专利名称：：雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，属于对药品进行质量控制的
技术领域：
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背景技术：
：雷公藤多苷为卫矛科植物雷公藤根经提取、纯化、精制而成的有效部位，是一个良好的免疫抑制剂。它不仅具有免疫抑制作用，同时还有抗炎作用，是治疗类风湿性关节炎的首选药物。目前市场上治疗风湿病的药物还相当缺乏，主要有非甾体抗炎药、甾体激素类、慢性作用抗风湿药。非甾体抗炎药、慢性作用抗风湿药的疗效并不理想，主要缓解疼痛症状，不能有效防治病情的发展；而激素类药物疗效虽好，但其特殊的副作用，决定其不能长期使用，只能作短期的冲击治疗。而中药具有独特的优势，其副作用小，对肠胃亦无刺激，且风湿病以外邪入内为病因，中医扶正祛邪可直接治本。因此，国家药品监督管理局药品审评中心在2001年12月针对雷公藤制剂举行了专题会议，参会专家一致认为雷公藤制剂虽然有一定毒性，但其治疗风湿病的疗效非常肯定，希望有更多的“安全有效、质量稳定”的雷公藤制剂的开发。雷公藤多苷由于除去了主要有毒部份和杂质，有效组份的纯度提高，副作用和毒性比生药制剂下降，安全范围提高。但从临床研究的统计数字来看，还有一定的副作用约1/5的患者服药后有胃肠道不适。因此为保证临床用药的有效性及安全性，建立一个有效的质量控制方法显得尤为重要。雷公藤内酯醇是雷公藤化学成分中毒性最大的化合物，虽然它有很强的生理活性，但因其毒性太大，建立一种有效的雷公藤内酯醇的含量测定方法，控制其限度，保证雷公藤多苷高效低毒是非常必要的。目前经查阅国内外有关文献，雷公藤内酯醇的测定方法较多，但经过试验验证其精密度差，回收率低，误差大，不能完全有效地控制产品质量。
发明内容本发明的目的在于提供一种雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，本发明针对现有技术的不足，建立了专属性强、精密度好、回收率高的高效液相色谱法，可有效控制雷公藤多苷及其制剂的质量，从而保证临床用药的有效性及安全性。本发明所述的雷公藤多苷是取雷公藤根粉碎，醇提，经柱层析分离收集有效组份而得，其制剂是用雷公藤多苷制成的制剂。本发明方法不仅适用于雷公藤多苷及其制剂，还可用于雷公藤药材或雷公藤多苷与其他药材或药材的有效成分组合后制备的药物制剂。本发明是这样构成的它是以雷公藤内酯醇对照品为对照，以0.05mol/LpH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝50～70∶5～25∶15～35为流动相的高效液相色谱法。具体的测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/LpH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝50～70∶5～25∶15～35为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱5～15分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000；对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取相当于雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份2～4％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝2～4∶1的溶液20～30ml，在30～50℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。更具体的测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/LpH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝60∶15∶25为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱10分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000；对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取相当于雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份3％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝3∶1的溶液25ml，在38～40℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人进行了以下试验研究；以确定相关的技术条件、数据等等试验例1、流动相的选择以0.05mol/LNaH2PO4(pH4.0)-甲醇、0.05mol/LNH4AC(pH4.0)-乙腈-甲醇、水-乙腈及0.05mol/LNaH2PO4(磷酸调pH4.0)-乙腈-甲醇的不同比例的混合溶液为流动相进行试验、比较。结果表明以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)-乙腈-甲醇(50～70∶5～25∶15～35)为流动相的分离效果较好，其它流动相分离不理想。特别是在0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)-乙腈-甲醇(60∶15∶25)流动相条件下，分离效果最好。2、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)-乙腈-甲醇(50～70∶5～25∶15～35)为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱10分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm。理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000。3、样品溶液制备对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到已准备好含水份2～4％的中性氧化铝柱(100～200目，6g，内径1cm，湿法装柱，用适量氯仿预洗)上，以乙酸乙酯-丙酮(2～4∶1)20～30ml，在30～50℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。4、线性范围精密称取雷公藤内酯醇对照品适量，加甲醇溶解稀释制成含雷公藤内酯醇为0.4425μg/ml、0.885μg/ml、1.77μg/ml、3.54μg/ml、7.08μg/ml、14.16μg/ml的溶液。照色谱条件与系统适用性试验条件测定，以峰面积(A)对样品浓度作直线，得回归方程y＝22085X-348.98R＝1.0000可见雷公藤内酯醇在0.4425～14.16μg/ml范围内呈良好的线性关系。5、干扰性试验照“3项下供试品溶液的制备方法”制备一份不加样品的空白溶液，并同法测定，结果在相应位置未见有色谱峰，表明空白无干扰。6、精密度试验6.1重复性试验取样品细粉约0.12g，六份，精密称定，按“3项下供试品溶液的制备方法”制备供试品溶液，依法测定，结果见下表6.2中间精密度不同人员在不同日期取样品细粉约0.12g，六份，精密称定，按“3项下供试品溶液的制备方法”制备供试品溶液，依法测定，结果见下表7、稳定性试验取样品细粉约0.12g，精密称定，按“3项下供试品溶液的制备方法”制备供试品溶液，按下表时间测定6次，其峰面积如下表8、回收率试验取样品约0.048g，0.06g，0.72g各三份，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入雷公藤内酯醇对照品的氯仿溶液(11.808μg/ml)与雷公藤内酯甲对照品的氯仿溶液(60.6μg/ml)各2ml、2.5ml、3ml，混匀，加氯仿溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，分别加到已准备好含水份3％的中性氧化铝柱(100～200目，6g，内径1cm，湿法装柱，用适量氯仿预洗)上，用乙酸乙酯-丙酮(3∶1)25ml，在恒温(38～40℃)条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按法测定，结果见下表该方法雷公藤内酯醇平均回收率为95.99％，平均相对偏差为2.78％，同时其含量只有万分之五，可见该方法回收率较好。