专利名称：食品微生物含量快速检测方法及其检测仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食品微生物含量快速检测方法和设备。
背景技术：
本发明提出的方法和设备主要用于食品有害微生物含量的快速检测。食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称为食源性疾病。随着环境的变迁和抗生素的滥用，虽然人们的居住和卫生条件不断改善，但对病菌的抵抗力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升趋势。因此，对食品中致病菌的检测和检验也就越显出其重要性。但常规的检测大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否已受到污染，培养时间少则2-3天，多至数周，且由于通过目视计算菌落数量，不仅费力耗时，误差也较大。同时，这些检测必须有专门的实验室，由专业技术人员在无菌条件下操作才能完成。这对于具有数以万计的中小型食品生产和加工企业而言，也很难适应。
目前，国内外关于食品微生物含量快速检测技术的研究主要在两个方向进行。第一类是传统活细胞计数方法的改进。主要工作集中在操作规程的简化上。比如开发新一代样品制备系统和实验设备(培养基，实验器具等)，改善培养条件和计数过程自动化等。在国外，有一些研究已经商业化。如在美国被广泛采用的旋转平皿计数法(Spiral Planting Method)，它可使含菌悬液在琼脂表面呈阿基米德螺线状分布，有利于菌落计数。另一种改进方法称作疏水格栅滤膜法(HGMF)，它是用特制的疏水格栅滤膜过滤样品，再放入培养基中培养，以保证所有菌落都是正方型，以方便人工或机械计数。又如直接外荧光过滤技术(DEFT)，它是先用特殊滤膜过滤样品，再经吖啶橙染色后在紫外光显微镜下计数。总的来说，这类方法可使传统方法的检测速度和效率得到提高，但提高程度有限，大多仍需人工计数，有的还需专用的材料或配件。
第二类研究方向则是通过测量微生物在生长和代谢过程中发生的变化，尤其是物理或化学变化来估测微生物的数量。国外在这方面已经成功开发出了一些商用系统，某些已被引入中国，在政府部门，大型食品企业和科研部门中得到应用。按照检测原理的不同，这类技术可大致分为以下几种。
阻抗法(impedence measurement)其原理是通过测量因微生物生长而造成的培养基阻抗变化来间接显示微生物含量。具体的测量系统如法国的Bactometer，它是通过测量细菌产生的离子浓度达到比培养基初始离子浓度低某一值时的历经时间，也称检出时间(DT)来标志样品细菌数量。是可利用电阻，电容或总阻抗来测量离子浓度的三参数系统。能检测出的细菌门栏值是106-107个/毫升。另一产品是Malthus微生物快速分析仪，它是利用细菌将培养基中的大分子代谢为带电荷更多的小分子，从而造成电导增加的物理原理来检测细菌数量。即活体微生物量与电导产生可检测出的改变的时间成反比。所以，污染越严重，检出时间(DT)越短。国内天津大学最近提出利用细菌代谢产生的二氧化碳使培养基电导变化的原理来检测微生物含量的技术，不过尚未有正式产品问世。
ATP生物发光技术(bioluminescence，BL)所有活体生物都含有ATP，当由荧火虫等生物制备的荧光素酶和ATP接触时就产生发光现象，检测发光强度就能间接得到活体微生物含量。利用此原理的检测仪器有十多种，如日本的AF-100，杜邦公司的生物光测量仪。
微量量热法(microcalorimetry)它是通过测量细菌生长和代谢过程中产生的代谢热来间接估算微生物含量，这种方法需要预先绘制热曲线图和特别的微小温度传感器。
溶氧-电流法最近日本DAIKIN公司开发出一种通过检测因微生物消耗培养基中溶解氧导致的电流变化来间接计算样品所含微生物含量的仪器。
放射测量法(radio metric)是将微量的放射性标记引入葡萄糖或其它糖类分子中，细菌生长时糖被利用并放出标记的二氧化碳，从培养装置中导出后，用美国Johnston公司的放射测量仪检测，其放射量与细菌数量成正比关系。
申请号为03158838的中国专利，提出一种应用检测二氧化碳变化来控制微生物的发明。它涉及一种控制盛放在具有顶部空间的容器中的水基聚合乳液的微生物污染的改进方法。改进包括使用直接读取二氧化碳探针监测容器顶部空间中二氧化碳的浓度；当二氧化碳浓度达到一个比大气中二氧化碳浓度高的预定值时，添加抗微生物的药剂。
申请号为200410023232的中国专利公开了一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法及装置。该方法将微生物代谢产物CO2从培养池中引入装有碱性溶液的检测池中，与碱液发生反应引起溶液的电导变化，压电石英晶体传感器检测电导的变化，并以振荡频率的形式反应出来，其振荡频率由频率计数器计数，并送到计算机进行处理。通过测定不同浓度微生物的响应曲线，得出频率时间(FDT)与微生物浓度之间的线性关系，可对微生物进行定量的检测。
一般的非散射红外线二氧化碳检测仪，如美国TSI Incoporated公司的CompuFlow Model8610型二氧化碳检测仪，是采用扩散检测模式，即让空气中的二氧化碳分子自己扩散进入探头后再进行检测。美国专利(5,155,019)和中国申请号03158838中就是采用的这种模式。美国专利(5,155,019)公布了一种通过检测密闭容器里二氧化碳含量来表征容器内样品所含微生物的活动性的方法和设备。在该方法中，材料样本放于一密闭容器内，容器中还放有微生物生长所需碳源材料，通过新陈代谢，这些碳源材料可能转化成二氧化碳。这些出现在容器上部空气中的二氧化碳能被通过容器中空气的红外光束所探测，通过二氧化碳对红外线的吸收特性，检测出二氧化碳的浓度，以此表征样本中微生物的活动性。但是，这种方法采用密闭的容器来检测，操作人员呼吸造成容器空气中二氧化碳浓度的变化也要远大于样品中微生物产生的二氧化碳增值。所以，要正确快速地检测出真正由于微生物代谢产生的二氧化碳并非易事。实际上，由于密闭容器上空二氧化碳浓度的释放量是十分微小、且增长速度极慢、分布又不均，要想使原整个空间中二氧化碳的浓度有能被检测出的变化，必须等待很长时间。因此检测样品中微生物的活动性将非常耗时而又不够准确，不能达到快速检测的目的。
