专利名称：：有机化合物的制作方法有机化合物发明领域本发明涉及有机化合物，并且涉及用于鉴定调节mRNA与靶蛋白质如ELAVL1蛋白之间相互作用的物质的测定法。技术背景大量基因的表达在信使RNA水平上受到控制。特别地，与某些刺激控制机制而得以促进。这些过程主要由对信使RNA起作用的调控蛋白质或因子介导。抑制或调节这类调控性靶mRNA-蛋白质的相互作用代表了有吸引力的治疗性干预手段。为了寻找抑制mRNA调控的低分子量抑制剂，需要一种监测耙向mRNA-蛋白相互作用的测定法，理想地是在均质溶液中进行。所述测定法应还适合于在高通量筛选(HTS)环境中实施，高通量筛选目前大部分通常基于荧光检测。相对小的蛋白质，如mRNA稳定蛋白质HuR(36kD)，与长mRNA或亚片段(281-1643个核苷酸，100-500kD)的直接结合，不能基于大小的相对增加来检测，因为荧光标记的RNA在复合物形成时衰减。有鉴于此，可以容易地排除基于转动或平移扩散时间检测的光谦法(例如荧光相关光谱(FCS)、2D-FIDA-各向异性或其他荧光偏振测量法)。本发明的测定法代表了一种在真正平衡条件下监测均质溶液中的mRNA-蛋白质相互作用的新方法。例如该法应用高度敏感的单分子检测法，由此直接适合于HTS平台如EvotecMarkl1/111。由于所述检测如共焦检测具有高灵敏度和精确度，所以本发明的测定法代表了有吸引力的不同于常规电泳迁移率变动分析、滤膜结合试验或核酸酶保护分析的可选方案。适应常规的宏观荧光强度检测方法(例如荧光板读出器)也将是直截了当的，并不一定需要利用共焦仪器。
发明内容本发明一方面提供了用于鉴定调节mRNA与靶蛋白质之间相互作用的物质的测定法，所述测定法包括a)提供长度至少为100个核苷酸的标记的mRNA,任选作为均质溶液提供，所述的标记为对mRNA环境中的改变敏感的物质；b)在不存在和存在候选化合物的情况下使靶蛋白质如HuR与步骤a)中提供的mRNA接触，所述候选化合物预期将在所述mRNA与所述乾蛋白质如HuR之间能够形成复合物的足够长的时间内调节所述mRNA与所述靶蛋白质如HuR之间的相互作用；c)检测步骤b)中形成的复合物；d)测定在步骤b)中不存在或存在候选化合物的情况下所形成的复合物的量是否存在差异；和e)将在步骤d)中测定到差异的候选化合物选为鉴定物质。测定原理可以说明如下(例如，如图1中所示)标记mRNA，例如，通过肼醛连接化学在3，末端用Cy3标记。一旦靶蛋白质结合至标记的mRNA，则所述标记如Cy3的量子产率改变，例如增加，并且这种改变提供了mRNA与靶蛋白质相互作用的读出值。这一效应显然不涉及蛋白质与标记的直接接触，而且，甚至对于把蛋白质(如HuR)结合位点远离其3，端标记的mRNA而言，也可;f见察到再现性。目前我们推断这一结果可能是因为与靶蛋白质形成复合物时，RNA三维构象改变，通过长程效应发生平移所致，并且归因于标记如Cy3的环境敏感性(例如，参见MujumdarR.B等，BioconjChem.1993，4(2)105-11)。因潜在抑制剂所致的蛋白质-mRNA复合物形成的减少将检测为读出值如总荧光强度的下降，或具有更高分子亮度的物质颗粒数量的减少。200680006844.0说明书第3/24页在优选的实施方案中，靶蛋白质为HuR蛋白。mRNA可以为含ARE的mRNA,并且包括例如炎性靶标，包括来自TNF-ot、IL-1P、IL-2、IL-8、Cox-2、IL画4或AT-R1的ARE,而且包括其他ARE调控的靶标家族。例如，原癌基因，如c-myc、c-jun或c-fos。在本发明的另一方面，mRNA选自编码IL-2、IL-ip和TNF-a的序列，或这类序列含ARE的片段。在本发明的另一方面，mRNA具有100-500个核苷酸，优选300个核苷酸的长度。标记可以为常规的，例如生物素或酶，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或过氧化物酶(POD)或荧光分子，例如荧光染料。优选标记为荧光染料，例如Cy3或Cy5，例如Cy3。在本发明的优选的一方面，标记为荧光标记，例如Cy3或Cy5。靶蛋白质可以为已知结合mRNA的任何蛋白质，其中这类结合导致RNA三维构象改变。