专利名称：实蝇分类检测生物芯片、检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫分类检测技术，特别是涉及实蝇科的分类检测生物芯片、检测方法以及试剂盒。
背景技术：
地中海实蝇Ceratitis capitata和桔小实蝇Bactrocera dorsalis是双翅目Diptera，实蝇科Tepheitida昆虫。这两种昆虫是世界上公认的农业大害虫，食性杂寄主，非常广泛，主要危害水果和蔬菜。
地中海实蝇和桔小实蝇分别是我国进境植物检疫禁止进境的危险性害虫。地中海实蝇是一种对水果和蔬菜最具破坏性的危险性有害生物，可以危害所有对人类有价值的水果作物(已报道352种)，被称为“果蔬头号杀手”。地中海实蝇原产西非，现已随果蔬等传播到世界90多个国家和地区。地中海实蝇曾使地中海地区一些国家种植的核果受害率高达100％，希腊的柑橘损失50％，意大利的杏、苹果和柑橘损失高达80％；自1975年地中海实蝇传入美国加利福尼亚州以来，1986-1991年每年都有发生，期间共进行了10多次大规模的根除行动，耗资达1.5亿美元，与此同时，世界上34个国家和地区中断了与美国的水果、蔬菜的贸易关系，使美国蒙受巨大的经济损失。
桔小实蝇寄主范围很广泛，是一种严重的果蔬害虫。可为害柑桔、橙、番石榴、芒果、桃、番荔枝、枇杷、木瓜、黄皮、沙田柚、杨桃、火龙果、龙眼、荔枝、黄皮、香蕉、咖啡、李、杏、樱桃、番茄、茄子、辣椒等250余种水果和蔬菜。该虫现分布美国(夏威夷)和亚洲部分地区(中国南部、印度、斯里兰卡、尼泊尔、不丹、缅甸、泰国、老挝、越南、柬埔寨等)，近几年我国的实蝇监测结果表明，桔小实蝇在我国的分布有向长江以北扩散的迹象，我国农业部已公布上海已是桔小实蝇的分布区，桔小实蝇问题也是世界果蔬贸易最常用的技术壁垒措施之一，我国因部分地区是桔小实蝇疫区而导致水果和蔬菜出口受到许多国家的限制，经济损失巨大。
在亚洲太平洋地区，已知的桔小实蝇复合种达75种之多，其中有重要经济意义的有8种，较为常见的5种包括B.(B.)dorsalis及其四个重要复合种(木瓜实蝇B.(B.)papayae、杨桃实蝇B.(B.)carambolae、菲律宾实蝇B.(B.)philippinensis、芒果实蝇B.(B.)occipitalis复合种之间形态学差异非常小，不易区分开来，桔小实蝇复合种的分类鉴定一直是实蝇科害虫的难点之一，国内外专家意见还未取得完全一致。
目前实蝇的种类鉴定方法多数采用传统的形态学鉴定，主要是通过成虫的形态特征来鉴定种类，而不能对幼虫及卵进行鉴定，而且对近源种间的鉴定存在误差。但在口岸检疫中截获的主要以幼虫和蛹等虫态为主，果实蝇属的幼虫、蛹的特征非常相似，难以鉴定到种，传统的方法是将幼虫或蛹饲养至成虫再作种类鉴定，这一过程需要20天以上的时间且不适合口岸检疫快速验放的工作程序。因此实蝇的快速种类区分是进出口果蔬实蝇贸易和植物检疫中最大的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种能快速、准确、高通量地进行实蝇物种鉴定和区分的生物芯片。
本发明另一目的在于提供一种进行实蝇物种鉴定和区分的检测方法。
本发明再一目的在于提供一种能快速、准确、高通量地进行实蝇物种鉴定和区分的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种实蝇分类检测生物芯片，包括固相载体及固定在载体上的探针，所述探针包括科通用探针、属通用探针以及种通用探针中的至少一种，所述科通用探针为teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述属通用探针选自anst、cera、bact中的至少一种，其分别具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述种通用探针选自以下中的至少一种ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分别具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
优选的，所述探针还包括亚属通用探针和/或复合种/近缘种特异探针；所述亚属通用探针选自subbact、subzeug中的至少一种，其分别具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述复合种/近缘种特异探针选自以下中的至少一种caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分别具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