9、含量测定按“3项下供试品溶液的制备方法”制备供试品溶液，依法测定不同年份的十批样品，结果见下表<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="828">批号02020020210705030170203127010403701含量0.03470.02550.01360.01030.0136批号04117010505701050770106017010601702含量0.01360.009680.005450.008800.0456</table></tables>根据以上十批样品中雷公藤内酯醇的含量测定结果，暂定雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。与现有技术相比，本发明含量测定采用高效液相色谱法，其专属性强、精密度好、回收率高，测量结果准确，可有效控制雷公藤多苷的质量，从而确保临床用药的有效性及安全性。具体实施例方式本发明的实施例1雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇含量测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)∶乙腈∶甲醇＝60∶15∶25为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱10分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000。对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份3％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝3∶1的溶液25ml，在38～40℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。本发明的实施例2所述含量测定方法也可以为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)∶乙腈∶甲醇＝50∶25∶15为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱5分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000。对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份2％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝2∶1的溶液20ml，在30～38℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。本发明的实施例3所述含量测定方法也可以为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)∶乙腈∶甲醇＝70∶5∶35为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱15分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000。对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份4％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝4∶1的溶液30ml，在40～50℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。权利要求1雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，其特征在于它是以雷公藤内酯醇对照品为对照，以0.05mol/LpH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝50～70∶5～25∶15～35为流动相的高效液相色谱法。2按照权利要求1所述雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，其特征在于具体的测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/LpH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝50～70∶5～25∶15～35为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱5～15分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000；对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取相当于雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份2～4％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝2～4∶1的溶液20～30ml，在30～50℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。3按照权利要求2所述雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，其特征在于更具体的测定方法为色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/LPH＝4.0的磷酸二氢钠溶液∶乙腈∶甲醇＝60∶15∶25为流动相，待雷公藤内酯醇出峰后约二分钟，采用梯度洗脱，用甲醇洗脱10分钟，流速为1ml/min；检测波长为218nm；理论板数按雷公藤内酯醇计算应不低于3000；对照品溶液的制备取雷公藤内酯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含7.5μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取相当于雷公藤多苷细粉约0.12g，精密称定，置20ml量瓶中，加氯仿溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液5ml，加到100～200目、6g、内径1cm、湿法装柱、用适量氯仿预洗、含水份3％的中性氧化铝柱上，以乙酸乙酯∶丙酮＝3∶1的溶液25ml，在38～40℃恒温条件下洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；雷公藤多苷中含雷公藤内酯醇不得过0.5mg/g。全文摘要本发明提供了一种雷公藤多苷及其制剂中雷公藤内酯醇的含量测定方法，它是以雷公藤内酯醇对照品为对照，以0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH＝4.0)∶乙腈∶甲醇＝50～70∶5～25∶15～35为流动相的高效液相色谱法。与现有技术相比，本发明含量测定采用高效液相色谱法，其专属性强、精密度好、回收率高，测量结果准确，可有效控制雷公藤多苷的质量，从而确保临床用药的有效性及安全性。文档编号G01N30/06GK1851452SQ20061020042公开日2006年10月25日申请日期2006年5月9日优先权日2006年5月9日发明者鲍立曾,刘法千,熊仕强申请人:浙江得恩德制药有限公司