含硫的酯肽类化合物在确定adamts蛋白水解酶活性中的用途的制作方法

专利名称：：含硫的酯肽类化合物在确定adamts蛋白水解酶活性中的用途的制作方法含硫的酯肽类化合物在确定ADAMTS蛋白水解酶活性中的用途本发明涉及通式为R-(XaaVPro陽X-Gly画S-Y画Z-Gly國(Xaa)m-Rl(I)的含硫的酯肽类化合物(thiopeptolide)作为底物用于确定ADAM-TS蛋白水解酶活性中的用途，并且涉及寻找ADAM-TS蛋白7jC解酶的调节剂，尤其是抑制剂的方法。完整的关节软骨基质是人和动物体所有关节发挥功能具有决定意义的先决条件，关节软骨的损伤可以导致诸如骨关节病(骨关节炎)和风湿病等关节炎性疾病，这些疾病以患病的人或动物出现机能障碍且最终丧失活动能力为特征。在以受损基质降解为特征的其它疾病中，还必须包括多种形式的癌症，尤其是肿瘤的转移。已知基质金属蛋白酶(MMP)参与了软骨中的聚集蛋白聚糖和胶原的降解。这些基质金属蛋白酶包^ilf"如基质蛋白酶类，其包含从MMP-1、2等直到MMP-16所有已知MMP。另一类，称为ADAM-TS-家族的蛋白水解酶(Nagase，H.等人。(2003)，ArthritisResearchTherapy,5，94-103)，同样在组织基质的降解中起到至关重要的作用，导致软骨基质的损伤。这些蛋白水解酶的活性，特别是ADAM-TS1、ADAM-TS4和ADAM-TS5(也称为"可聚蛋白聚糖")，是以受损的基质降解为特征的疾病(例如骨关节病、风湿病和癌症)的病因。ADAM-TS能够特别切割蛋白聚糖，还能切割诸如乙酰透明质酸或胶原等其它基质组分。此外，ADAM-TS1、4、5和11，还有ADAM-TS13对炎症过程、血管发生、细胞迁移和血液凝固(或凝血)至关重要(Apte，S.S.(2004)，TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,36，981-985)。因此，一方面能够在有患病风险或已经患病的组织(例如软骨组织或血液中)检测与疾病有关的蛋白水解酶的酶促活性是药物研究的重要任务。而另一方面，开发能够抑制单个、多种或者所有相关蛋白水解酶的药物制剂有特别重要的意义。通过将相应的蛋白水解酶与适当的高分子量基质组分(例如蛋白聚糖或胶源)一起孵育，并且测量降解产物的形成，可以在体外测量有关蛋白水解酶的酶(蛋白水解)活性。本领域技术人员可以使用通常需要复杂操作的多种方法(例如特异性切割位点的抗体识别和质镨分析研究)用于分离和定量异质的降解产物，也就是说，例如胶原片段和蛋白质片段.先前已有例如^f吏用重组底物确定ADAM-TS4活性的描述，所述重组底物包含天然聚集蛋白聚糖的球间结构域的重要结构组分。在COS细胞中表达该分子量为72千道尔顿的重组聚集蛋白聚糖。确定可聚蛋白聚糖的活性，在除了使用高分子量聚集蛋白聚糖分子之外，还需要更多的复杂步骤，例如结构元件CD5信号序列、Ml单克隆抗体决定的FLAG表位、人IgGl的铰链区、所述重组底物的cDNA，包括其载体，如在EP0785274和在H6rber，Chr等人.(2000)MatrixBiology,19，533-543中所述。聚集蛋白聚糖分子短片段的用途也已经被公开。WO00/05256报道这些肽片段可能由20-40个氨基酸结构单元组成。但特别不利的是，聚集蛋白聚糖不能转化含有少于20个氨基酸的肽。这点已可以得到证实(见实验部分)。为确定基质蛋白酶家族中的蛋白水解酶，根据以前的技术，将低分子量分子作为蛋白水解酶的底物切割以确定酶(蛋白水解)活性，所述^f氐分子量分子能够较容易通过人工合成而获得，由于这些底物的特定性质，可通过切割而释放,例如一般在可见和紫外光波长范围内的可定量的光学信号。一个众所周知的实例是(7-甲氧香豆素-4-基)乙酰-Pro-Leu-Gly-Leu-3-(2，，4'-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙酰-Ala-Arg-NH2(Bachem，Heidelberg,德国)，由Knight,C.G.等人在(1992)FEBS，296，263-266中描述，其可以被特定的基质金属蛋白酶切割，并且因此释放可以用于计算酶活性的可测量的荧光信号。因此已经可以证实，应用蛋白水解酶MMP-3和MMP-8转化(7-甲氧香豆素_4-基)乙酰-1*0誦!^1!-0^画1^11画3國(2'，4'-二硝基苯基)丄画2，3-二#^丙酰-入13^^陽]\112是可行的(见实^分)>应用MMP-3和MMP-8转化此类型的许多其它底物也是可行的。已经揭示了胶原酶和膜相关的基质金属蛋白酶可以转化来源于^s琉的酯肽类化合物类物质的某些底物，参见EP0149593和US2002/0142362。但是，N端至可聚蛋白聚糖切割位点间短至16氨基酸的肽不再发生可聚蛋白聚糖切割。一些实验中还证实了更短链的肽，即使其包含Glu-Ala序列，也可能不能被ADAM-TS切割。相反，已经发现其它蛋白水解酶家族的成员，例如基质蛋白酶或组织蛋白酶，可以切割寡肽。这些实验中寡肽的应用特别受欢迎，因为它们可以通过化学合成容易地得到。