进一步优选的，所述探针还包括定位探针、阳性对照探针、阴性对照探针中的至少一种。
所述定位点探针具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述阳性对照探针具有如序列表中Seq ID No.57所示的序列；所述阴性对照探针具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
本发明还公开了一种实蝇分类鉴定方法，所述方法包括步骤从实蝇科昆虫卵、幼虫、蛹或成虫提取基因组DNA，用通用引物COI3/COI5进行PCR扩增，将得到的PCR产物与上述的实蝇分类检测生物芯片杂交，所述通用引物COI3/COI5分别具有如序列表中SeqID No.59～60所示的序列。
所述PCR扩增过程中利用荧光掺入法进行荧光标记PCR扩增。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40个循环；72℃/5min。
本发明还公开了一种实蝇分类检测试剂盒，所述试剂盒含有上述的实蝇分类检测生物芯片。
由于采用了以上的方案，使本发明具备的有益效果在于本发明的生物芯片，通过选用实蝇科通用探针、属通用探针以及种特异探针，或者进一步选用亚属通用探针以及复合种/近缘种特异探针，能够快速、准确、高通量的鉴定实蝇物种，并且不仅对实蝇成虫，对实蝇卵、幼虫以及蛹也能实现准确分类鉴定。
图1是32种实蝇分类检测生物芯片探针点阵示意图(15×16)。
图2是桔小实蝇五个复合种分类检测生物芯片探针点阵示意图(8×16)。
图3为地中海实蝇及其近缘种分类检测生物芯片探针点阵示意图(6×16)。
具体实施例方式
在本发明的技术之前，虽然AFLP和PCR-RFLP、特异性引物PCR和SYBR Green实时荧光PCR技术等分子生物学方法先后被尝试应用于实蝇的分类鉴定，但只能对单个实蝇或少数种类的鉴定和区分，还未建立大规模、高通量的实蝇鉴定方法。生物芯片技术以其可高通量、高灵敏度和高特异性等优势可解决实蝇种类多，复合种形态学鉴定难以区分的问题，是一种理想的实蝇分子鉴定技术平台。用生物芯片技术不仅能在不同虫态水平快速、准确进行物种分子鉴定，而且能快速、准确、高通量的进行实蝇物种鉴定和区分。
本发明的生物芯片，通过选用实蝇科通用探针、属通用探针以及种特异探针，或者进一步选用亚属通用探针以及复合种/近缘种特异探针，能够快速、准确、高通量的鉴定实蝇物种，并且不仅对实蝇成虫，对实蝇卵、幼虫以及蛹也能实现准确分类鉴定。
本发明根据我国新修订的进境植物检疫性病虫杂草名录，并结合我国口岸植物检疫危险性实蝇的截获频率、国内外实蝇的发生危害情况，拟定了地中海实蝇和桔小实蝇等危险性实蝇(包括3属12亚属32种)的生物芯片检测方法，32种实蝇种类名录如下地中海实蝇Ceratitis(C.)capitata、纳塔尔实蝇Ceratitis(Pterandrus)rosa、非洲芒果实蝇Ceratitis(Ceratalaspis)cosyra；桔小实蝇Bactrocera(Bactrocera)dorsalis、木瓜实蝇Bactrocera(B.)papayae、杨桃实蝇Bactrocera(B.)carambolae、菲律宾实蝇Bactrocera(B.)pilippinensis、芒果实蝇Bactrocera(B.)occipitalis、番石榴实蝇Bactrocera(B.)correcta、蒲桃实蝇Bactrocera(B.)albistrigatus、短条面包果实蝇Bactrocera(B.)frauenfeldi、迪奥氏实蝇Bactrocera(B.)diospyiri、大洋洲桔实蝇Bactrocera(B.)curvipennis、辣椒实蝇Bactrocera(B.)latifrons、香蕉实蝇Bactrocera(B.)musae、小昆士兰实蝇Bactrocera(Bactrocera)neohumeralis、黑肩角桔实蝇Bactrocera(B.)psidii、昆士兰实蝇Bactrocera(B.)tryoni、三带实蝇Bactrocera(B.)umbrosa、桃实蝇Bactrocera(B.) zonata；扎维斯实蝇Bactrocera(Afrodacus)jarvisi、黄瓜实蝇Bactrocera(Austrodacus)cucumis、橄榄实蝇Bactrocera(Daculus)oleae、艳实蝇Bactrocera(Gymnodacus)calophylli、日本南瓜实蝇Bactrocera(Paradacus)depressa、平展实蝇Bactrocera(Paratridacus)expandens、瓜实蝇Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae、石垣岛实蝇Bactrocera(Z.)ishigahiensis、具条实蝇Bactrocera(Z.)scutellata、南瓜实蝇Bactrocera(Z.)tau、墨西哥按实蝇Anastrepha ludens、西印度按实蝇Anastrepha obliqua。
