专利名称：灯莫注射剂的质量控制方法
技术领域：
本发明是一种灯莫注射剂的质量控制方法，属于对药品生产过程中的质量进行控制的技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、高血压、脑梗塞等均是当今世界上最常见和危害最大的疾病之一，也是危害我国人民健康的常见病、多发病，已成为人口死亡的主要原因之一；据报告，近年来的发病率有逐年增高趋势，而且中、青年患者不断增加。为了达到防治的目的，本申请人曾递交了一份专利申请号为“200410022790X”，名称为“一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法”的申请，涉及一种由灯盏花素与双嘧达莫组方制成的治疗心脑血管疾病中药注射剂，但是药物制剂必须要在保证产品质量稳定可控安全的基础之上，才能不短的更新发展，为了更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要研究控制该注射液质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灯莫注射剂的质量控制方法，针对由灯盏花素∶双嘧达莫＝1∶0.3-3组方制成的药物进行质量控制。这种方法向相关的生产、检测机构提供了检测的指标、检测的手段、技术方法等等；以便更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地。
本发明是这样构成的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容(1)灯莫注射剂的指纹图谱测试，包括以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱；(2)野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的鉴别测试方法；(3)野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的含量测试方法。
所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱采用液相色谱法测试以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测灯莫注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取适量野黄芩苷、双嘧达莫中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇-pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有1～5个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.待测注射剂指纹图谱中有40％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％。
(共有峰面积的比值是指以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值)优选为(1)供试品溶液的制备精密称取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.1mg双嘧达莫的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为pH值3.5的0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至60分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有2～3个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.待测注射剂指纹图谱中有60％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％。
所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂的鉴别方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的薄层色谱鉴别方法取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇或水或乙醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品中的一种或两种，分别加甲醇或乙醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷-甲酸或冰醋酸-水5～60∶0.5～5∶0.2～5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝-乙醇试液，60～150℃烘至斑点显色清晰，置目光或紫外灯365nm或254nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。
优选为取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品中的一种或两种，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以20∶2.5∶1.5的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝-乙醇试液，105℃烘5分钟，置紫外灯365nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂含量的测试方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的含量测定取待测灯莫注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的水或甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈或甲醇-pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液为流动相，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测灯莫注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的80-120％。
优选为取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为pH值3.5的0.02mol/L磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测灯莫注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于8.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的90-110％。
所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂中的灯盏花素、双嘧达莫及其它所有可测成分的总含量占制剂中扣除辅料量和水分量的总固体量的80％以上。
(总固体量是指内容物的重量减去辅料量和水分量后的重量)与现有技术相比，本发明能更加完善的控制以灯盏花素、双嘧达莫制成的注射剂产品的质量。灯莫注射剂成分复杂，如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有一定的片面性，更无法判断其药效的指标成分。因此本申请人制定了以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱来全面控制注射剂的质量。但是由于灯莫注射剂所含的化学成分复杂，对指纹图谱的制定造成干扰，导致部分指纹图谱特征不稳定，所以必须控制流动相等色谱条件，才能得到良好的指纹图谱。也就是说，灯莫制剂的指纹图谱不是将灯盏花素、双嘧达莫的指纹图谱简单叠加就能得到的；由于处方中两部分所含成分相互之间的干扰影响，导致灯莫制剂中灯盏花素、双嘧达莫的指纹图谱特征峰发生改变，采用常规的检测灯盏花素或者双嘧达莫的液相色谱条件，无法使制剂中的主要特征成分在一个条件下出峰，并满足分离度等方面的质控要求，只有采用本发明的条件，选用适宜的参数进行梯度洗脱，才能得到专属、准确、稳定、可操作性强的理想的指纹图谱。
在常规的检测灯盏花素的液相色谱条件乙腈或甲醇-0.1％磷酸水溶液条件下，双嘧达莫出峰时间晚，且峰型差；在常规的检测双嘧达莫的液相色谱条件甲醇-0.1％磷酸氢二钠(磷酸调节pH＝4.6)下，野黄芩苷出峰时间过早，与溶剂峰有重叠，为了增加指纹图谱检测方法的便捷和可操作性，我们考察了多种条件，力争在满足准确性、专属性和稳定性的前提下，采用一个液相条件检测到样品中全部的特征成分，最终，得到了满意的结论。实验证明，本发明的含量测定和指纹图谱检测方法对以灯盏花素、双嘧达莫制成的注射剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。