另一个美国专利(4,889,992)公开了一种用红外线自动检测微生物的设备。它通过检测细菌新陈代谢产生的气体来确定微生物的状态。红外线通过一个小瓶的壁，检测出瓶中气体对红外线的吸收，瓶中装有液-气分离系统以方便气体的检测。
总的来说，第二类方法可以大幅度提高检测速度，增加检测精度和减轻检测工作量，是今后的发展方向。但一般需要专门的检测仪器和消耗特殊的检测材料，价格也较昂贵，有些还需预先制定图谱和曲线，使普及推广受到一定限制。必须指出，上述方法的检测时间最快一般也需数小时，这仍然不能满足实际生产的需要，所以研制开发新的更快捷的检测技术和设备是势在必行的趋势。
发明内容本发明提供一种食品微生物含量快速检测方法及其检测仪，第一个目的是提出一种能快速而准确地检测出样品中微生物活动性的方法和步骤。第二个目的是根据此方法和步骤，设计出具体的快速检测设备。解决更快捷的检测食品中有害微生物污染程度的技术问题。
本发明的技术方案这种食品微生物含量快速检测方法，其特征在于采用两套并联的样品检测系统，一套用于食品样品检测，另一套用于对比；两套系统处于相同的环境条件，包括初始温度，初始二氧化碳浓度，采用相同的加热元件进行加热，将两套系统产生的二氧化碳分别经引导管向下输至两套同样的二氧化碳检测装置中进行检测，经检测数据分析处理，比较两套系统的检测结果，其差值与食品样品中微生物含量有正相关关系；根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系得出食品样品中的微生物菌落总数。
该食品微生物含量快速检测方法有以下步骤(1)、按常规方法进行食品的采样和保存，在无菌条件下进行样品制备；(2)、用紫外线灯对样品容器、对比容器以及并联容置空腔进行消毒灭菌处理，并用加热元件同时将样品容器、对比容器和并联容置空腔预热；(3)、将待检食品样品匀浆装入样品容器，将空白对比葡萄糖溶液装入对比容器，并将样品容器和对比容器分别密闭在并联容置空腔中；(4)、排出滞留在样品容器、对比容器、引导管和二氧化碳检测装置内的二氧化碳；(5)、将食品样品和空白对比溶液产生的二氧化碳分别经引导管和水蒸气过滤器向下输入两套二氧化碳检测装置内；(6)、由设置在并联容置空腔的温度探头实时监测样品温度，并输入中央控制单元，保持样品恒温不低于0℃，不高于65℃，同时，两套处于完全相同的环境条件的二氧化碳检测装置将检测到的两组二氧化碳含量数据输入中央控制单元进行数据处理和分析比较处理得出差值，并根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系导出样品中的微生物菌落总数。
上述加热的方式可为传导换热方式，对流换热方式或/和辐射传热方式。
上述二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系用传统的检测方法进行标定，即对同一待检样品，同时采用本发明和传统的方法，传统的方法如国际法或TTC显色法，进行检测，将结果对照，从而导出前者二氧化碳变化特征与后者微生物菌落总数之间的换算关系。
这种食品微生物含量快速检测仪，在机箱上设有连接中央控制单元的电源插座、电源开关和连接外部计算机的接口，其特征在于在机箱内顶部置有紫外线灯，紫外线灯下面置有并联容置空腔，并联容置空腔内放入样品容器和对比容器；在并联容置空腔周围置有加热元件和温度探头，上述温度探头和加热元件分别经控制信号线与中央控制单元的信号输入端连接；样品容器和对比容器分别经上引导管与水蒸气过滤器连通，水蒸气过滤器再经下引导管与二氧化碳检测装置连接；二氧化碳检测装置包括位于进气口的检测管和二氧化碳探头、能将二氧化碳检测信号转变为电压或电流信号的转换电路和出气口，出气口经管道连接换气装置，换气装置的出气口设于机箱上；上述转换电路的数据输出端与中央控制单元的数据输入端连接，中央控制单元的数据输出端与显示屏连接。
上述二氧化碳探头是非散射红外线型探头或电化学型探头。
上述水蒸气过滤器是在管体内充填干燥剂，管体一端有进气口，另一端有出气口，在管体盖的进气口和出气口处设有隔网。
上述加热元件与由电源电路、温度检测放大电路、控制电路和触发器电路连接组成的恒温控制电路连接。
上述样品容器可以是带密封盖的密闭容器，密封盖内的出气口经引导管和水蒸气过滤器与下方的二氧化碳检测装置连通。
上述样品容器也可以是带透气小孔的敞口容器，并联容置空腔有密封盖，每个并联容置空腔底部开有出气口，出气口经引导管和水蒸气过滤器与下方的二氧化碳检测装置连通。
本发明提出的食品中微生物含量的检测原理在一定温度和氧气存在的条件下，样品中活的微生物总会有新陈代谢活动。所以微生物在代谢含碳的营养物质(如葡萄糖或其它糖类碳水化合物分子)时，必然伴随有二氧化碳的放出。食品污染越严重，所含活体微生物含量越大，单位时间内二氧化碳浓度的增量就越大。其释放速率取决于样品的重量、样品中微生物的种类和数量、样品和环境的温度、空气压力和含氧量、空气中已有二氧化碳的浓度等因素。本发明提出一种通过检测样品中微生物代谢二氧化碳的特征来表征食品中微生物含量的方法，并由此设计出相关设备。在此方法中，微生物产生的微量二氧化碳通过专门的引导，在特别设计的浓度梯度，温度梯度和位置梯度的作用下，顺畅地进入二氧化碳检测装置内部的狭小空间，以实现快速检测的目的，直接快速地检测出食物样品中微生物生长和代谢过程产生的二氧化碳浓度的微小变化，检测时间缩短到15-30分钟，解决了快捷检测食品中有害微生物污染程度的技术问题。