寡肽的另一个优势是可以对单独的肽结构单元进行化学修饰，例如，也可以将其连接到那些发色团上，其允许在肽切割后可以直接或间接进行光镨测定，例如比色法。相应地，通过比较在加入相应的蛋白水解酶抑制剂后的蛋白水解活性与在加抑制剂之前测量的活性，可以容易地确定酶抑制剂或激活剂的效应。它的一个实例为含石危的酯肽类化合物R-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-Rl(EP0149593)，其可以被脊推动物胶原酶切割；和乙耽-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰-2-巯基4-甲基-戊酰基卜亮氨酰-甘氨酰-乙基酯(US2002/0142362),其可以被某些基质蛋白酶切割，从而形成能够通过已知方法(如与DTNB反应)定量的游离的SH基团。已经发现，根据本发明的通式(I)的含硫的酯肽类化合物R-(Xaa)n-Pro國X-Gly誦S-Y國Z画Gly誦(Xaa)nrRl可以被ADAM國TS蛋白水解酶(特别是ADAM-TS1、ADAM-TS4、ADAM-TS5、ADAM-TS11和/或ADAM-TS13,尤其是ADAM-TS1、ADAM-TS4或ADAM-TS5)切割，并且因此能够容易地经由游离SH基团得到检测。因为现有技术报道，包含少于16个^J^酸单位的肽不能被ADAM-TS切割，这更加令人惊奇。因此，本发明一方面涉及以下通式(I)的含硫的酯肽类化合物或其盐作为ADAM-TS蛋白7jc解酶底物的用途，R-(Xaa)n-Pro-X-Gly-S誦Y-Z-Gly-(Xaa)m-Rl(I)，其中R是H或N-保护基团，优选a基团，特别是d-Cs-烷基的羧基基团，尤其是CrQr烷基的g基团，特别优选乙g，Xaa-任何天然存在的氨基酸，n、m-相同或不同的0-2415之间的整数，优选0-35，特别是0-14，尤其是O-ll，且最特别优选等于O,X-亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，Z-亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，R产末端酰胺、羧基或酯的基团，优选d-Cs-烷基的上述基团，特别是d-C3-烷基的上述基团，尤其是乙基酯，SS-Y=R2-CH-COO-，其中R2是一个天然存在的氨基酸的侧链，特别是-CH2CH(CH3)2，-CH(CH3)C2H5，-CH2C6H5，-CH(CH3)2，或-CH3。通常，适合的N-保护集团是所有常规氨基酸的保护基团，例如Fmoc(9画氟烯基甲氧^li0(9-fluoroenylmethyloxycarbonyl)、Mtt(4-甲基三苯曱基>Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基>tBu(叔丁基>Boc(叔丁氧羰基)、Tos(甲辆酰基)、Mbzl(甲苄基)、Bom(苄狄甲基)、2-氯國Z(2-氯千氧羰基)或For(曱酰基)，上述可以从例如BachemDistributionServicesGmbH,WeilamRhein获得，特别优选的通式I的^s琉的酯肽类化合物是其中X-亮氨酸或丙氨酸，Z-亮氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸，且R2=-CH2CH(CH3)2的^^琉的酯肽类化合物。在另一个优选的实施方案中，(Xaa)n和/或(Xaa)m相应于SEQIDNO:2中所示M^列，代4A聚集蛋白聚糖的^J^^列。其它优选的含硫的酯肽类化合物具有如下的结构:Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Leu-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2，且Ac—般是乙酰基。或Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2，或Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC2H5,其中R2=CH2CH(CH3)2,或Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Ala-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2。所有已知的ADAM-TS蛋白水解酶均适合于本发明，例如ADAM-TS蛋白水解酶l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。优选ADAM-TS蛋白水解酶l、4、5、11和/或13，特别是ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。本发明的用途特别适合确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性；纯化ADAM-TS蛋白水解酶；编码ADAM-TS蛋白水解酶核苷酸序列的功能性克隆；寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白7jC解酶抑制剂；或观察与受损组织基质相关的疾病(特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症)的发生和逸艮。