下表1中列出了本发明所用到的探针。
表1实蝇生物芯片探针
上述表1中的检测探针均为20～30nt的寡核苷酸，序列分别为实蝇科、属、种的特异性序列，能够准确、快速地检测出包含这些特异性序列的不同种类实蝇，实现实蝇的分类鉴别。这些检测探针的5’端氨基修饰。
本发明的生物芯片中，除了上述检测探针外，通常还可以包括定位点探针、阳性对照探针以及阴性对照探针等质控探针。本发明定位点探针、阳性对照探针以及阴性对照探针优选用以下表2中的序列。表2中，定位点探针是一条30nt的寡核苷酸，序列与现知的实蝇序列无同源性，3′端氨基修饰，5′端Cy3荧光标记。阳性对照探针是一条20nt的寡核苷酸，序列与现知实蝇序列无同源性，5′端氨基修饰，其作用是监控PCR扩增标记过程和杂交过程是否正常。本发明中的阴性对照是也一条23nt的寡核苷酸，序列与现知实蝇序列无同源性，5′端氨基修饰，其作用是监控杂交过程非特异性结合情况，并作为检测探针位点阳性与否的参照。本发明的生物芯片还优选包括空白对照，本发明中的空白对照是50％DMSO缓冲液，用于检测杂交背景。
表2质控探针序列
本发明生物芯片的固相载体可以选用本领域已知可用的载玻片、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯等。
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1(一)32种危险性实蝇分类检测生物芯片一种地中海实蝇、桔小实蝇等32种危险性实蝇分类检测生物芯片，其是在固相载体介质表面上固定有寡核苷酸探针点阵。每张基片包括四个相同的探针点阵区，每一探针点阵区包括15行16列点阵。每个探针点阵内部分成四个功能探针区，即按实蝇属Anastrepha检测探针区、果实蝇属Bactrocera检测探针区、小条实蝇属Ceratitis检测探针区和质控对照探针检测区(质控对照探针由阳性对照探针、阴性对照探针和空白对照探针组成)。探针点阵第1行和第1列由定位点探针组成，检测探针和质控探针点阵分布如表3及图1所示。检测探针和质控探针的每条探针横向重复3点。检测探针的核苷酸序列及探针特性如表1，质控探针和定位点探针如表2所示。
检测探针包括科通用探针1条、属通用探针3条、亚属通用探针2条、复合种/近缘种探针19条、种特异探针30条。可实现包括实蝇科按实蝇属Anastrepha spp.、果实蝇属Bactrocera spp.和小条实蝇属Ceratitis spp.等三个属实蝇种类的初筛以及地中海实蝇、纳塔尔实蝇、非洲芒果实蝇；桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、番石榴实蝇、蒲桃实蝇、短条面包果实蝇、迪奥氏实蝇、大洋洲桔实蝇、辣椒实蝇、香蕉实蝇、小昆士兰实蝇、黑肩角桔实蝇、昆士兰实蝇、三带实蝇、桃实蝇；扎维斯实蝇、黄瓜实蝇、橄榄实蝇、艳实蝇、日本南瓜实蝇、平展实蝇、瓜实蝇、石垣岛实蝇、具条实蝇、南瓜实蝇；墨西哥按实蝇、西印度按实蝇等32种实蝇的鉴定。
表3.32种危险性实蝇分类检测生物芯片探针排布示意图
(二)生物芯片的制备实蝇生物芯片的制备包括探针点阵的设计、探针的准备、点样、固定、洗片和围栏粘贴等步骤，现分述如下探针点阵的设计每张芯片包括4个相同的探针点阵区，每个探针点阵区根据设计的探针排布(表3)和探针点阵位置(图1)进行点样。每条探针横向重复3点，每点约0.4nL，点直径约200μm，点间距370μm，点样均匀度(SV值)约为7％。
探针的准备探针用50％DMSO点样缓冲液溶解，浓度为50μM，按探针点样的顺序将探针溶液(100μL)加入96孔板。
点样利用点样仪(GeSim NANO plotter 2)将各寡核苷酸探针固化在醛基化玻璃片，经过水合、固定和洗片，获得带探针矩阵的芯片。每张基片包括四个相同的探针点阵区(15×16)，每个探针点阵内部分成四个功能探针区，即按实蝇属Anastrepha检测探针区、果实蝇属Bactrocera检测探针区、小条实蝇属Ceratitis检测探针区和质控对照探针检测区(由阳性对照探针、阴性对照探针和空白对照探针组成)。探针点阵第1行和第1列由定位点探针组成。探针由北京奥科生物技术有限公司合成和标记。
