标链霉亲和素标记；显色试剂可以是DAB或AEC等。为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种粘片剂APES或多聚赖氨酸，0.02MPBS(pH7.27.6)，阳性对照，此外还可含有国家行政机关批准的使用说明等。该试剂盒可对HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2蛋白质单独检测或合并检测。该试剂盒的使用方法如下(1)准备待检测组织的石蜡切片(可同时使用阳性对照切片)，脱蜡水化，3%11202室温孵育，抗原热修复；(2)将封闭液用PBS稀释至5X10X，用于组织切片的封闭；(3)HOP和/或核不均一核糖体蛋白Cl/C2—抗稀释为1:100的工作液，滴加至样品中，37。C孵育12h或4'C过夜，PBS冲洗5minX3次；(4)滴加生物标记的二抗工作液，室温孵育0.5lh，PBS冲洗5minX3次，显色试剂显色；(5)PBS或自来水冲洗后，复染、脱水、透明、封片。本发明所提供的在人肝组织中表达的蛋白质检测方法及试剂盒适用于在生物学、医学和药学领域中对肝细胞癌进行发病机制研究和临床检测研究。本发明所涉及的蛋白质检测方法及其试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在生物学、医学等领域进行各种肝细胞癌相关研究和检测。图l.HOP鉴定的一级(A)和二级(B)质谱图，m/z943.6641表示在一级质谱图中质荷比为943.6641的峰，MS/MSprecursor943.6641表示二级质谱的母离子为质荷比为943.6641的一级质谱峰，经二级质谱分析，该峰所对应的蛋白肽段序列为VPPPPPIAR，经数据库检索，鉴定该蛋白质为HOP。图2.核不均一核糖体蛋白Cl/C2鉴定的一级(A)和二级(B)质谱图，m/z1488.9204表示在一级质谱图中质荷比为1488.9204的峰，MS/MSprecursor1488.9204表示二级质谱的母离子为质荷比为1488.9204的一级质谱峰，经二级质谱分析，该峰所对应的蛋白肽段序列为LAYINPDLALEEK，经数据库检索，鉴定该蛋白质为核不均一核糖体蛋白Cl/C2。图3.HOP(A)和核不均一核糖体蛋白Cl/C2(B)在12例人肝细胞癌组织中的Westernblot结果，T为肿瘤组织，N为非肿瘤组织。图4.H0P在人肝细胞癌组织中的免疫组化结果，T为肿瘤组织，N为非肿瘤组织。图5.核不均一核糖体蛋白C1/C2在人肝细胞癌组织中的免疫组化结果，T为肿瘤组织，N为非肿瘤组织。具体实施例方式下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。实施例1对HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2在12例人肝细胞癌组织中的Westernblot检测U将12例肝细胞癌病人的肿瘤组织和临近非肿瘤组织每份各0.2g放于液氮中，用液氮预冷的研钵研磨至粉末状。然后将样品移至lml裂解液(7M尿素,2M硫脲，4%CHAPS，30mMTris，pH8.5，proteaseinhibitorcocktail)中，冰上匀浆1020次。冰浴超声10s(超0.1s，停1.9s)，12,000rpm(20627g)4。C离心30min去除不溶物质。Bradford法测定蛋白浓度。1.2每份蛋白样品取25吗上样量进行SDS-PAGE分离。电泳完毕，将蛋白从凝胶电转到PVDF膜上，恒流电转，电流(mA)=膜面积(cm2)X2，电转2h。PVDF膜放入封闭液(5%脱脂奶溶于TBST缓冲液)中，室温轻摇1h。TBST洗膜5minX3次，放入含1:1000稀释的H0P或核不均一核糖体蛋白C1/C2—抗的封闭液中，室温轻摇2h或4'C过夜。TBST洗膜5minX3次，放入含1:10000稀释的二抗的封闭液中，室温轻摇lh。TBST洗膜5minX3次后，使用ECL显色试剂盒X胶片压片曝光。发现HOP在所有12例肿瘤组织中都上调表达(如图3.A所示)；核不均一核糖体蛋白Cl/C2的67kDa形式在12例肿瘤中均有表达而非肿瘤中不表达或极弱表达，另外一种~42kDa形式在大多数肿瘤中上调表达(如图3.B所示)。实施例2对HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2在70例人肝细胞癌组织中的免疫组化检测2.1将石蜡包埋的70例肝细胞癌病人的肿瘤组织和临近非肿瘤组织做成切片，每一例病人的肿瘤组织和临近非肿瘤组织在同一张切片上平行进行免疫组化检测。2.2石蜡切片脱蜡水化，3。/。H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5minX3次，抗原热修复，10%BSA(PBS稀释)封闭，室温孵育30min，倾去血清，滴加1:100稀释的HOP或核不均一核糖体蛋白Cl/C2—抗工作液，37'C孵育2h。PBS冲洗5minX3次，滴加辣根过氧化物酵标记二抗工作液，室温孵育lh，PBS冲洗5minX3次，DAB显色5分钟，PBS或自来水冲洗10分钟，复染，脱水，透明，封片。结果表明，HOP在肿瘤组织中相较非肿瘤组织有明显高表达(如图4所示)，在肿瘤组织中的阳性率达到100%(70/70),所有样本的阳性染色肿瘤细胞比例均在25%以上且以75100%为主，配对非肿瘤组织的阳性率只有6%(4/70)，而且阳性染色肝实质细胞比例均在25%以下；核不均一核糖体蛋白Cl/C2在肿瘤组织中相较非肿瘤组织有明显高表达(如图5所示)，在肿瘤组织中的阳性率达到100%(70/70)，所有样本的阳性染色肿瘤细胞比例均在25%以上且以75100%为主，配对非肿瘤组织的阳性率只有7%(5/70)，而且阳性染色肝实质细胞比例均在25%以下。在配对非肿瘤组织中，HOP和核不均一核糖体蛋白Cl/C2的双阳性率仅为1.4%(1/70)。参考文献-1.Thorgeirsson，S.S.&Grisham，J.W.Molecularpathogenesisofhumanhepatocellularcarcinoma.Waf31，33946(2002).2.Moradpour，D.&Blum，H.E.Pathogenesisofhepatocellularcarcinoma.￡wz*GaW/*oe/^e/*o/17，477-83(2005).3.Kim，J.etal.Proteomeanalysisofhumanlivertumortissuebytwo-dimensionalgelelectrophoresisandmatrixassistedlaserdesorption/ionization-massspectrometryforidentificationofdisease-relatedproteins.五/e"ra//2o/^/s23，4142-56(2002).4.Park,K.S.etal,Proteomicanalysisandmolecularcharacterizationoftissueferritinlightchaininhepatocellularcarcinoma,//e/她/ogy35，1459-66(2002).5.Park,K.S,Cho，S.Y"Kim，H.&Paik，Y.K.Proteomicalterationsofthevariantsofhumanaldehydedehydrogenaseisozymescorrelatewithhepatocellularcarcinoma./"/Cawce/*97，261-5(2002).6.Kim，^V.etal.ComparisonofproteomebetweenhepatitisBvirus-andhepatitisCvirus-associatedhepatocellularcarcinoma.C7/"Ca/cer/es9，5493-500(2003).7.Lim，S.O.etal.Proteomeanalysisofhepatocellularcarcinoma.B/oc/^w丑/o/AjasCoot附w"291,1031-7(2002).8.Takashima,M.etal.OverexpressionofalphaenolaseinhepatitisCvirus-relatedhepatocellularcarcinoma: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