在所有这些方法中，例如在ADAM-TS至常规已知的表达栽体之后，最终使用所述含硫的酯肽类化合物测量ADAM-TS蛋白水解酶的活性。本发明因此还涉及确定ADAM-TS蛋白水解酶活性的方法，其中该方法包括如下步骤(a)将ADAM-TS蛋白水解酶与根据通式I或以上详述的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，且(b)进行ADAM-TS蛋白水解酶的活性测量或确定。适合且优选的ADAM-TS蛋白水解酶是上文已详述的ADAM-TS蛋白水解酶。优选分光光度测定法进行活性测量或确定。在通过分光光度测定法确定活性中，经常使用巯基的检测试剂。在这一点上，已经证明的有利的检测试剂是4，4，-二硫联吡啶，或者特别是又被称为Ellmann，s试剂的5，5，-二硫代双(2-硝基苯曱酸)(DTNB),但是也可以使用任何其它的巯基反应试剂，诸如碘乙酰胺，例如5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF);马来酰亚胺，例如荧光素-5-马来酰亚胺；或诸如N，N，-双丹磺酰-L-胱氨酸或5-(溴甲基)荧光素等其它的巯基反应试剂。可以从例如InvitrogenGmbH,Karlsruhe获得这些类型的试剂。可以使用所述^s琉的酯肽类化合物在适合的测定系统中寻找特别简单的ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，本发明的调节剂具体而言意指ADAM-TS蛋白水解酶的激活剂和ADAM-TS蛋白水解酶的抑制剂，尤其是后者。因此，本发明的另一个方面涉及寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的方法，其中该方法包含如下步骤(a)在存在测试化合物的情况下，将根据通式I或上文详述的含石克的酯肽类化合物底物与ADAM-TS蛋白水解酶一起孵育，且(b)测量或确定测试化合物对ADAM-TS蛋白水解酶活性的影响。适合和优选的蛋白水解酶上文是已详述的ADAM-TS蛋白水解酶.优选如以上详述，通过分光光度测定法进行活性测量或确定。上文所述的化合物也适合作为巯基基团的检测试剂，特别是4，4，-二石jW处咬或5，5，-二硫代双(2-硝基苯曱酸)(DTNB)。测试化合物可以是任何可能的化学的、生化的、天然存在的或合成的、高分子量或低分子量的化合物。能够以化学化合物文库的形式获得测试化合物是特别有利的，可以使用本发明的方法从所述化学化合物文库找到想要的化合物，例如测试的ADAM-TS蛋白水解酶的抑制剂。在另一个优选的实施方案中，在特别有利于寻找和分离想要的化合物的芯片上执行本发明的方法。应用自动机械实施本发明地方法同样使其更为便利，并可以增加其通量，因此也是特别有利的。也可以使用微观流体技术，其中与小型化的板凹槽("孔")适当组合，使测定系统小型化且进一步自动化，这同样也是特别有利的。本方法通常用于ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，尤其是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选。基于本发明的方法，本发明另一个方面涉及药物的制备。其包括如下步骤(a)实施上述方法以寻找ADAM-TS调节剂，特别是抑制剂，(b)分离在步骤(a)中发现的适合的测试物质，并且(c)将步骤(b)中分离的测试物质与一种或多种药用可接受的栽体或佐剂一起配制。使用本发明方法发现的药物活性的化合物，优选抑制剂，特别适合与受损组织基质相关疾病(特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症)的治疗。通常用于药物制剂的所有已知试剂作为药物可接受的载体或佐剂都是适合的。实例为氯化钠溶液，具体为等渗的盐溶液(浓度为0.9%的氯化钠溶液)、脱矿质水、稳定剂(例如蛋白水解酶抑制剂或核酸酶抑制剂，优选抑酶肽、e-氨基己酸或胃酶抑制剂A)或掩蔽剂例如EDTA、凝胶制剂例如白凡士林、低粘度石蜡和/或黄蜡，由施用模式而定。其他合适的添加剂有，诸如洗涤剂，例如tritonX-100或脱氧胆酸钠；还有多元醇，例如聚乙二醇或甘油；糖例如蔗糖或葡萄糖；两性离子化合物诸如氨基酸，例如甘氨酸或牛磺酸或甜菜碱(特别是后二者)；和/或蛋白质，例如牛血清清蛋白或人血清清蛋白。特别优选洗涤剂、多元醇和/或两性离子化合物。生理緩冲溶液优选具有约6.0-8.0的PH值，特别是约为6.8-7.8的PH值，尤其是约为7.4的PH值和/或约为200-400毫渗透分子/升的摩尔渗透压浓度，优选约为2卯-310毫渗透分子/升。通常使用适当的有机緩冲液或无M沖液调节药物的PH值，例如，优选使用磷酸盐緩冲液、Tris緩沖液(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES緩冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪乙磺酸)或MOPS緩沖液(3-吗啉代-l-丙磺酸)。