固定点样后将基片放在保湿盒37℃恒温固定12小时以上。
洗片固定后的基片先在0.2％SDS洗液中搅拌清洗2min；水中搅拌清洗2min，重复三次；然后在0.2％NaBH4封闭液中搅拌封闭5min；再用去离子水中搅拌清洗2min，重复三次，2000rpm离心2min，晾干。
预扫描点完片针的芯片，放入GenePix4200A基因芯片扫描仪，用远红外光区532nm对基因芯片进行预扫描质检，通过软件GenePix Pro5.0(或更高的版本)分析芯片点样结果，主要检查定位点和检测探针位点的均匀性，有无少点或漏点探针等。
围栏粘贴利用芯片粘贴工具将四孔芯片围栏小心贴在芯片正面，放入芯片盒，避光室温保存。
(三)32种危险性实蝇分类检测方法1、实蝇基因组DNA的提取利用动物/昆虫DNA提取试剂盒或其它相关方法获得实蝇标本基因组DNA，DNA模板必须满足下游PCR扩增等实验的要求。实蝇基因组DNA推荐Dneasy Tissue Kit(QIAGEN德国)提取方法，从卵、幼虫、蛹或成虫部分组织如腹部等实蝇样本中均可提取得到。
2、荧光标记PCR扩增分别用实蝇科mtDNA COI基因通用引物COI3/COI5(表4)，利用荧光掺入法进行荧光标记PCR扩增，即在PCR扩增体系中加入含Cy3/Cy5-dCTP。PCR反应体系如表5，其中体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。标记PCR反应条件94℃/1.5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/30s，40个循环；72℃/5min。引物由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR扩增片段长度为430bp。
表4荧光标记PCR引物序列
表5荧光标记PCR反应体系
3、标记PCR产物与芯片的杂交反应分别各取荧光标记的PCR产物和50℃预热的杂交缓冲液(1∶1的10×SSPE与2％SDS)10μl混合(表6)，95℃变性5min后，迅速放入冰水混合物中冰浴5min。
表6杂交反应体系
在芯片杂交盒(北京博奥)两侧小槽中加入200μL去离子水(保持杂交盒内湿度)，将已制备完备的芯片(制备方法参见上文)正面朝上放进杂交盒中，对准方向放入4围栏盖片，通过加样孔将冰浴的荧光标记PCR产物和杂交液混合物一次注入，使其充满盖片和芯片之间空隙，封闭杂交盒，置于46℃恒温环境3小时。
杂交完毕后弃去盖片，芯片探针面向下在少量50℃预热的杂交洗液I(表7)中漂去残余杂交液(注意避免四个矩阵的杂交液交叉污染)，在42℃预热的杂交洗液I搅拌清洗2min，再在50℃预热的杂交洗液II搅拌清洗2min，2000rpm离心1min，置暗盒室温保存。
表7芯片杂交洗液
4、芯片扫描在基因芯片扫描仪(GenePix4200A，Axon)在远红外光区532nm处对基因芯片进行扫描，PMT值为800。再通过软件GenePix Pro 5.0分析芯片扫描的结果，得出相关的数据，并保存。
5、数据分析和信号判读杂交信号依据下述原则进行判读(1)每个检测点信号值＝该点荧光强度值-该点背景强度值；(2)空白对照平均信号值＝3个空白对照点信号值的平均值；(3)阴性对照平均信号值＝3个阴性对照点信号值的平均值-空白对照平均信号值；(4)每条探针的每个检测点信号值—空白对照平均信号值＞10倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性；(5)每条探针的3个重复检测点均为阳性即判读该条探针为阳性；(6)如定位探针部分或全部为阴性，则表明探针与片基结合有问题，实验结果不准确；(7)如阳性对照为阴性，则表明扩增标记或杂交环节存在问题，实验结果不准确；
6、结果判定原则在质控探针和定位点探针均正常情况下，检测结果和判断原则如下当teph出现阳性信号，判定为实蝇科Tephritidae；Anastepha属实蝇的鉴定当teph，anst同时出现阳性信号，判定为按实蝇属Anastrepha spp.；当teph，anst，anlu同时出现阳性信号，判定为墨西哥按实蝇Anastrepha lundes；当teph，anst，anob同时出现阳性信号，判定为西印度按实蝇Anastrepha obliqua。