下面为部分检测结果(一)、检测食品新鲜程度不同的牛奶(二)、检测参数并联容置空腔温度37+/-1℃；检测时间15分钟；样品葡萄糖浓度20％(重量比)对比培养液无菌葡萄糖水溶液(20％重量比)；二氧化碳变化特征参数15分钟内最大差值；标定方法国际法(三)、检测结果(cfu/ml)
袋装灭菌液态奶(刚开封)＜70袋装灭菌液态奶(倒入样品杯后，在非生产性室内环境放置2小时)550袋装灭菌液态奶(倒入样品杯后，在非生产性室内环境放置24小时)1,150鲜奶(来自个体养牛户，未加热灭菌)1,370鲜奶(来自个体养牛户，煮沸后冷却)85。
从实验结果看，本发明与目前国内外同类技术相比，具有以下技术效果1、本发明检测时间短，在15-30分钟就能显示出二氧化碳浓度的改变。以日本DAIKIN公司的食品细菌自动检查系统DOX为例，其检测结果最快也要6小时才能得到。
2、实验表明，细菌数低于105个/毫升的情况也能很快检测出，这一结果大大优于一般采用阻抗法的系统(如法国的Bactometer和Malthus微生物快速分析仪)的门栏值。
3、不需要任何耗材，可永久性使用。这一点明显优于需不断使用昂贵荧光酶的ATP生物发光技术，也优于需大量一次性电极细胞的日本DOX系统。
4、不需要特别的材料和高端的传感器，所以优于基于微量量热法和放射测量法的系统。
5、结构简单，设计巧妙合理，成本低廉，体积和重量也较小。
6、从价格和操作方面看，适合于不同类型用户的现场快速检测系统。
为提高检测效率，方便操作和仪器维修及校准。本发明采取了以下措施。、采用抽气泵或换气扇，加强前一次检测后累计在探头内的二氧化碳的逸出，使下一次检测能尽快开始。由于探头出口孔小，如让二氧化碳自己扩散出来，需太长的时间。从而降低了检测效率。、将样品容器和并联容置空腔分开，不仅方便操作，也有利于每次检测后的清洁和消毒。如果配备多个备用样品容器，前一次检测时，备用样品容器同时进行消毒和盛装样品，检测间隔时间就可缩短。、将样品容器和检测探头分开，能防止样品污染探头。探头的校准，维修和保养也容易进行。、采用紫外线灯在检测前对样品容器、并联容置空腔等部件进行消毒，防止操作过程的微生物污染。将消毒设施与样品容器和并联容置空腔分开，不仅使检测操作方便，也避免了安全方面的问题。
本发明并不局限于只能用红外线方式来探测二氧化碳的变化。同时，本发明还采用空白对比，温度补偿，环境二氧化碳干扰排除，按食品分类标定等措施来保证高的检测精度。本发明提出的方法和设备不仅可用于食品检测，也能用于其它材料或物质(如土壤，生物组织)的生化检测。
图1是本发明食品微生物含量快速检测仪实施例一的结构示意图。
图2是本发明食品微生物含量快速检测仪实施例二的结构示意图。
图3是采用螺纹口方式密封的样品容器；图4是采用橡胶塞密封的样品容器。
图5是水蒸气过滤器的结构示意图。
图6是一种恒温控制电路的原理图。
图中1-机箱、2-上盖、3-密封盖、4-紫外线灯、5-并联容置空腔、6-样品容器、7-对比容器、8-上引导管、9-加热元件、10-水蒸气过滤器、11-二氧化碳检测装置、12-中央控制单元、13-显示屏、14-温度探头、15-密封圈、16-电源插座、17-电源开关、18-计算机接口、19-换气装置、20-换气装置进气口管道、21-出气口、22-机箱的支撑脚、23-下引导管。61-样品容器壁、62-容器密封盖、63-橡胶密封圈、64-出气口、65-连接头、66-通气管。10-水蒸气过滤器、101-进气口、102-过滤器的管体、103-隔网、104-过滤器出气口、105-干燥剂、106-过滤器管体盖。
201-制冷或制热部件(常用的半导体型元件，当变换电流方向时，其发热面可立即转换为冷却面，其冷热温差可达30℃。代表产品如美国Kitsrus公司的KIT66型元件，由127个P-N结组成，最大功率可达40W)。202-元件开关、203-线路交流电源开关、204-电阻、205-电容、206-整流二极管、207-稳压二极管、208-电解电容。203，204，205，206，207和208组成了电源电路，它为后面的温度检测放大电路，控制电路和RS触发器提供直流12V的电压。
209-二极管、210-继电器、211-电阻、212-发光二极管、213-晶体管(三极管)、214-电阻、215-功能转换开关。209、210、211、212、213、214和215组成了控制电路。
216-和217-是与非门集成电路；218-电阻、219-和220-发光二极管。216、217、218、219和220组成了触发器电路。
221-和222-运算放大器集成电路；223-电阻；224-温度传感器集成电路；225，227和228-电位器；226，229，230和232-是电阻；231-是精密稳压集成电路。从221到232共同组成了温度检测放大电路。
具体实施方式
根据本发明提出的检测原理和技术，可以设计出具体的检测设备。
本发明的检测仪实施例一参见图1，机箱1的下面有支撑脚22。机箱上盖2内装有紫外线灯4，其功能是在正式检测前对并联容置空腔5进行灭菌消毒。紫外线灯4下面有两个相同的并联容置空腔5，并联容置空腔上有密封盖3，密封盖边缘有密封橡胶圈15，其作用是强化密封。每个并联容置空腔底部开有出气口，出气口分别经上引导管8与水蒸气过滤器10连通，水蒸气过滤器再经下引导管23与二氧化碳检测装置11连接。