实验例1以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的制备1、实验仪器、试剂及样品对照品野黄芩苷中国药品生物制品检定所2、色谱条件与系统适应性实验2.1.色谱柱的选择研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均为C18，4.6mm×200mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Diamonsil ODS色谱柱分离效果最好，柱效最高。故最终选用Diamonsil ODS色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)为实验研究柱。
2.2.流动相的选择研究过程中分别考察了(1)甲醇-1％冰醋酸溶液(30∶70)，(2)乙腈-1％冰醋酸溶液(17∶73)，(3)乙腈-0.2％磷酸溶液(26∶74)(4)甲醇-0.2％磷酸溶液(30∶70)，(5)乙腈-0.02moL/L磷酸二氢钠(25％磷酸调pH＝3.5)，溶剂比例为从0分钟至8分钟，乙腈的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，乙腈的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，乙腈的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，乙腈的比例为18％五种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；(4)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(5)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
2.3.检测波长的确定研究中在乙腈-0.02moL/L磷酸二氢钠(25％磷酸调pH＝3.5)(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长203、230、250、283、335下的色谱峰情况，结果显示，在283nm下色谱峰较多，峰形较好，故最终选用283nm作为检测波长。
2.4.仪器、色谱柱及积分参数2.4.1仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent 1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为Diamonsil ODS(4.6mm×200mm，5μm)；柱温30℃，流速1.0ml/min。
2.4.2积分参数Slope Sensitivity1，peak width0.05，最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5％，最小峰高为S峰峰高的5％。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
3、供试品溶液的制备取待测灯莫注射剂适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg双嘧达莫的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
4、参照物溶液的制备野黄芩苷为灯盏花素主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定，因此选定野黄芩苷作为参照物。
5、指纹图谱及技术参数根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例2灯莫注射剂中野黄芩苷、双嘧达莫的薄层色谱鉴别方法为了突出灯莫注射剂的特征，选择了野黄芩苷、双嘧达莫作为其特征斑点，但是由于注射剂中存在较多与野黄芩苷、双嘧达莫结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对野黄芩苷、双嘧达莫进行了展开
经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，醋酸乙酯-甲酸-水(20-2.5-1.5)为展开剂，在此条件下，野黄芩苷、双嘧达莫的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例3灯莫注射剂中野黄芩苷、双嘧达莫的含量测定方法1仪器与试药(1)主要仪器高效液相色谱仪1100series Agilent高效液相色谱仪LC-2010AHT SHIMADZU电子分析天平 BP211D SARTORIUS超声波清洗仪 KQ250DB昆山超声仪器有限公司(2)试药野黄芩苷 中国药品生物制品检定所双嘧达莫 中国药品生物制品检定所甲醇 分析纯北京市通广精细化工公司乙腈 色谱纯CALEDON磷酸 优级纯北京化工厂磷酸二氢钠分析纯上海市振欣试剂厂2色谱条件色谱仪SHIMADZU LC-2010ATH色谱柱Diamonsil(TM)C18，250×4.6mm 5μm；流动相乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠(25％磷酸调PH＝3.5)，梯度洗脱(见下表)
检测波长283nm；柱温30℃；流速1.0ml/min；进样量10μl。
3系统适用性试验对照品溶液的制备 精密称取野黄芩苷、双嘧达莫对照品适量，加甲醇制成每1ml含野黄芩苷0.06mg、双嘧达莫0.05mg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 取本品，混匀，从中取约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
根据上述条件得到野黄芩苷、双嘧达莫、混合对照品、供试品色谱图，其理论板数按野黄芩苷峰计算大于3500。样品中对照品峰与相近峰分离清晰完全，分离度均大于1.5。
4阴性干扰排除试验 为考察辅料是否干扰野黄芩苷与双嘧达莫的测定，除灯盏花素和双嘧达莫外，按处方比例称取其它辅料与供试品溶液同法制成阴性对照品溶液并测定。结果表明，阴性样品对野黄芩苷和双嘧达莫的含量测定无干扰。
5线性关系的考察 精密量取野黄芩苷、双嘧达莫混合溶液(每1ml分别含野黄芩苷0.6288mg、双嘧达莫0.5404mg)0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分置5ml量瓶中，加甲醇定至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。分别以野黄芩苷、双嘧达莫的量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标做图，绘制标准曲线。
野黄芩苷线性关系
回归方程y＝1328159.51x+2697.69相关系数γ＝0.9999结果表明，野黄芩苷在0.242365μg～1.211823μg范围之内线性关系良好。
双嘧达莫线性关系
回归方程y＝2016621.78x+3817.10相关系数γ＝0.9999结果表明，双嘧达莫在0.21616μg～1.08080μg范围之内线性关系良好。
经过计算，野黄芩苷、双嘧达莫标准曲线均为过原点的直线，因此选择外标一点法测定灯莫注射剂中野黄芩苷、双嘧达莫的含量。
6对照品溶液精密度和稳定性试验精密吸取野黄芩苷、双嘧达莫对照品混和溶液每1ml分别含野黄芩苷0.06288mg、双嘧达莫0.05404mg)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别在0、2、6、10、24小时进样测定。
对照品溶液稳定性试验结果
结果表明，对照品溶液精密度良好，在24小时内稳定。
7供试品溶液稳定性试验 精密吸取供试品溶液(2.017mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别在0、2、6、10、24小时进样测定。
供试品溶液稳定性试验结果
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
8重复性试验 取本品装量差异项下内容物，混匀，从中取约20mg(共5份)，精密称定，分置10ml量瓶中，按正文供试品溶液制备和测定项下进行操作。
重复性试验
野黄芩苷平均含量＝4.84mg/支；RSD＝1.00％；双嘧达莫平均含量＝4.07mg/支；RSD＝1.13％。
结果表明，重复性良好。
9加样回收率试验 取本品装量差异项下内容物，混匀，从中取约10mg(共6份)，分置10ml量瓶中；精密称取野黄芩苷对照品15.72mg，双嘧达莫对照品13.51mg，共置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密量取0.5ml(共6份)，分置上述10ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
灯莫注射剂中野黄芩苷、双嘧达莫的含量分别为3.0215％、2.5409％。野黄芩苷加样回收率试验