Bactrocera属实蝇的鉴定当teph，bact同时出现阳性信号，判定为果实蝇属Bactrocera spp.；当teph，bact，subbact同时出现阳性信号，判定为果实蝇亚属Bactrocera sp.；桔小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇和芒果实蝇的结果判定见以下实例2。
当teph，bact，subbact，coza.，bbco-1，bbco-2同时出现阳性信号，判定为番石榴实蝇Bactrocera correcta；当teph，bact，subbact，coza，bbzo-1，bbzo-2同时出现阳性信号，判定为桃实蝇Bactrocera(B.)zonata；当teph，bact，subbact，bbal同时出现阳性信号，判定为蒲桃实蝇Bactrocera(B.)albistrigatus；当teph，bact，subbact，bbdi同时出现阳性信号，判定为迪奥氏实蝇Bactrocera(B.)diospyiri；当teph，bact，subbact，bbla-1，bbla-2同时出现阳性信号，判定为辣椒实蝇Bactrocera(B.)latifrons；当teph，bact，subbact，bbfr同时出现阳性信号，判定为短条面包果实蝇Bactrocera(B.)frauenfeldi；当teph，bact，subbact，bbps同时出现阳性信号，判定为黑肩角桔实蝇Bactrocera(B.)psidii；当teph，bact，subbact，tyne，bbne同时出现阳性信号，判定为小昆士兰实蝇Bactrocera(B.)neohumeralis；当teph，bact，subbact，tyne，tycu同时出现阳性信号，判定为昆士兰实蝇Bactrocera(B.)tryoni；当teph，bact，subbact，bbcu同时出现阳性信号，但tyne，bbne不出现信号，判定为大洋洲桔实蝇Bactrocera(B.)curvipennis；当teph，bact，subbact，bbmu同时出现阳性信号，判定为香蕉实蝇Bactrocera(B.)musae；当tcph，bact，subbact，bbum同时出现阳性信号，判定为三带实蝇Bactrocera(B.)umbroa；当teph，bact，subbact，baja同时出现阳性信号，判定为扎维斯实蝇Bactrocera(Afrodacus)jarvisi；当teph，bact，subbact，bacu-1，bacu-2同时出现阳性信号，判定为黄瓜实蝇Bactrocera(Austrodacus)cucumis；当teph，bact，subbact，bgca同时出现阳性信号，bbcu也出现信号，判定为艳实蝇Bactrocera(Gymnodacus)calophylli；当teph，bact，subbact，bpde同时出现阳性信号，但bgca，bbcu不出现信号，判定为日本南瓜实蝇Bactrocera(Paradacus)depressa；当teph，bact，subbact，bpex同时出现阳性信号，判定为平展实蝇Bactrocera(Paratridacus)expandens；当teph，bact，subbact，bdol-1，bdol-2同时出现阳性信号，判定为橄榄实蝇Bactrocera(Daculus)oleae；当teph，bact，subzeug同时出现阳性信号，判定为亚属Zeugodacus sp.；当teph，bact，subzeug，tacu，bzta同时出现阳性信号，判定为南瓜实蝇Bactrocera(Z.)tau；当teph，bact，subzeug，tacu，bzcu-1，bzcu-2同时出现阳性信号，判定为瓜实蝇Bactrocera(Z.)cucurbitae；当teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2同时出现阳性信号，判定为具条实蝇Bactrocera(Z.)scutellata；teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2，bzis同时出现阳性信号，判定为石垣岛实蝇Bactrocera(Z.)ishigahiensis；Ceratitits属实蝇的鉴定当teph，cera同时出现阳性信号，判定为小条实蝇属Ceratitis spp.；当地中海实蝇、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇的结果判定见以下实例3。