并联容置空腔5中可分别放入一个样品容器6和对比容器7。样品容器6用来盛待检样品，是带透气小孔的敞口容器，对比容器7用来盛无菌培养液作对比。在其它一些实施例中，并联容置空腔5可为两个以上。样品容器可采用市售的烧杯，也可让厂家批量定制。
另一种检测仪的实施例二参见图2，上述样品容器6和对比容器7也可以是带容器密封盖62的密闭容器，容器密封盖内的出气口分别经上引导管8与水蒸气过滤器10连通，水蒸气过滤器再经下引导管23与二氧化碳检测装置11连接。使样品容器上部空间产生的二氧化碳可直接进入探头被检测。这种设计的优点是当二氧化碳产生的量很小时，也能被检测出来。当采用带密封盖的样品容器时，并联容置空腔5就不用密封和在底部开口，只作为放置样品容器的容器。
与图1所示设计相比，唯一的区别就是样品容器6和对比容器7采用带容器密封盖62的密闭容器，而不是将敞口的样品容器放入密封的放置器。带密封盖的样品容器可以自己制作或请有关厂家按要求定制。图3、图4是其中的两种样品容器实施例的设计方案。
图3的设计是采用螺纹口方式密封的样品容器。图中61是样品容器壁，材质可以是塑料，玻璃或不锈钢。容器密封盖62带有内螺纹，可以由塑料，玻璃或不锈钢制成。63是密封盖内设置的橡胶密封圈，其作用是在样品容器和密封盖相互旋紧后进一步加强密封。64是密封盖内的出气口。23是软质下引导管。65是连接头，检测完成后，很容易取开，换上新的样品容器，开始新的检测。
图4是采用橡胶塞密封的样品容器。其中61是样品容器壁，材质可以是玻璃，不锈钢或较硬的厚壁塑料。容器密封盖62是中空的橡胶塞，要求内壁较厚，与样品容器材质有很好的密封性。66是塞中插入的通气管，23是连接通气管的软质下引导管，65是连接头。
加热元件9的功能是根据需要，对并联容置空腔加热，使待检样品和对比样品在检测过程中保持相对恒定的温度，一般可设为37℃。加热元件9很容易在电子市场上买到，即可以买零件自制，也可请专业厂家定制。
水蒸气过滤器的实施例参见图5，水蒸气过滤器10内装干燥剂105，它通过上引导管8与并联容置空腔连接，其功能是过滤来自样品的水蒸气，防止对检测结果的干扰。水蒸气过滤器通过下引导管23与二氧化碳检测装置11连接。水蒸气过滤器只有在特别情况下(食品含水高，加热温度高)才需要。在检测仪使用一段时间后，可直接打开机箱，替换掉旧的水蒸气过滤器，而不必更换其中的干燥剂。该水蒸气过滤器10是在管体102内充填硅胶颗粒干燥剂105，管体一端有进气口101、另一端有出气口104，在管体盖106与进气口、出气口之间设有隔网103。进气口102通过管道与样品并联容置空腔连接。硅胶是化工，环保部门和实验室里常用的干燥剂，很容易买到，而且可以加热再生，重复使用。隔网3可防止硅胶漏出。出气口104通过管道与二氧化碳检测装置内的二氧化碳检测装置连接。管体盖106是在管体中装填好干燥剂之后盖上此盖，然后密封。
二氧化碳检测装置11包括位于进气口的检测管和二氧化碳探头、能将二氧化碳检测信号转变为电压或电流信号的转换电路和出气口，出气口经管道连接换气装置，换气装置的出气口设于机箱上；上述转换电路的数据输出端与中央控制单元的数据输入端连接，中央控制单元的数据输出端与显示屏连接。可直接向二氧化碳检测仪厂家购买。
上述并联容置空腔壁上置有温度探头14，温度探头14经信号线与中央控制单元12连接。温度探头14的功能是实时检测样品容器并联容置空腔内温度，将数据传回中央控制单元，由预设程序确定是否开动加热元件9。由此保证样品容器并联容置空腔内的恒定温度。如选用的二氧化碳检测装置有温度自动补偿功能，就不需在二氧化碳检测装置附近加额外的温度探头，所以二氧化碳检测装置11可直接将得到的电信号输入中央控制单元12。检测数据经中央控制单元处理后，送入液晶显示屏13显示，同时显示的还有检测时间和日期。
中央控制单元12可采用单板机。如采用型号为89S52的单片机作为该单元，其主频是24兆，可以输入8K的控制程序，A-D转换也可省掉，因单片机已自带此功能。
显示屏13可采用128×128图形点阵液晶显示模块，带中英文字库，可显示8行汉字或英文，有内置T6963C控制器，自带负压和LED背光。可由前述单片机提供的编程，让液晶显示屏自动显示所需的界面(如样品菌落总数和检测时间)。
连接中央控制单元12的电源插座16、电源开关17、可连接外部计算机的接口18设置在机箱上。通过接口可以实现检测仪和外接计算机之间的数据或信息交流。
换气装置19的功能是将上一次检测后积累在二氧化碳检测装置内的高浓度二氧化碳尽快抽出，以开始下一次检测。从而缩短两次检测间的时间间隔。提高检测效率。换气装置的进气口通过管道20连接到二氧化碳检测装置的出气口。抽出的二氧化碳通过换气装置的出气口21排出到机箱外。换气装置19可为换气泵或换气风扇，可采用普通小型常规产品，其启动和关闭时间可编程后由中央控制单元(即单片机)控制。
参见图6，为实现并联容置空腔温度的自动控制，可以直接购买成品的温度控制芯片，也可组装控制电路，将相关编程输入单片机后可实现准确的控制。加热元件的功率调节有多种方式实现。最简单的是用电阻控制输入电流，即用可变电阻来实现。图3显示的是一种恒温控制电路的实施例。
制冷或制热部件201可采用常用的半导体型元件，当变换电流方向时，其发热面可立即转换为冷却面，其冷热温差可达30？。代表产品如美国Kitsrus公司的KIT66型元件，由127个P-N结组成，最大功率可达40W。
开关202、电源开关203、电阻204、电容205、整流二极管206、稳压二极管207、电解电容208组成了电源电路。它为后面的温度检测放大电路，控制电路和RS触发器提供直流12V的电压。
二极管209、继电器210、电阻211、发光二极管212、晶体管(三极管)213、电阻214和功能转换开关215组成了控制电路。