一般根据需要的緩沖液的摩尔浓度选择恰当緩冲液。例如磷酸盐緩冲液是适合用作注射和灌输的溶液。本发明的另一方面是试剂盒，其基于根据通式I或如上文所详述的本发明的^^琉的酯肽类化合物底物和上文所述的ADAM-TS蛋白水解酶，且其中包含合适的一种或多种緩沖液，例如TNCB緩冲液(见实施例).该緩冲液作为实施本发明方法的稳定介质或反应介质。试剂盒优选额外包含巯基基团检测试剂，例如至少一种上文所述的检测试剂，特别是4，4，-二石;W吡咬或者5，5，-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。本试剂盒的另一个组分可以是用于执行本发明方法，特别是活性测定的使用说明。下列陈述和实施例旨在详细解释本发明，而非限制序列表SEQIDNO:1相应于才艮据通式(I)的^^硫的酯肽类化合物SEQIDNO:2代表聚集蛋白聚糖核心蛋白前体(软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白(CSPCP)或硫酸软骨素蛋白聚糖核心蛋白l)的絲絲列.实施例实施例1(比较实施例)测定*人类重组体MMP-3和MMP-8蛋白，MMP-3cd和MMP-8cd的催化结构域可以从例如BiomolInternationalL.P.Pennsylvania,USA商购，分类号分别是SE-109和同样可以从例如Invitek,GesellschaftfiirBiotechnik&BiodesignmbliBerlin德国买到ADAM-TSl和ADAM-TS4蛋白水解酶的截短形式，分类号分别是30400402和30400102。緩冲液和溶液的制备TNCB緩沖液lOOmM三羟甲基氨基甲烷，用盐酸调PH值至7.5lOOmMNaCl10mMCaCl22H200.015%Brij35底物溶液10mM底物(见表)溶于DMSO中。使用之前立即用130HL的H20稀释2iiL的底物贮存液。酶溶液用TNCB緩冲液稀释MMP-3cd(2.3|ig/mL)、MMP誦8cd(0.6卩g/mL)、ADAMTS-1(2.3|ig/mL)和ADAMTS國4(3.3Pg/mL)。测定操作10pL的酶溶液与10yL的H20混合，然后加入10ML的底物溶液开始反应。荧光分析在TECANSpectrafluorPlus荧光仪中测量荧光；发射(见表)。要求每次测量荧光5分钟。比较实施例1的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如所预期的，且与本技术水平一致，MMP底物不被ADAMTS转化。实施例2緩沖液和溶液的制备TNCB緩沖液(见实施例1)酶溶液ADAMTS(Invitek，GesellschaftftirBiotechnik&BiodesignmbH，Berlin,德国)用2200的TNCB緩沖液稀释5的ADAMTS-l，并且用600/tL的TNCB緩冲液稀释5/tg的ADAMTS-l。底物溶液1)DTNB溶液(5，5，-二硫代双(2-硝基苯甲酸))制备溶于DMSO中的浓度为40mM的贮存液用522/tL的水稀释27.5的DTNB]i&存液.2)含石危的酯肽类化合物溶液(BachemDistributionServicesGmbH,WeilamRhein，德国)制备溶于DMSO中的浓度为100mM的贮存液。使用时，用500的TNCB緩冲液稀释55/tL的含硫的酯肽类化合物贮存液，使用之前，立即将550的DNTB与550piL的含疏的酯肽类化合物混合。测定操作在96多孔板(半面平板、平底、透明、聚苯乙烯平板，No.3695)(CorningCostar，Acton，美国)中进行测量。将10jitL的酶溶液与10的H20混合，然后加入10#L的底物溶液起始反应。比色分析孩丈量滴定板光度计MolecularDevicesSunnyvale,美国，SpectraMaxl卯.在415nm波长观测光吸收5分钟。实施例2的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>化合物2不被ADAMTS转化。而令人惊讶的是，化合物1被ADAMTS转化。SEQIDNO:1Xaa誦Pro画Xaa-Gly-Xaa-Xaa誦Gly曙XaaSEQIDNO:21MTTLL群FVTLRVITMVTVETSDHDNSLSVSIPQPSPLRVLLGTSLTIPCYFIDPMHPV61TTAPSTAPLAPRIKWSRVSKEKEWLLVATEGRVRVNSAYQDKVSLPNYPAIPSDATLEV121QSLRSNDSGVYRCEVMHGIEDSEATLEVWKGIVFHYRAISTRYTLDFDRAQRACLQNSA181IIATPEQLQAAYEDG卿CDAGWLADQTVRYPIHTPREGCYGDKDEFPGVRTYGIRDTNE241TTOVYCFAEEMEGEVFYATSPEKFTFQEMNECRRLGARLATTGHVYLAWQAGMDMCSAG301WLADRSVRYPISKARPNCGGNLLGVRTVYVHANQTGYPDPSSRYDAICYTGEDFVDIPEN361FFGVGGEEDITVQTVTWPDMELPLPRNITEGEARGSVILTVKPIFEVSPSPLEPEEPFTF421APEIGATAFAEVENETGEATRPWGFPTPGLGPATAFTSEDL，TAVPGQPHLPGGWF481HYRPGPTRYSLTFEEAQQACPGTGAVIASPEQLQAAYEAGYEQCDAGWLRDQTVRYPIVS541PRTFCVGDKDSSPGVRTYGVRPSTETYDVYCFVDRLEGEVFFATRLEQFTFQEALEFCES601■TATTGQLYAAWSRGLDKCYAGWLADGSLRYPIVTPRPACGGDKPGVRTVYLYP,661LPDPLSRHHAFCFRGISAVPSPGEEEGGTPTSPSGVEEWIVTQWPGVMVPVEEETTAV721PSGETTAILEFTTEPENQTEWEPAYTPVGTSPLPGILPTWPFTGAETEESTEGPSATEVP781SASEEPSPSEVPFPSEEPSPSEEPFPSVRPFPSVELFPSEEPFPSKEPSPSEEPSASEEP841YTPSPPEPSWTELPSSGEESGAPDVSGDFTGSGDVSGHLDFSGQLSGDRASGLPSGDLDS901SGLTSTVGSGLTVESGLPSGDEERIEWPSTPTVGELPSGAEILEGSASGVGDLSGLPSGE961VLETSASGVGDLSGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLE1021TTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETM1081PGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGV1141咖SGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDI1201SGLPSGEVLETAAPGV咖SGLPSGEVLETAAPGV咖SGLPSGEVLETAAPGV咖SGL1261PSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETTAP1321EVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETSTSAVG1381VETSASGIEDVSELPSGEGLETSASGVEDL1441ETSASEVGTDLSGLPSGREGLETSASGAED1501SGQAPETSGLPSGFSGEYSGVDLGSGPPSG1561SELEGRGTIGISGAGEISGLPSSELDISGR1621SGQPSGFPDTSGETSGVTELSGLSSGQPGV1681SGQPSGLPGFSGATSGVPDLVSGTTSGSGE1741SGLPSGEADLSGKSGMVDVSGQFSGTVDSS1801SLPSGAYYGSGTPSSFPTVSLVDRTLVESV1861GEHSGFLDLSGLQSGLIEPSGEPPGTPYFS1921LITSEFVEGVTEPTISQELGQRPPVTHTPQ1981VPESSSETSAYPEAGFGASAAPEASREDSG2041FQEGEASAAPEVSGESTTTSDVGTEAPGLP2101SIPESEWTQQTQRPAETHLEIESSSLLYSG2161AAAPARSCAEEPCGAGTCKETEGHVICLCP2221PDRETWVDAERRCREQQSHLSSIVTPEEQE2281MQFENWRPNQPDNFFMGEDCWMIWHEKG2341ARTFGQKKDRYEINSLVRYQCTEGFVQRHM2401RSSRHPRRSRPSTAHGVEEISGLPSGEVLETTAPGVDEISGLPSGDLSGLPSGGEVLEISVSGVEDISGLPSGEVSRLPSGEEVLEISASGFGDLSGVPSGGEGLLSGLPSGKEDLVGSASGDLDLGKLPSGTLGLPDFSGLPSGFPTVSLVDSTLVEWTASTAASGLPSGTELSGQASGSPDVSGEIPGLFGVSGEASGVLYGTSQPFGITDLSGETSGVPDLSSGITFVDTSLVEVAPTTFKEEEGLGSVELGFTSQTPEFSGLPSGIAEVSGESSRAEIGSTQAPTAQEAGEGPSGILELSGAHSGAPDMSGDFASTTNVSGESSVAMGTSGEASGLPEVTLFESSGKVSTAGDISGATPVLPGSGVEVSSSPDLSETTSAFHEANLERSSGLGVSGSTLTSATPTASGDRTEISGDLSGHTSQLGWISTEETHTVETATSPTDASIPASPEWKRESESTPGYTGE腦IDQEVCEEGWNKYQGHCYRHFFVNNNAQDYQWIGLNDRTIEGDFRWSDGHPEWNDVPCNYHLPFTCKKGTVACGEPPWEHPTIRCQPSGHWEEPRITCTDATTYKRRLQK权利要求1.