野黄芩苷平均回收率＝96.54％，RSD＝1.48％；双嘧达莫加样回收率试验
双嘧达莫平均回收率＝100.49％，RSD＝1.71％；10样品含量测定 取三批灯莫冻干粉针(5mg双嘧达莫/瓶)中试样品，按正文所述方法处理，进行测定。
含量测定结果
根据上述结果拟定该灯莫冻干粉针中野黄芩苷的含量不低于4mg/支，双嘧达莫的含量为3.6-4.4mg/支。
具体实施例方式实施例1按照本申请人递交的专利申请号为“200410022790X”，名称为“一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法”的技术制备的制剂；采用液相色谱法测试灯莫注射液中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密量取供试品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg双嘧达莫的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至60分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有2个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射液中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射液指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求计算待测冻干粉针的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00。
实施例2采用液相色谱法测试灯莫粉针中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取待测冻干粉针适量，加乙醇制成每1ml含0.04mg双嘧达莫的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至60分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有2个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测冻干粉针中以以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测冻干粉针指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求计算待测冻干粉针的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00。
实施例3采用液相色谱法测试灯莫注射液中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密量取取待测注射液，加水，摇匀，制成每ml含双嘧达莫0.08mg的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取双嘧达莫适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为甲醇，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由22％升至35％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由35％升至55％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由55％降至22％，从18分钟至60分钟，流动相A的比例为22％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有2个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射液中以以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测注射液的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测注射液指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.待测注射液指纹图谱中双嘧达莫与野黄芩苷峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％。
实施例4冻干粉针中野黄芩苷、双嘧达莫的薄层色谱鉴别方法取待测冻干粉针适量，加甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(20∶2.5∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝-乙醇试液，105℃烘5分钟，置紫外灯365nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例5冻干粉针中野黄芩苷、双嘧达莫的薄层色谱鉴别方法取待测冻干粉针适量，加乙醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品，分别加乙醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(16∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝-乙醇试液，105℃烘5分钟，置紫外灯365nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例6注射液中野黄芩苷、双嘧达莫的薄层色谱鉴别方法取注射液1ml，至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品，分别加乙醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲酸乙酯-冰醋酸-水(20∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝-乙醇试液，105℃烘5分钟，置紫外灯365nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例7冻干粉针(每瓶含双嘧达莫4mg)中野黄芩苷、双嘧达莫的含量测定取待测冻干粉针适量，加甲醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以野黄芩苷、双嘧达莫甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，含量限度应为以下几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于8.0mg(2)每单位量含双嘧达莫的限度为制剂标示量的90-110％。
实施例8冻干粉针中野黄芩苷、双嘧达莫的含量测定取待测冻干粉针适量，加乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以野黄芩苷、双嘧达莫乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流功相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4.0mg(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的80-120％。
实施例9注射液中野黄芩苷、双嘧达莫的含量测定取待测注射液1ml，置10ml量瓶中，加水定至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以野黄芩苷、双嘧达莫甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为甲醇，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(25％磷酸调pH＝3.0)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由22％升至35％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由35％升至55％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由55％降至22％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为22％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测注射液以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的85-115％。