两个与非门集成电路216、217、电阻218、两个发光二极管219、220组成了触发器电路。
两个运算放大器集成电路221、222、电阻223、温度传感器集成电路224、电位器225、227、228、电阻226、229、230、232、精密稳压集成电路231共同组成了温度检测放大电路。
本发明提出下列措施以保证微量的二氧化碳变化能被快速检测出来。
一、选择正确的检测方式本发明采用引导检测模式，即采用引导管将微生物产生的含二氧化碳的气流通过二氧化碳检测装置的进口输入二氧化碳检测装置的检测管内的狭小空间被检测，而不是让其扩散到整个容器的空间里。
另一方面，本发明也可使用其它类型的二氧化碳检测方法(如电化学方法)和相关设备(如北京卓安公司生产的MICRO-J系列的二氧化碳检测装置)，对引导出来的二氧化碳进行检测。为实现将微生物产生的微量二氧化碳直接引导流入二氧化碳检测装置中，本发明采用了下列方法{1}、专门设计的用于盛样品的样品容器对于较干的基本呈固态的样品，样品容器的顶端有开口，样品由此放入，侧面上有数量众多的小孔或者整个侧面直接由网状材料构成，孔的大小以样品材料不掉出样品容器为宜。这样设计的目的是让样品中微生物产生的二氧化碳能直接通过样品容器侧壁逸出筒外。这是因为二氧化碳比重较大，在空气中总是倾向于沉到容器底部。所以如侧壁无孔，筒内下层微生物产生的二氧化碳就只能从顶端开口逸出，这就需要较长的时间，除非采取专门措施，如加热或摇动样品容器。对于液态，浆状或胶状的样品，样品容器壁不能有孔，其大小应设计得使规定量的样品刚好能装下，也就是说，装入样品后，样品容器上部剩余的空间已很小。其目的是使筒中微生物产生的二氧化碳能很快溢出筒外。
{2}、专门设计的用于放置样品容器的容器称为并联容置空腔并联容置空腔的体积和形状应使样品容器能方便放入并可密闭。此外，还有两点需要注意。一是体积不能太大，最好刚大于样品容器的体积。另外一点是并联容置空腔中二氧化碳的出口应尽可能开在并联容置空腔的下部或底部，使从样品容器溢出的因比重较大而沉于并联容置空腔底部的二氧化碳能通过这样的开口顺利流出并联容置空腔，然后经管道进入二氧化碳检测装置。这样的设计能形成一个促进二氧化碳流动的浓度梯度，即当二氧化碳从样品中产生后，样品附近就形成一个二氧化碳的局部高浓度区，它将向周围区域扩散，由于比重较大，所以这种扩散是朝向并联容置空腔的下方进行的。由于并联容置空腔的体积较小，所以并联容置空腔中的二氧化碳浓度将会很快升高，较高浓度二氧化碳将通过连接并联容置空腔出口的管道进入二氧化碳检测装置被检测。在检测期间，探头的出口和扩散口都是关闭的。二氧化碳进入探头后将暂时留在其中。检测完成后，滞留其中的二氧化碳需通过气泵或专门设置的抽风扇被抽出探头，为下一次检测作准备。
{3}、专门设计的加热和温度控制方式美国专利(5,155,019)和美国专利(中国申请号03158838)都没有提出用加热方式来加快检测速度。实验表明，适当加热样品，并将其温度严格控制在一定范围内的方法，确能明显提高检测速度。这是因为提高温度能有效促进样品中微生物的新陈代谢和繁殖速度，促进二氧化碳的产生速率，缩短达到检测仪所需的最低二氧化碳门 值的时间，从而提高检测速度。另一方面，二氧化碳产生速率的增加，使流过检测管的二氧化碳浓度提高，有利于排除环境气氛中原二氧化碳浓度波动造成的影响，提高了检测数据的可靠性。但如加热过度，样品温度太高，则将杀死样品中的部分微生物，使排放二氧化碳的微生物含量明显减少。所以使样品温度保持在一个合适的范围十分重要。一般地说，这个范围可从0℃到65℃，最好在20℃到50℃之间。加热样品的方式有多种，接触式加热是使样品直接与发热元件接触而被加热。非接触式加热又可分为几类，一类以传导换热方式为主，即发热元件从外面直接加热样品容器，热流通过筒壁传到筒内样品中。第二类以对流换热为主，即发热元件先加热流体介质，后者加热样品容器，最后筒中样品被加热。第三类以辐射传热为主，即用电磁波或超声波，在不接触样品或样品容器的情况下加热样品。从加热均匀程度，升温快慢的角度看，第三类方式最好。但必须指出，电磁波，尤其是频率较高的电磁波(如微波)作用于样品，除热效应外，还有非热效应。实验表明，微生物在未达到加热致死的温度之前，比如34℃时，就可能由于微波的非热效应而停止分裂。所以，为保证检测的准确，采用电磁波加热样品必须严格控制加热功率和作用时间。使样品温度最好不超过30℃。
由于样品的加热，必然形成一个从并联容置空腔，引导管道到二氧化碳检测装置之间的温度下降梯度。由于气体的扩散系数受温度影响，温度越高，扩散越快。所以这就有利于二氧化碳从浓度和温度均较高的并联容置空腔快速进入二氧化碳检测器探头。
{4}、专门设计的便于二氧化碳流动的位置梯度。除了上述引导二氧化碳流动的浓度梯度和温度梯度外，在设计中考虑到二氧化碳的比重，还有意设置了位置梯度，即让探头检测管的进气口位置低于样品容器或放置器的出气口位置，探头检测管的出气口位置又低于或等于进气口位置，使得从样品中生成的二氧化碳能一路顺畅地进入探头。进一步加快了检测速度。
由于本发明提出的微生物检测方法与传统的微生物先培养后检测的方式有较大区别。所以其样品的准备工作与常规方式有一定程度的不同。为实现快速而准确的检测，有必要建立适合于本方法的样品标准。其内容如下A、样品的采集和保存可完全按国家有关食品检测规定的采样标准进行。