在本发明的另一方面，耙蛋白质为结合含ARE的mRNA的ELAVL1(=HuR)。为了检测形成的复合物，可以使用检测手段。这类检测手段包括测定领域中那些常用的方法，例如荧光检测测量法。用于本发明的检测手段包括识别标记mRNA的分子。例如，使用一维强度依赖性共焦荧光检测方法FIDA(荧光强度分布分析)，能够直接地、并且以大小独立的方式、在均质溶液中跟踪乾蛋白质如HuR与其耙mRNA的结合。在本发明的另一方面，通过测量荧光强度来检测复合物。任选可以从非复合级分中分离出形成的复合物。例如，可以按照与常规方法类似的方法进行分离，例如色谱法，例如大小排阻色镨法。候选化合物包括可以测定其对mRNA与靶蛋白质相互作用的调节作用的化合物(库)。化合物(库)包括例如寡肽、多肽、蛋白质、抗体、才莫拟物、小分子，例如低分子量化合物(LMW、s)。9物质为影响(抑制)mRNA与靶蛋白质之间相互作用的化合物，例如在本发明提供的测定法步骤d)中检测的物质。物质为选择的候选化合物之一，并且可以包括寡肽、多肽、蛋白质、抗体、模拟物、小分子，例如低分子量化合物(LMW、s)。物质包括一种或多种物质，例如物质的组合。本发明在另一方面提供了用于高通量筛选的本发明的测定法。本发明在另一方面提供了试剂盒，其包括-标记的mRNA，例如荧光标记的mRNA;-靶蛋白质；-使用这类试剂盒的说明书；和-任选的候选化合物。本发明提供的这类试剂盒可以进一步包括实体组分，包括待测样品的适宜环境，以及例如测定待测样品中候选化合物之效应的适当手段。本发明还涉及通过上述筛选测定法鉴定的有机化合物。本发明在另一方面提供了下式的化合物其中R为被如下基团取代的(d》烷基未被取代或取代的(<:6.18)芳基或具有5或6个环成员和1-4个选自N、O和S的杂原子的杂环基；R2为被如下基团取代的(CM)烷基羟基、g、M或未被取代或取代的(<:6.18)芳基，或R2为未被取代或取代的(C"8)芳基；且&为未#皮取代或取代的(<:6_18)芳基，或具有5或6个环成员和1-4个选自N、O和S的杂原子的杂环基.在式I化合物的一个优选方面中，&为被如下基团取代的(CL3)烷基未被取代或取代的苯基或具有5个环成员和N作为杂原子的杂环基；R2为被如下基团取代的(d.2)烷基羟基、羧基、氨基或未被取代或取代的苯基，或R2为未被取代或取代的苯基；且R3为未被取代或取代的苯基，或具有5或6个环成员和N作为杂原子的杂环基。在式I化合物的另一优选方面，R,为被对曱基苯基取代的甲基，或被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被^&取代的甲基，被对甲基苯基取代的甲基，被lH-吲味-3-基取代的甲基，被羟基取代的乙基，被氨基或对曱基苯基取代的乙基，且R3为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中R4为1-哌啶或l-(对氨基羰基)-哌啶，Rs为甲氧基乙基、苄基或(对甲氧基苯基)-乙基；或下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>R6为对苯基或间吡啶；且R7为被间曱氧基苯基或l-氨基羰基-2-羟基丙基取代的甲基。如果文中不另作定义，那么烷基包括(d.s)烷基，例如(d-4)烷基。芳基包括(Cw8)芳基，例如苯基。杂环基包括5或6元环，具有1-4个选自S、O和N，例如N的杂原子；例如哌啶、吡啶和吡咯烷，其任选与另一环(系)稠合(anellated)，例如与苯环稠合；或例如与杂环稠合。烷基、芳基和杂丫ii环基包括未被取代或取代的烷基、芳基或杂环基，例如被有机化学中常规的基团取代。氨基包括被取代和取代的胺，例如烷基胺和双烷基胺。在式I的化合物中，单独定义的各取代基可以为优选的取代基，例如彼此独立定义的取代基。