实施例2 桔小实蝇五个复合种分类检测生物芯片及其检测方法桔小实蝇B.(B.)dorsalis及其四个重要复合种(木瓜实蝇B.(B.)papayae、杨桃实蝇B.(B.)carambolae、菲律宾实蝇B.(B.)philippinensis、芒果实蝇B.(B.)occipitalis)生物芯片检测探针排布如表8及图2所示。探针包括科通用探针1条、属通用探针1条、亚属通用探针1条、复合种特异探针6条、种特异探针2条，一组质控探针(阳性、阴性和空白对照探针)和定位点探针。探针点阵如图2，检测探针和质控探针的每条探针横向重复3点。探针序列参照表1、表2。上述探针可实现果实蝇属Bactrocera spp.种类初筛和区分鉴定桔小实蝇五个复合种。
表8桔小实蝇五个复合种生物芯片检测探针排布示意列表
除探针排列方式以外，该实施例中桔小实蝇五个复合种生物芯片的制备及检测方法与实施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本实施例的生物芯片对桔小实蝇五个复合种进行分类检测时，结果判定按照以下描述的方法进行。
在质控探针和定位点探针均正常的情况下，检测结果和判断原则如下当teph出现阳性信号，判定为实蝇科Tephritidae；当teph，bact同时出现阳性信号，判定为果实蝇属Bactrocera spp.；当teph，bact，subbact同时出现阳性信号，判定为果实蝇亚属Bactrocera sp.；当teph，bact，subbact，dor-comp-1同时出现阳性信号，判定为桔小实蝇五个复合种Bactrocera dorsalis complex；当teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同时出现阳性信号，判定为杨桃实蝇Bactrocera carambolae；当teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同时出现阳性信号，判定为菲律宾实蝇Bactrocera philippinensis；当teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-6同时出现阳性信号，判定为桔小实蝇Bactrocera dorsalis；当teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5，dor-comp-6同时出现阳性信号，判定为木瓜实蝇Bactrocera papayae。
当teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-4，dor-comp-6，bboc-1，bboc-2同时出现阳性信号，判定为芒果实蝇Bactrocera occipitalis；
实施例3 地中海实蝇及其近缘种分类检测生物芯片及其检测方法地中海实蝇C.capitata及其二个近缘种纳塔尔实蝇C.rosa和非洲芒果实蝇C.cosary生物芯片检测探针排布如表9所示。探针组除定位点探针外，还包括科通用探针1条、属通用探针1条、近缘种特异探针2条、种特异探针4条和一组质控(阳性、阴性和空白对照)探针。检测探针、质控探针和定位点探针的探针点阵如图3所示，检测探针和质控探针的每条探针横向重复3点。上述探针组可实现小条实蝇属Ceratitis spp.种类初筛和地中海实蝇、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇的种类鉴定。
表9地中海实蝇及其近缘种生物芯片检测探针排布示意列表
除探针排列方式以外，该实施例中地中海实蝇及其近缘种生物芯片的制备及检测方法与实施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本实施例的生物芯片对地中海实蝇及其近缘种进行分类检测时，结果判定按照以下描述的方法进行。
在质控探针和定位点探针均正常情况下，检测结果和判断原则如下当teph出现阳性信号，判定为实蝇科Tephritidae.；当teph，cera同时出现阳性信号，判定为小条实蝇属Ceratitis spp.；当teph，cera，caro，cpro同时出现阳性信号，判定为纳塔尔实蝇Ceratitis rosa；当teph，cera，caco-1，caco-2，ccco同时出现阳性信号，判定为非洲芒果实蝇Ceratitiscosyra；当teph，cera，caro，caco-1，caco-2，ceca-1，ccca-2同时出现阳性信号，判定为地中海实蝇Ceratitis capitata.