B、样品的制备与前处理通常食品的理化检测前处理技术很复杂，而微生物检测的样品前处理技术则比较简单。常规的做法是按无菌操作，将采集得到的样品与灭菌溶液(如生理盐水，磷酸盐缓冲液，营养肉汤等)充分混匀后，在研钵中研磨，其稀释液即可供检测。如果样品为肉，鱼等固体，应先剪碎，再用均质器制成匀浆稀释样液后再检测。比如常规的菌落总数检测国际法或TTC显色法都是先称量25克样品，加稀释液研磨成1∶10的均匀液，然后再次稀释成1∶100及1∶1,000的均匀液。检测时选择2-3个适宜的稀释度来进行。这些常规的检测方法都是先控温培养，再用肉眼或放大镜计算营养琼脂板上的菌落数，最后乘上稀释倍数，得到单位体积中的菌落数值。所以如不稀释，由于细菌量太大，琼脂板上的菌落数将多得难以计数。因而得不到正确的结果。而新的利用物理或化学效应的检测方式，由于不需进行菌落计数，所以一般不必稀释。比如法国梅里埃公司的电阻抗快速检测法(Bactometer)中，先将无菌培养基GPM0.6毫升加入样品池，再直接将0.1毫升的样品匀液倒入，盖上盖即可放入检测仪中检测。
本发明的样品的制备与前处理类似于上述电阻抗快速检测法，即将一定量的无菌培养液与一定量的样品匀液混合后倒入样品容器中，盖上盖后即可开始检测。这里的无菌培养液可以是各种含有碳原子的有利于微生物生长的有机物溶液，胶体或混合物，比如一定浓度的葡萄糖溶液。
C、本发明采用的样品标准*对于不易手工研磨均匀的固体食品(如鲜肉，肉制品，鱼虾类水产品，某些瓜果和蔬菜，块茎类，海藻类及干果，坚果等)，先将采集得到的样品剪碎或切碎，再用8,000-20,000r/min的均质机离心1-5分钟，制成糊浆，再以每100克糊浆加入葡萄糖溶液10-120毫升的比例混合成为样品匀浆。葡萄糖溶液的浓度为1-30％(重量比)。检测一次的样品匀浆用量为25-200克。
*对于不易手工研磨，也难以用匀质机处理的固体食品(如干燥的粮食和豆类等)，需先用捣碎机磨成粉后，再与葡萄糖溶液混合成样品匀浆。其混合比例，葡萄糖溶液浓度和匀浆检测用量同上。
*对于容易手工研磨均匀的固体食品(如一般蔬菜，水果，糕点，豆腐及粮食制品)，可直接在无菌研钵中研磨后与葡萄糖溶液混合制成样品匀浆。混合比例，葡萄糖溶液浓度和匀浆检测用量同上。
*对于不含碳酸的液体食品或饮料(如乳类，茶，咖啡，果汁，矿泉水，纯净水等)，按每100克加入葡萄糖1-30克的比例混合成为样品匀液，检测一次的样品匀液用量为25-200克。
*对于固体和液体混合而成的食品(如果酱，蕃茄酱，色拉酱等)，按不含碳酸的液体食品处理。
*对于蛋制品，鲜蛋去壳后按不含碳酸的液体食品处理。粉状或固态蛋制品按上述固体食品处理。
*对于油脂类食品，常温下呈液态的按不含碳酸的液体食品处理。常温下呈固态的(如黄油，人造黄油)，温热软化后按不含碳酸的液体食品处理。
*对于罐筒食品，开罐后分液体和固体分别按上述不含碳酸的液体和固体食品记进行处理。
*对于糖类食品(如砂糖，红糖，水果糖等)，按每10克加无菌纯水20-300毫升的比例制成糖溶液后待检。检测一次的样品用量为25-200克。
*对于冷冻状态的固体食品(如冻肉，冻鱼，冻水饺，冻豆类等)，一般先化冻，待温度升到室温后再按上述固体食品处理。
*对于冰冻成固体的液态食品(如冰棍，雪糕，冰淇淋等)，先溶化成液态后，再按不含碳酸的液体食品处理。
*对于含碳酸的饮料(如可口可乐，汽水等)，不在检测范围内。
由于微生物的二氧化碳生成速率远小于检测人员和环境造成的二氧化碳波动，所以检测精度是成败的关键。
本发明采取以下措施保证检测的准确性和足够的精度。
I、选择高质量的二氧化碳检测装置。首先是探头的类型选择。电化学型的探头精度较好，但使用寿命一般只有数年。非散射红外线型(NDIR)探头工作稳定可靠，寿命可达十年以上，一般档次的这种二氧化碳检测仪(如美国TSI公司的CompuFlow 8610型产品)的分辨率为0.1ppm，精度为+/-50ppm或检测显示数的+/-3％。高档次分析用的检测探头，精度可达5ppm或更低。本发明涉及的检测装置最好采用高精度的电化学型或非散射红外线型探头。此外，当采用两个探头同时检测食物样品和空白对照样品(即只有无菌葡萄糖溶液，没有食品的样品)时，必须考虑两个探头的匹配问题。即二者的分辨率，精度，热敏感性等应尽可能一致。在同样条件下显示的数值应相同。如有微小差别，至少也要保证这种差值在任何情况下都是常数，以便在检测后进行必要的补偿。
II、温度影响的控制和补偿。温度的影响表现在两个方面一是样品容器和并联容置空腔的温度变化会影响二氧化碳的扩散速率，所以样品的加热必须准确控制，使样品容器和并联容置空腔内的温度变化尽可能小。这需要在设计检测仪，选择加热方式和元件时给予充分考虑。温度的另一个影响是对非散射红外线型(NDIR)检测的干扰，一般温度越高，得到的数据越比真实值小，所以必须进行补偿。具体的方法是在二氧化碳探测管内或附近用高灵敏度温度探头检测进入管内的二氧化碳气流温度，找出与预定工作温度(一般是20℃)的差值ΔT(℃)，按下列公式计算补偿值δ(ppm)δ＝+/-0.003ρΔT(1)其中ρ是仪器显示的二氧化碳浓度值(ppm)。需要指出的是，有些二氧化碳检测装置或变送器本身已带有温度补偿功能。
III、环境和检测过程累积的二氧化碳影响的消除。环境二氧化碳浓度的变化主要受测试人员呼吸的影响。呼吸可造成局部区域的浓度高达1,000-2,000ppm。此外，检测过程可能会造成二氧化碳滞留在并联容置空腔，引导管道和二氧化碳检测装置中，也会对下一次检测造成干扰，所以必须消除。在仪器设计时，应给予充分考虑。最简单的做法是，设置换气泵或换气扇，每一次检测前，先将并联容置空腔、引导管和二氧化碳检测装置内残存的二氧化碳抽走。使探头内的二氧化碳浓度稍低于环境浓度，并能在一段时间内保持这一浓度基本不变。所以此时开始检测，可将干扰减小到最小。
IV、检测过程中，设备部件和连接处的严格密封。其目的是保证微生物产生的二氧化碳不外泄，外界空气中的二氧化碳不进入检测探头影响检测精度。