本发明在另一方面提供了式I的化合物其中a)Ri为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被氨基取代的乙基；且R3为下式的化合物b)R,为被对甲基苯基取代的甲基，R2为被^J^取代的乙基；且R3为下式的化合物c)&为对甲基苯基取代的甲基，R2为被对^&甲基-苯J^代的甲基，且R3为如b)中定义的化合物；d)Ri为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被羟基取代的乙基，且R3为下式的化合物O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIe)Rt为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被^取代的甲基，且R3为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIIf)Rn为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被1H-吲味-3-基取代的甲基，且Rs为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>VIIIg)R为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被对甲基苯基取代的甲基，且R3为如f)中定义的化合物。本发明提供的化合物在下文被命名为"(根据)本发明的化合物"。本发明的化合物包括任何形式的化合物，例如游离形式，盐形式，溶剂化物形式以及盐和溶剂化物的形式。本发明在另一方面提供了盐形式的本发明化合物。这类盐优选包括可药用盐，不过，可以包括不可药用的盐，例如用于制备/分离/纯化目的。本发明化合物的盐包括金属盐或酸加成盐。金属盐包括例如碱金属或碱土金属盐；酸加成盐包括式I化合物与酸形成的盐，所述的酸为例如氢富马酸(hydrogenfumaricacid)、富马酸、^1，5-磺酸、盐酸、氘氯酸；优选盐酸。可以将本发明游离形式的化合物转化成相应的盐形式的化合物，反之亦然。可以将游离形式或盐形式以及溶剂化物形式的本发明化合物转化成游离形式或非溶剂化形式的盐形式的相应化合物，反之亦然。本发明的化合物可以以纯的异构体或其混合物的形式存在；例如光学异构体、非对映异构体、顺/反异构体。本发明的化合物可以例如包含不对称碳原子，且由此可以以对映异构体或非对映异构体及其混合物，例如外消旋物的形式存在，任何不对称碳原子均可以以(R)、(S)或(R，S)构型，优选(R)或(S)构型存在。适用的情形下，可以按照，例如与常规方法类似的方式分离异构体混合物而得到纯的异构体。本发明包括任何异构体形式和任何异构体混合物形式的本发明化合物。本发明还包括式I化合物的互变异构体，在可以存在互变异构体的情况下。本发明在另一方面提供了用于生产式I化合物的方法，其中-R3为式III的化合物，该方法包括步骤<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中RpR2、R6和R7如上述所定义，从而得到式I的化合物，并分离从反应混合物中获得的式I化合物；或-R3为式II的化合物，该方法包括步骤其中Ri、R2、R4和Rs如上述所定义，从而得到式I的化合物，并分离从反应混合物中获得的式I化合物。在式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中间体(原料)中，官能团，如果存树脂-连接基团-Br树脂-连接基团-NH-R,NH-Z树脂-连接基团hooc-ivcooh树脂-连接基团a)+R7-NH2b)光解+1,4-二溴-2,3-丁二酮在的话，任选可以为被保护形式或盐的形式，如果存在成盐基团的话。保护基任选存在，可以在适当阶段除去，例如按照与常规方法类似的方法。可以将如此获得的式I化合物转化成另一种式I化合物，例如或以游离形式获得的式I化合物可以被转化成式I化合物的盐，反之亦然。式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中间体(原料)已知或可以按照，例如与常规方法类似的方法或如本文所述制备。适用的情形下，可以例如按照，例如与常规方法类似的方法，或例如本文详细说明的方法制备本文所述的任何化合物，例如本发明的化合物以及式IIIa、IIIb、IIa、IIb或IIc的中间体。