实施例4 实蝇生物芯片的检测试剂盒本发明提供了对实蝇科昆虫卵、幼虫、蛹和成虫快速鉴定或初筛的生物芯片检测试剂盒。试剂盒包括试剂和芯片。根据需要，芯片可以选用实施例1～3中的任意一种芯片。
试剂盒组成与贮存条件实蝇芯片试剂盒由芯片、芯片盖片、标记PCR试剂、阳性对照样品、2×杂交缓冲液等组分组成，同时还附1份使用手册，各组分的数量或容积、贮存条件见表4。
表10实蝇芯片检测试剂盒
实蝇芯片试剂盒可实现地中海实蝇及其近缘种的鉴定和区分、桔小实蝇5个复合种的鉴定与区分，同时还可实现32种危险性实蝇的种类鉴定和按实蝇属Anastrepha、果实蝇属Bactrocera和小条实蝇属Ceratitis三个属实蝇的种类初筛。试剂盒具有快速、灵敏和高通量并行检测的能力，检测结果稳定可靠，可应用于出入境检验检疫系统、食品卫生监督系统以及农业植保部门对实蝇的检测和监控工作，也可用于进行实蝇物种鉴定和区分。
实验例 实蝇生物芯片检测芯片及试剂盒在检验检疫中的应用实蝇生物芯片的主要检测对象是从水果蔬菜中发现的实蝇类卵、幼虫、蛹和成虫等，其中卵、幼虫和蛹不能作为常规方法中种类鉴定的依据，需经过实验室饲养到成虫才能最后鉴定其种类；上述实蝇样品用实蝇生物芯片检测的结果，可以与用从卵、幼虫和蛹人工饲养的成虫鉴定结果比较，检验生物芯片检测的准确性。成虫则可用整头或部分虫体进行种类复合性检测，如发现为地中海实蝇需要复核检测时，可用实蝇生物芯片过到上述目的。
实蝇芯片检测虫样的收集和种类鉴定。举例说明进口龙眼实蝇检疫鉴定。从进口泰国龙眼检疫中发现一个虫果有实蝇卵27粒，收集5-8粒卵，用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品，其余卵粒接种在龙眼果实上，26-28℃培养2-3天，卵孵化成幼虫，期间补充幼虫所需的寄主(新鲜龙眼)，待幼虫长成2-3龄，取幼虫2-3头(用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品)，其余幼虫继续饲养一周左右后老熟幼虫化蛹，取蛹1-2头(用无水酒精浸泡-4℃保存用于实蝇芯片检测样品)；其余继续饲养，10-15天蛹羽化成虫并确保形态特征成熟稳定，成虫置体视显微镜鉴定为桔小实蝇Bactroceradorsalis。
期间，将从泰国龙眼上收集的实蝇的卵、幼虫和蛹样品分别按照实施例1中所描述的方法进行分类检测，生物芯片检测与结果判定同样为桔小实蝇。
采用相同方法验证其余31种实蝇，结果均证明采用本发明的生物芯片检测方法进行分类的结果与传统形态学鉴定结果一致，但比传统方法更加快速、准确且易于推广应用。
序列表<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心<120>实蝇分类检测生物芯片、检测方法及试剂盒<130>0610867<160>60<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>teph探针<400>1agcaaagact gctcctattg ataat25<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anst探针<400>2ggaagtgtgc tactacataa taagtatcg29<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cera探针<400>3agctggtgag tagtttaatt gtg 23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bact探针<400>4cacaatatgg ctggtgaata gttt 24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subbact探针<400>5gggtatcagt gaacgaatcc t21<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subzeug探针<400>6aatgagctac tacgtagtaa gtgtc25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caro探针<400>7cgttaaacct ccaactgtaa a 21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-1探针<400>8atagctgggg aataatttaa ttg 23<210>9
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-2探针<400>9ggggaataat ttaattgagt ccc 23<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-1探针<400>10ataatagcaa agattgctcc tattga26<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-2探针<400>11ccgataaata tgataatgaa ctgactt 27<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-3探针<400>12ttactccgat agacatgata ataaattg 28<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>dor-comp-4探针<400>13ctacgtaata tgtgtcatga agaa 24<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-5探针<400>14aaaccctagg gcttacaata tgg 23<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-6探针<400>15atcatttagg attcaatact agccc 25<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tyne探针<400>16agtgggtacc agtgaacaaa c 21<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tycu探针<400>17ctcatagcat agctggggaa taa23<210>18
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbcu探针<400>18aaaagtggat accagtgaac aaatc 25<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>coza探针<400>19caatgaatta gctaggacaa ctcct 25<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tacu探针<400>20tgaagaataa tatcaacaga agagt 25<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>sais-1探针<400>21ataaatatga tgataaattg gctt 24<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>sais-2探针<400>22ataatgtcta cggaagaatt agc 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bpde探针<400>23atgaattagc aaggacgact c 21<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-1探针<400>24gctcataaca tagctggtga ataatt 26<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-2探针<400>25ccagttaatc ctccgactgt aaa23<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccca-1探针<400>26agaacaacgc ccgttaaacc20<210>27
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccca-2探针<400>27aacaaatcct gctatgatag caaat25<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccco探针<400>28ctgttaaacc cccaactgtg a21<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cpro探针<400>29acataatgga agtgtgctac aac 23<210>30<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anlu探针<400>30gtaaataaga agacaaaccc tagagct 27<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>anob探针<400>31cagatgagtt agcaagtatt actccag27<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-1探针<400>32tatgataatg aactgacttt ttaatc 26<210>33<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-2探针<400>33ctccgataaa tatgataatg aactgac27<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbal探针<400>34gtcctgtaaa tagcgggtat caa 23<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbdi探针<400>35gaaatgtgcc acgacatagt a 21<210>36