V、水蒸气干扰的消除。二氧化碳气流中的水蒸气会对检测精度造成干扰。如果样品加热温度较高，必然会有少量来自培养液和样品中的水蒸气随二氧化碳气流进入检测管内。克服的方法是严格控制加热温度，决不能过高，最好不超过50？。此外，可在二氧化碳检测装置的检测管进口前加设一水蒸气过滤器，用干燥剂(如硅胶颗粒)充填。使经过其中的水蒸气被充分吸附，而二氧化碳则通过。
VI、采用各种电子滤波和抗电磁干扰措施，使检测噪音和干扰下降到最低程度。
VII、相同条件下的空白对比。所谓空白对比是指采用两套同样的样品检测系统，一套用于正式的样品检测，另一套只用于对比，即在样品容器中不是装样品匀浆，而是只装无菌的葡萄糖溶液。两套系统处于完全相同的环境条件(包括初始温度，初始二氧化碳浓度等)，采用完全相同的设备进行加热，检测和数据分析处理。最后比较结果，其差值就是样品中微生物产生的二氧化碳效应，它应与微生物含量有正相关关系。采用这种方式可以更彻底的克服环境温度和二氧化碳浓度等因素带来的影响。
VIII、严格的标定程序。本发明提出的检测方法得到的是间接的微生物含量表征，为转化为真实的微生物含量，必须用传统的检测方法进行标定，即对同一待检样品，同时采用本方法和传统的方法(如国际法或TTC显色法)进行检测，将结果对照，从而导出前者二氧化碳变化特征与后者微生物菌落总数之间的换算关系。为使换算关系准确可靠，这种标定需注意下列几点*最好按前述样品标准中的方式将食品分类，分别对各类食品进行标定。至少固体和液体食品应分别标定。这样做的好处是使标定更合理而准确。
*同一食品的标定最好在不同条件下(如不同温度时)分别进行多次，以得到最合理的结果。
*同一食品，同样条件下的标定实验，最好也多做几次，以便通过数理统计得到更合理的换算关系。
*最好用两种或两种以上的传统检测方式与本方法进行对比标定，再将结果对照检查，以消除只用一种传统方法存在的不足。
IX、提高进入检测管气流中的二氧化碳浓度。由于传感器都存在一定的灵敏度问题，高的二氧化碳浓度有利于检测精度的提高，而过低的浓度有可能达不到使传感器工作的最低门 值，导致检测信号为零。在本发明中，加大待检样品的量(如从25克增到100克)和对样品进行加热，都将使进入检测管中的二氧化碳浓度提高。
X、操作过程中微生物污染的消除。除在样品制备，装卸，检测等操作中遵守常规的无菌规程外每次检测前，仪器各部件必须彻底消毒杀菌。消毒杀菌的方式有多种，最简单的方法是采用紫外线灯照射，但需保证样品容器和并联容置空腔内不会有照不到的死角。采用光催化灭菌也是一种可考虑的方式，它需要在并联容置空腔和二氧化碳接纳器内表面涂抹一层纳米级的二氧化钛粒子，还需特定波长的紫外光照射。所以不如直接用紫外线杀菌方便。
本发明需对样品中所含微生物产生的二氧化碳效应进行检测，分析处理和存储。比如(a)、将时刻0到时刻t之间分为若干时间间隔，记录每个间隔点进入检测管中的二氧化碳浓度值，即r0，r1，r2，r3，r’i…r’t-1，和rt。时间间隔的长短与检测探头性能相关，可从数秒到数分钟不等。总检测时间t可根据具体食品和所用样品量，样品加热温度而定。可从数分钟到数小时不等。
(b)、记录每个时间间隔点流过检测管的的气流温度，T0，T2，T3，Ti…Tt-1，和Tt。
(c)、根据检测得到的每个时间间隔点的温度数据，按上述公式(1)，计算并存储经补偿修正后的每个时间间隔点的二氧化碳数据r’0，r’1，r’2，r’3，r’i…r’t-1，和r’t。
(d)、计算并存储二氧化碳浓度随时间变化的函数关系曲线，即r’-t曲线。
(e)、计算并存储二氧化碳浓度增长速率随时间变化的函数关系曲线，即(dr’/dt)-t曲线。
(f)、记录时刻ti时的二氧化碳增量r’I-r’0(g)、记录时刻ti时的二氧化碳增长速率(r’I-r’0)/ti(h)、记录时刻ti前二氧化碳浓度的最大值，最小值和它们之间的差值。
(i)、记录时刻ti前二氧化碳浓度的均值(j)、对于空白对比系统，也完全按上述内容进行同样的检测，记录，存储和处理。
(k)、采用数字滤波技术，对检测数据进行处理，剔除不合理的数值，减小噪音干扰，以获得最佳检测结果。
(l)、比较，分析两套系统得到的关系曲线和某些时刻的二氧化碳增量和增长速率，找出主要的差别，以此作为微生物导致的二氧化碳变化特征。
(m)、根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系导出样品中微生物菌落总数，然后存储数据。
本发明提出的检测技术由以下主要步骤构成(1)、按常规方法进行食品的采样和保存，在无菌条件下进行样品制备；(2)、用紫外线灯对样品容器、对比容器以及并联容置空腔进行消毒灭菌处理，并用加热元件同时将样品容器、对比容器和并联容置空腔预热；
(3)、将待检食品样品匀浆装入样品容器，将空白对比葡萄糖溶液装入对比容器，并将样品容器和对比容器分别密闭在并联容置空腔中；(4)、排出滞留在样品容器、对比容器、引导管和二氧化碳检测装置内的二氧化碳；(5)、将食品样品和空白对比溶液产生的二氧化碳分别经引导管和水蒸气过滤器向下输入两套二氧化碳检测装置内；(6)、由设置在并联容置空腔的温度探头实时监测样品温度，并输入中央控制单元，保持样品恒温不低于0℃，不高于65℃，同时，两套处于完全相同的环境条件的二氧化碳检测装置将检测到的两组二氧化碳含量数据输入中央控制单元进行数据处理和分析比较处理得出差值，并根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系导出样品中的微生物菌落总数。
按照上述设计，检测仪的工作流程如下。
(1)、插上外接电源线，打开电源开关，检测仪预热和自检。