本发明在另一方面提供了本发明化合物作为抑制剂的用途，用于抑制含ARE的mRNA与靶蛋白质如HuR蛋白之间复合物的形成。在优选的方面，含ARE的mRNA选自IL-2、IL-ip和TNF-ou本发明的化合物，例如包括式I的化合物，表现出药理学活性，由此可用作药物。本发明在另一方面提供了本发明化合物作为药物的应用。就药物应用而言，本发明的化合物包括一种或多种，优选一种本发明的化合物，例如本发明两种或多种化合物的组合。本发明在另一方面提供了药物组合物，其包括发明的化合物与至少一种药物赋形剂，例如适宜的载体和/或稀释剂，例如包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖类和增甜剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐，和/或緩冲剂。本发明在另一方面提供了本发明的药物组合物，其还包括其他药物活性物质。例如，可以按照与常规方法类似的方法，例如通过混合、制粒、包衣、溶解或冻干法制备这类组合物'例如，单位剂型可以含有约0.5mg至约1000mg，如lmg至约500mg。本发明在另一方面提供了本发明化合物在制备用于治疗病症的药物例如药物组合物中的用途，所述病症具有与选自如下的物质的产生相关的病因细胞因子、生长因子、原癌基因或病毒蛋白质，优选所述物质选自IL-1、IL画2、IL-3、IL-4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox画2、c-fos和c-myc。本发明在另一方面提供了治疗病症的方法，所述病症具有与选自如下的物质的产生相关的病因细胞因子、生长因子、原癌基因或病毒蛋白质，优选所述物质选自IL-1、IL-2、IL-3、IL画4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c-fos和c-myc，所述治疗方法包括对有这类治疗需要的受试者施用有效量的本发明化合物；例如以药物组合物的形式。治疗包括治疗和预防。就这类治疗而言，适宜的剂量当然根据例如所用的本发明化合物的化学性质和药代动力学数据、宿主个体、给药方式和所治疗疾病的性质和严重程度的不同而改变。然而，一般而言，对于较大的哺乳动物，例如人，为了取得令人满意的效果，指示每日剂量范围为约0.01g至约1.0g的本发明化合物；例如，便利的是每天分剂量施用多达4次。可以通过任何常规途径给予本发明的化合物，例如肠内给药，例如包括鼻部、口含、直肠、口服给药；非肠道给药，例如包括静脉内、肌内、皮下给药；或局部给药，例如包括表皮、鼻内、气管内给药；例如以包衣或不包衣片、胶嚢、可注射溶液或混悬液的形式，例如以安瓿、小瓶的形式，霜剂、凝胶、糊剂、可吸入粉剂、泡沫剂、酊剂、唇骨、滴剂、喷雾剂的形式或栓剂的形式。可以以可药用盐的形式给予本发明的化合物，例如酸加成盐或金属盐；或游离形式；任选溶剂化物的形式。本发明盐形式的化合物表现出与本发明游离形式，任选溶剂化物形式的化合物相同的活性等级。本发明的化合物可以单独或与一种或多种其他药物活性物质联合用于本发明的药物疗法。联合用药包括固定的组合，其中两种或多种药物活性物质在相同的制剂中；试剂盒，其中在单独的制剂中的两种或多种药物活性物质作为同一包装销售，例如附带共同施用的说明书；以及游离的组合，其中单独包装药物活性物质，但给出了同时或序惯施用的说明书。图l:测定原理(图示)一旦蛋白质结合至标记的(如Cy3-标记的)mRNA(此处3，末端标记)，则环境敏感性标记(如Cy)的量子产率增加。这种增加可以检测为适当读出值的增加，例如根据FIDA算法的分子亮度的增加，或例如为使用整体均值读出值的总荧光强度的增加。对处于标记(如Cy3标记)近端(A)或远端(B)的mRNA序列内的蛋白质结合位点而言，等同地观察到了这种效应。图2:代表性Cy3FIDA测定mRNA-蛋白质结合曲线显示了HuRn与IL-2(A)、IL-ip(B)和TNF-a(C)的3，末端Cy3标记的3，UTR(-未翻译区)相互作用的代表性结合曲线。按照如下文实施例中给出的Eq.l测定解离常数(Kd)。