通式为R-(Xaa)n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)m-R1(I)的含硫的酯肽类化合物或其盐作为ADAM-TS蛋白水解酶底物的用途，其中R是H或N-保护基团，优选羧基基团，特别是C1-C5-烷基的羧基基团，尤其是C1-C3-烷基的羧基基团，特别优选乙酰基，Xaa是任何氨基酸，n、m是相同或不同的从0-2415的整数，优选从0-35，特别是从0-14，尤其是从0-11，且最特别优选等于0，X是亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，Z是亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，R1是末端酰胺、羧基或酯基团，优选C1-C5-烷基的上述基团，尤其是C1-C3-烷基的上述基团，特别是乙基酯，其中R2是天然存在的氨基酸的侧链，特别是-CH2CH(CH3)2，-CH(CH3)C2H5，-CH2C6H5，-CH(CH3)2，或-CH3。2.权利要求l的用途，其特征在于X-亮氨酸或丙氨酸，Z-亮氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸，且R2=-CH2CH(CH3)2,3.权利要求1或2的用途，其特征在于(Xaa)n和/或(Xaa)m是SEQIDNO:2中所示的M酸序列。4.权利要求l的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Leu-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2且Ac是乙酰基。5.权利要求l的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构Ac-Pro-Leu-GIy-S-Y-Phe-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2且Ac是乙酰基。6.权利要求l的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构Ac-Pro-AIa-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2且Ac是乙酰基。7.权利要求l的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Ala-Gly-OC2H5，其中R2=CH2CH(CH3)2且Ac是乙酰基，8.权利要求l-7中至少一项的用途，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。9.权利要求l-8中至少一项的用途，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。10.权利要求l-9中至少一项的用途，用于确定ADAM-TS蛋白水解酶活性；纯化ADAM-TS蛋白水解酶；对编码ADAM-TS蛋白水解酶的核苷酸序列的功能性克隆；寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白7jc解酶抑制剂；或观察受损组织基质相关疾病，特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症的发生或M.11.确定ADAM-TS蛋白7JC解酶活性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(a)将ADAM-TS蛋白水解酶与根据如权利要求1-7中任一项所限定的通式I的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，并且(b)进行ADAM-TS蛋白水解酶的活性测量或确定。12.权利要求11的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。13.权利要求11或12的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白7jc解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。14.权利要求11-13中至少一项的方法，其特征在于使用分光光度测定法测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性。15.权利要求14的方法，其特征在于在巯基检测试剂的存在下测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶，所述巯基检测试剂优选碘乙酰胺，特别是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF);马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N，-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4，-二硫联吡啶或5，5，-二硫代双(2-硝基苯曱酸)(DTNB)。