(2)、打开样品容器密封盖，盖上检测仪上盖，由中央控制单元发出指令，自动开启紫外线灯，对样品容器和其并联容置空腔消毒。同时由中央控制单元发出指令，自动检测并联容置空腔内温度，决定是否启动加热元件给并联容置空腔加热到预先设定的温度。(与此同时，检测员可进行样品制备和对比培养液的准备工作)(3)、消毒和并联容置空腔预热完成后，根据显示屏提示，打开上盖，取出样品容器，加入样品和对比培养液。盖上密封盖和上盖。由中央控制单元发出指令，自动开启换气装置，将前次检测残存在二氧化碳检测装置内的二氧化碳排出。然后开始正式检测。检测数据由中央控制单元进行分析，处理和记录。与此同时，根据温度探头的检测，通过随时启动或停止加热元件，使样品在检测过程中，基本保持恒定的温度。
(4)、根据预先设定的检测时间，停止检测，由显示屏显示最终结果。数据传输到计算机中保存或打印。
(5)、如接着进行下一次检测，不用关机，取出样品容器后，放入新的空筒，重新开始消毒和预热。
权利要求
1.一种食品微生物含量快速检测方法，其特征在于采用两套并联的样品检测系统，一套用于食品样品检测，另一套用于对比；两套系统处于相同的环境条件，包括初始温度，初始二氧化碳浓度，采用相同的加热元件进行加热，将两套系统产生的二氧化碳分别经引导管向下输至两套同样的二氧化碳检测装置中进行检测，经检测数据分析处理，比较两套系统的检测结果，其差值与食品样品中微生物含量有正相关关系；根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系得出食品样品中的微生物菌落总数。
2.根据权利要求1所述的食品微生物含量快速检测方法，其特征在于有以下步骤(1)、按常规方法进行食品的采样和保存，在无菌条件下进行样品制备；(2)、用紫外线灯对样品容器、对比容器以及并联容置空腔进行消毒灭菌处理，并用加热元件同时将样品容器、对比容器和并联容置空腔预热；(3)、将待检食品样品匀浆装入样品容器，将空白对比葡萄糖溶液装入对比容器，并将样品容器和对比容器分别密闭在并联容置空腔中；(4)、排出滞留在样品容器、对比容器、引导管和二氧化碳检测装置内的二氧化碳；(5)、将食品样品和空白对比溶液产生的二氧化碳分别经引导管和水蒸气过滤器向下输入两套二氧化碳检测装置内；(6)、由设置在并联容置空腔的温度探头实时监测样品温度，并输入中央控制单元，保持样品恒温不低于0℃，不高于65℃，同时，两套处于完全相同的环境条件的二氧化碳检测装置将检测到的两组二氧化碳含量数据输入中央控制单元进行数据处理和分析比较处理得出差值，并根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系导出样品中的微生物菌落总数。
3.根据权利要求1或2所述的食品微生物含量快速检测方法，其特征在于上述加热的方式可为传导换热方式，对流换热方式或/和辐射传热方式。
4.根据权利要求1或2所述的食品微生物含量快速检测方法，其特征在于上述二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系用传统的检测方法进行标定，即对同一待检样品，同时采用本发明和传统的方法，传统的方法如国际法或TTC显色法，进行检测，将结果对照，从而导出前者二氧化碳变化特征与后者微生物菌落总数之间的换算关系。
5.一种食品微生物含量快速检测仪，在机箱上设有连接中央控制单元的电源插座、电源开关和连接外部计算机的接口，其特征在于在机箱内顶部置有紫外线灯，紫外线灯下面置有并联容置空腔，并联容置空腔内放入样品容器和对比容器；在并联容置空腔周围置有加热元件和温度探头，上述温度探头和加热元件分别经控制信号线与中央控制单元的信号输入端连接；样品容器和对比容器分别经引导管和水蒸气过滤器与二氧化碳检测装置连接；二氧化碳检测装置包括位于进气口的检测管和二氧化碳探头、能将二氧化碳检测信号转变为电压或电流信号的转换电路和出气口，出气口经管道连接换气装置，换气装置的出气口设于机箱上；上述转换电路的数据输出端与中央控制单元的数据输入端连接，中央控制单元的数据输出端与显示屏连接。
6.根据权利要求5所述的食品微生物含量快速检测仪，其特征在于上述二氧化碳探头是非散射红外线型探头或电化学型探头。
7.根据权利要求5所述的食品微生物含量快速检测仪，其特征在于上述水蒸气过滤器是在管体内充填干燥剂，管体一端有进气口，另一端有出气口，在管体盖的进气口和出气口处设有隔网。
8.根据权利要求5所述的食品微生物含量快速检测仪，其特征在于上述加热元件与由电源电路、温度检测放大电路、控制电路和触发器电路连接组成的恒温控制电路连接。
9.根据权利要求5所述的食品微生物含量快速检测仪，其特征在于上述样品容器是带密封盖的密闭容器，密封盖内的出气口经引导管和水蒸气过滤器与下方的二氧化碳检测装置连通。
10.根据权利要求5所述的食品微生物含量快速检测仪，其特征在于上述上述样品容器是带透气小孔的敞口容器，并联容置空腔有密封盖，每个并联容置空腔底部开有出气口，出气口经引导管和水蒸气过滤器与下方的二氧化碳检测装置连通。
全文摘要
一种食品微生物含量快速检测方法及其检测仪，采用两套并联的样品检测系统，一套用于食品样品检测，另一套用于对比；两套系统处于相同的环境条件，包括初始温度，初始二氧化碳浓度，采用相同的加热元件进行加热，将两套系统产生的二氧化碳分别经引导管向下输至两套同样的二氧化碳检测装置中进行检测，经检测数据分析处理，比较两套系统的检测结果，其差值与食品样品中微生物含量有正相关关系；根据事先得到的二氧化碳变化特征与微生物菌落总数之间的换算关系得出食品样品中的微生物菌落总数。本发明检测时间短，结构简单，成本低廉，体积和重量也较小，不需要任何耗材，可永久性使用。适合于现场快速检测系统。
文档编号G01N33/02GK1847405SQ20061020013
公开日2006年10月18日 申请日期2006年2月17日 优先权日2006年2月17日
发明者何宗彦 申请人:何宗彦