为了排除HuR与Cy3的非特异性相互作用，使用游离染料(D)作为阴性对照.Cy3分子亮度在使用BSA卜牛血清白蛋白)作为对照蛋白质(E)滴定IL-23，UTR时仍然保持不变，3，末端Cy3标记的RNA的浓度在所有实验中均为0.5nM。不含任何HuR结合位点的5SRNA在所有样品中以100nM的浓度存在，作为非特异性竟争RNA。然而，在没有任何竟争RNA存在的情况下记录到了几乎相同的结合曲线(TNF-a3，UTR，(F)所示)，图3:图2中所示的结合实验的RNA转录物用Cy3标记人IL-2、IL-ip和TNF-a的3，UTR体外转录物(GenBank登录号NM—000589、NM_000576和NMJ)00594;分别为707-1035、897-1490和872-1568位)的3，末端。尽管HuR结合位点(蓝色所示)与3，末端标记的(序列)邻近程度不同，但是在蛋白质结合时一致性地观察到了Cy3量子产率的增加。在下列实施例中，所有温度均为摄氏度并且未校准。使用下列缩写BSA牛血清白蛋白Cy3荧光染料FCS荧光相关光镨FIDA荧光强度分布分析HuRfl全长HuR蛋白HuR1)2HuRn的截短变体OD光密度PBS磷酸盐緩沖盐液RP-HPLC反相高效液相色镨法rt室温CONA共焦纳米扫描DMF二甲基甲酰胺HuR12HuR的截短变体TMR5，氛基四甲基罗丹明rt室温实施例A)筛选试验使用酰肼活化的Cy3(AmershamBiosciences),按照标准方案(例如QinPZ等，Methods1999;18(1):60-70)对体外转录的mRNA进行3，末端标记。通过RP-HPLC纯化标记的RNA。通过UV/VIS光镨法控制1:1的化学计量。在测定緩冲液(PBS，0.1%(w/v)PluronicF-127,5mMMgCl2)中于80°将Cy3-标记的mRNA加热变性2分钟并且通过以-0.13。s_1的梯度冷却至室温进行重折叠。每份样品中标记RNA的终浓度为0.5nM，它可确保在下述^殳定条件下的共焦体积中的荧光颗粒的平均值<1。基于来源于平行FCS评价的颗粒数量和共焦体积大小来测定每份样品的精确浓度，这是通过调整点散布函数的^t得出的。随着重组HuRfl或HuRw浓度的增加滴定荧光标记的RNA。在真正平衡条件下，通过使用1D-FIDA测定分子亮度来监测HuR-mRNA复合物的形成(例如KaskP.等，Introductiontothetheoryoffluorescenceintensitydistributionanalysis.FLUORESCENCECORRELATIONSPECTROSCOPY:THEORYANDAPPLICATIONS65PGL396-409.2001[Figures]-409;KaskP.等，Fluorescence-intensitydistributionanalysisanditsapplicationinbiomoleculardetectiontechnology.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica924，13756-13761.23-11-1999)。或者，可以使用常规整体均值检测法，例如荧光平板读出器测定Cy3荧光强度。在EvotecOAIPickoScreen3仪器上的96孔或384孔玻璃底微量滴定板(Whatman)中于室温(恒定在23.5°)进行FIDA测量。基于Olympus倒置显微镜1X70的仪器配备有2台荧光检测器，一面荧光M路径中的二向色镜。HeNe激光(Ji=543nm，激光能=478^W)用于荧光激发。使用具有OD=5的千涉屏障滤光片阻断来自光检测路径的激发激光。利用测定緩冲液中的Cy3或TMR(c=0.5nM)调整共焦针孔(70nm)。对20个连续测量值(各10秒)的1D-FIDA信号的求平均值。使用FIDA算法分析原始数据以提取^与常规整体平均测量值相当的平均分子亮度；或〈^具有相应分子亮度的各组分的平衡浓度(游离mRNA对复合物)。