实施例10灯莫注射液(每支含双嘧达莫4mg)中野黄芩苷、双嘧达莫的含量测定取待测注射液适量，加甲醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以野黄芩苷、双嘧达莫甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(25％磷酸调pH＝3.5)，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，含量限度应为以下几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于8.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度为制剂标示量的90-110％。
权利要求
1.一种灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容(1)灯莫注射剂的指纹图谱测试，包括以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱；(2)野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的鉴别测试方法；(3)野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的含量测试方法。
2.按照权利要求1所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱采用液相色谱法测试以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测灯莫注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取适量野黄芩苷、双嘧达莫中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇-pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有1～5个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.待测注射剂指纹图谱中有40％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50％。
3.按照权利要求2所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱采用液相色谱法测试以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.1mg双嘧达莫的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为pH值3.5的0.02mol/L磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至60分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有2～3个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测注射剂中以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.待测注射剂指纹图谱中有60％～100％的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30％。
4.按照权利要求1所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂的鉴别方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的薄层色谱鉴别方法取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇或水或乙醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品中的一种或两种，分别加甲醇或乙醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷-甲酸或冰醋酸-水5～60∶0.5～5∶0.2～5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝-乙醇试液，60～150℃烘至斑点显色清晰，置日光或紫外灯365nm或254nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。
5.按照权利要求4所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂的鉴别方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的薄层色谱鉴别方法取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为供试品溶液；另取野黄芩苷、双嘧达莫对照品中的一种或两种，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以20∶2.5∶1.5的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝-乙醇试液，105℃烘5分钟，置紫外灯365nm下检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
6.按照权利要求1所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂含量的测试方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的含量测定取待测灯莫注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的水或甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈或甲醇-pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钠水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸二氢钾水溶液或pH值为5.0～2.0的0.01mol/L～2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1％～5％冰醋酸溶液或0.1％～5％甲酸溶液或0.02％～5％磷酸溶液为流动相，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测灯莫注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的80-120％。
7.按照权利要求6所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂含量的测试方法为野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种的含量测定取待测灯莫注射制剂适量，加甲醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷、双嘧达莫中一种或两种甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为pH值3.5的0.02mol/L磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至8分钟，流动相A的比例由18％升至30％，从8分钟至15分钟，流动相A的比例由30％升至50％，从15分钟至18分钟，流动相A的比例由50％降至18％，从18分钟至25分钟，流动相A的比例为18％；流速为1.0ml/min，检测波长为283±2nm，柱温为30℃；以外标一点法进行计算，待测灯莫注射制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含野黄芩苷的限度不得少于8.0mg；(2)每单位量含双嘧达莫的限度应为制剂标示量的90-110％。
8.按照权利要求6或7所述的灯莫注射剂的质量控制方法，其特征在于所述注射剂中的野黄芩苷、双嘧达莫及其它所有可测成分的总含量占制剂中扣除辅料量和水分量的总固体量的80％以上。
全文摘要
本发明提供了一种灯莫注射剂的质量控制方法，该方法包括灯莫注射剂的指纹图谱测试(以灯盏花素、双嘧达莫成分特征为主的指纹图谱)，野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的鉴别测试方法，野黄芩苷、双嘧达莫中全部或部分成分的含量测试方法；与现有技术相比，本发明的含量测定和指纹图谱检测方法对以灯盏花素、双嘧达莫制成的注射剂产品的质量控制更为完善、有效，方法精密度、稳定性均较高。
文档编号G01N33/00GK1808114SQ200610200039
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月17日 优先权日2005年2月7日
发明者于文勇 申请人:贵阳云岩西创药物科技开发有限公司