16.用于寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(a)在测试化合物的存在下，将ADAM-TS蛋白7jc解酶与根据如权利要求1-7中任一项所限定的通式I的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，和(b)测量或确定测试化合物对ADAM-TS蛋白水解酶活性的影响。17.权利要求16的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。18.权利要求16或17的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白7JC解酶1、4、5、11和/或13,优选ADAM-TS蛋白水解酶l、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。19.权利要求16-18中至少一项的方法，其特征在于应用分光光度测定法测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性。20.权利要求19的方法，其特征在于在巯J^r测试剂的存在下测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶，所述检测试剂优选碘乙酰胺，特别是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF);马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N，-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4，-二硫联吡啶或5,5，-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。21.权利要求16-20中至少一项的方法，其特征在于可以以化合物文库的形式获得测试化合物。22.权利要求16-21中至少一项的方法，其特征在于在芯片上实施该方法。23.权利要求16-22中至少一项的方法，其特征在于通过自动机喊实施该方法。24.权利要求16-23中至少一项的方法，其特征在于以微观流体技术辅助实施该方法。25.权利要求16-24中至少一项的方法，其特征在于该方法是对ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选。26.制备用于与受损组织基质相关的疾病的治疗药物的方法，所述疾病特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症，所述方法特征在于包括如下步骤(a)实施权利要求16-25中任一项的方法，(b)分离在步骤(a)中发现的适合的测试物质，和(c)将步骤(b)中分离的测试物质与一种或多种药用可接受的栽体或佐剂一起配制。27.试剂盒，其包含根据如权利要求1-7中任一项所限定通式I的含石克的酯肽类化合物的底物、ADAM-TS蛋白7JC解酶和其中适当的一种或多种緩冲液。28.权利要求27的试剂盒，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。29.权利要求27或28的试剂盒，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白7jC解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。30.权利要求27-29中至少一项的试剂盒，其特征在于额外存在至少一种巯基检测试剂，优选碘乙酰胺，特別是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF);马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N，-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4，-二硫联吡啶或5，5，-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。全文摘要本发明涉及通式R-(Xaa)_n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)_m-R1(I)的含硫的酯肽类化合物作为底物在确定ADAMTS蛋白水解酶的活性中的用途，和发现ADAMTS蛋白水解酶调节剂，特别是抑制剂的方法。文档编号G01N33/50GK101115993SQ200680004289公开日2008年1月30日申请日期2006年2月10日优先权日2005年2月9日发明者K-U·魏特曼,V·耶斯克申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司