专利名称：二氧化碳浓度的测定方法及二氧化碳诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对二氧化碳浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法测定二氧化碳浓度的方法，以及由此制得的二氧化碳诊断试剂盒，属于二氧化碳浓度分析检测技术领域。
背景技术：
血液内二氧化碳的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。
血液内二氧化碳的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱，单纯代谢性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根[HCO3-]下降或升高，总二氧化碳也随之下降或升高。而单纯呼吸性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。
总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法可分为直接测定和间接推算两类，直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法等。间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PCO2，根据H-H方程的变换形式HCO3-(mmol/L)＝0.03×PCO2(mmHg)×antilog(PH-pka)或HCO3-(mmol/L)＝0.225×PCO2(kPa)×antilog(PH-pKa)，计算获得；式中PH为37℃时测得值，pka在37℃为6.10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。
直接测定法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大，酶法测定适合自动化分析，结果可靠，但目前尚有待深入研究。
检索中国专利发现，专利96190276.0公开了一种用来导出病人血液中气体含量的非侵入性的系统和方法。该系统相应于体积测量呼气中的二氧化碳浓度。然后处理该数据导出动脉血中二氧化碳气体水平。若数据为时间域，处理可将时间域数据转换成体积域。该方法也经迭代评估了多个变量的显著性，所得的关系可供快速和准确地对健康人和患肺病病人进行血中气体含量的测定。专利02282386.7公开了一种医用的血液碳酸氢根测定仪，主要由操作面板、进样检测机构、定滴加液机构、搅拌机构和以单片机为主控元件的电器控制部分组成。其操作面板包括有手动按键、输入键盘和显示屏；进样检测机构由沿圆周均布样本孔且在孔内放置样本瓶的样本转盘和竖直装配在转盘下面的驱动电机及对应于检测位样本孔设置的光电检测器组成；定滴加液机构由配置电机的微量泵和设置于样本孔上方的定滴头及配置在定滴头滴液口处的计滴器组成；搅拌机构由设置在样本转盘下方相应位置的搅拌电机和装配在搅拌电机轴上的磁盘及放置于样本瓶内的搅拌棒组成。
以上专利均与酶法测定无关，从一个侧面说明，此方面的实验研究十分缺乏。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定二氧化碳浓度的方法，以及应用该方法配制而成的二氧化碳诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种酶比色法测定二氧化碳浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有还原型辅酶、甲醛脱氢酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的大小程度/速度，测算出二氧化碳浓度大小。
上述酶比色法测定二氧化碳浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明二氧化碳诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂5～100g/ml，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，甲醛脱氢酶1000～50000U/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型辅酶，可以放在试剂II；试剂II中的甲醛脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，还原型辅酶0.25mmol/L，甲醛脱氢酶10000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定二氧化碳浓度的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的二氧化碳诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二氧化碳浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法测定二氧化碳浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中二氧化碳浓度的大小；
(6)本发明提供的液态二氧化碳诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种二氧化碳浓度的测定方法及二氧化碳诊断试剂盒，运用甲醛脱氢酶(Formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2、EC 1.2.1.43)的作用将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算二氧化碳浓度的大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，NADPH0.25mmol/L，甲醛脱氢酶 10000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为终点法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出二氧化碳浓度的大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 2mol/L，NADH 0.25mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％v/v，甲醛脱氢酶 10000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂I、试剂II的体积比为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.二氧化碳浓度的测定方法，包括以下步骤①将测定的样品与含有还原型辅酶、甲醛脱氢酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的大小程度/速度，测算出二氧化碳浓度大小。
2.二氧化碳诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，甲醛脱氢酶1000～50000U/L。
3.根据权利要求2所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
5.权利要求2～4中任意一种二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂。
6.权利要求2～4中任意一种二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及二氧化碳浓度的测定方法及二氧化碳诊断试剂盒，甲醛脱氢酶的作用将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算二氧化碳浓度的大小。该方法特异性高，测试结果精确、准确性好。试剂盒成分包括缓冲液、甲醛脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，从而进行检测；诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1975430SQ20061016123
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司