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbla-1探针<400>36tatcgttggg gaataattca att 23<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbla-2探针<400>37tttagtcagg ttgggtttag ta22<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbfr探针<400>38tttagtacta atcctgtaaa tagtgg26<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbne探针<400>39tagttgagtg ccgtgtaatg t 21<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bbps探针<400>40ccctattgat aacacatagt gga 23<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<223>bbco-1探针<400>41gaaatgagca acaacataat atgtgt26<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbco-2探针<400>42cctgtaaata gagggtatca gtg 23<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbzo-1探针<400>43cgataaatat ggtaataaat tgac 24<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbzo-2探针<400>44aaatgagcta caacataata tgtatcgt 28<210>45
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbmu探针<400>45actccgataa atatggtaat aaattgac28<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbum探针<400>46ctcagatgat aaataggaat aataagattc 30<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bgca探针<400>47actagccctg taaacagtgg gtat24<210>48<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>baja探针<400>48ggatttagta ccagtcctgt gaataa 26<210>49<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bdol探针<220>
<221>misc_feature<223>bdol-1探针<400>49gtctacagaa gaataagcaa gtacaactc29<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bdol探针<220>
<221>misc_feature<223>bdol-2探针<400>50atttagtccg gtgaataggg g 21<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bpex探针<400>51ccagatcggg tttagagtga gt22<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzta探针<400>52tacaaatccg gctataatag caaa 24<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-1探针<400>53caaaacctaa agctcatagc a 21<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-2探针<400>54tactccagtt agtcccccaa 20<210>55<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzis探针<400>55ctataatagc gaacactgct cctata26<210>56<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>定位点探针<400>56tggataccca acttagctat taatagtc 28<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>阳性对照探针<400>57tgagaccaac caactgaaac g 21
<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>阴性对照探针<400>58gactatagta taagcgcggt cca23<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI3引物<400>59ttttagttga ctggctacat tacatgg27<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI5引物<400>60ctggaggggt attttgaagt catt 2权利要求
1.一种实蝇分类检测生物芯片，包括固相载体及固定在载体上的探针，其特征在于所述探针包括科通用探针、属通用探针以及种通用探针中的至少一种，所述科通用探针为teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述属通用探针选自anst、cera、bact中的至少一种，其分别具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述种通用探针选自以下中的至少一种ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分别具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种实蝇分类检测生物芯片，其特征在于所述探针还包括亚属通用探针和/或复合种/近缘种特异探针；所述亚属通用探针选自subbact、subzeug中的至少一种，其分别具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述复合种/近缘种特异探针选自以下中的至少一种caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分别具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的一种实蝇分类检测生物芯片，其特征在于所述探针还包括定位探针、阳性对照探针、阴性对照探针中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种实蝇分类检测生物芯片，其特征在于所述定位点探针具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述阳性对照探针具有如序列表中SeqID No.57所示的序列；所述阴性对照探针具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
5.一种实蝇分类鉴定方法，所述方法包括步骤从实蝇科昆虫卵、幼虫、蛹或成虫提取基因组DNA，用通用引物COI3/COI5进行PCR扩增，将得到的PCR产物与权利要求1～4任意一项所述的实蝇分类检测生物芯片杂交，所述通用引物COI3/COI5分别具有如序列表中Seq ID No.59～60所示的序列。
6.根据权利要求5所述的一种实蝇分类鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增过程中利用荧光掺入法进行荧光标记PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的一种实蝇分类鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增的反应条件为94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40个循环；72℃/5min。
8.一种实蝇分类检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有权利要求1～4任意一项所述的实蝇分类检测生物芯片。
全文摘要
本发明公开了一种实蝇分类检测生物芯片、检测方法及检测试剂盒。本发明的生物芯片，通过选用实蝇科通用探针、属通用探针以及种特异探针，或者进一步选用亚属通用探针以及复合种/近缘种特异探针，能够快速、准确、高通量地鉴定实蝇物种，并且不仅对实蝇成虫，对实蝇卵、幼虫以及蛹也能实现准确分类鉴定。
文档编号G01N21/64GK1995393SQ20061015780
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者余道坚, 章桂明, 李建光, 任鲁风, 杨伟东, 汪万春, 陈枝楠, 周琦, 徐浪 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心