通过非线性最小二乘回归拟合分子亮度数据(GraFit5.0.3，Erithacus软件，London),以使用来源于质量作用定律的结合方程式的准确代数解法来提取平衡解离常数&,描述如下^平均稳态信号q依赖于解离常数U所确定的(l:l)复合物形成程度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>方程式l其中,"iiAMc/:RNA的总浓度，HuR的总浓度，游离RNA的分子亮度，^^:RNA-HuR复合物的分子亮度，《在指定HuRo和RNAo浓度下稳态平衡的平均分子亮度；W解离常数iQ所确定的游离及结合蛋白质的mRNA的平衡浓度(分别为,m/AC4/,M/和/miA^.好《及/，通过FIDA分析直接得出)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>方程式2HuR与Cy3标记的各耙mRNA相互作用的代表性结合曲线如图2所示(所有列出的数据为20个FIDA测量值的平均值，并代表至少三次独立的实验)。概括地讲，本测定法提供了新的监测均质溶液中(调控性)mRNA蛋白质间相互作用的手段。该测定法组合了真正平衡条件与高检测灵敏度和精确度的优点，并适合于在高通量筛选中筛选相互作用的潜在抑制剂或调节剂。由于使用了大量转录后调控的疾病相关靶标，所述测定法基于新的RNA寻粑手段将可用作癌症、炎症、病毒或过敏性疾病的治疗干预手段。B)分析方法a)HPLC:为了进行分析分离，使用由2个泵单元306、动态混合室组件811C、测压组件805、UV-检测器UV/VIS155和自动注射器234组成的Abimed(D國Langenfeld)HPLC系统。在Grom(D-Herrenberg)生产的分析柱GromSil150ODS-5ST(3jim，120x2mm)上进行分离。使用H2O/0,l%TFA(v/v)(洗脱液A)和乙腈/0，1°/。TFA(v/v)(洗脱液B)梯度，流速0.4mL/分钟。分别在入=214和人二305nm处测定UV轨迹。基于在k=214nm处测定的峰面积给出产物的纯度。b)ES-MS:使用带有Waters(D-Eschborn515装配泵(等度流速60pL/分，乙腈/水1:1,含0，1%甲酸)和Abimed(D-Langenfeld)Gilson232X自动采样器的Micromass(Altrinchan/UK)QuattroII三联四^tti瞽仪进行ES-MS-分析。c)LC-MS:使用带有HPLC-系统2790AllianceHT分离组件和996二极管阵列检测器的Waters-Micromass(D-Eschborn)ZQ质谱仪进行LC-MS-分析。使用Grom(D-Herrenberg)生产的分析柱GromSil120ODS-5ST(3jim，60x2mm)。使用H2O/0，l%TFA(v/v)(洗脱液A)和乙腈/0，1%TFA(v/v)(洗脱液B)梯度，流速0.6mL/分钟。d)制备型HPLC:为了进行制备型分离，使用由泵单元322、UV检测器UV/VIS151(X-305nm)和Gilson215液体处理器组成的Abimed(D-Langenfeld)HPLC系统。在Merck(D-Darmstadt)生产的制备柱PurospherRP18(5pm，125x25mm)上进行分离。使用H2O/0，l%TFA(v/v)(洗脱液A)和乙腈/0，1%TFA(v/v)(洗脱液B)梯度，流速30mL/分钟。实施例1-3:按照方案l合成化合物1-3<,NH，iTentaGelSNH2方案1Lr〇V^Br三rvPL、Br伯胺R1R，-NH24a,bor、r5a,5b4bH'NO6、NH2PLl)氨基酸6a-fPLr12)ct-脱保护^^5a,5b73~e,83-bNH，63幼6c6d6e6f被保护的氨基酸6a-f(R2)、Boc0、T、fmoc、t"8u、Ffnoc、Fmoc、Fmoc、Fmoco对称二酸9a，9b7a，8a<bS、乂R，、乂OH9b对称二酸R3一^PL义乂，R3、一OH"a乂PLB、乂.B、胺R'OO13aS、乂J5、12R413b~c1)脱保护ftHH2)光-裂解(366nm)jjHHcr、;V丫R'丫、'-^Ar丫V、'""13a《a)带有连接基团的固相支持物的上样用DMF(4x20mL)预洗涤4.2gTentaGelSNHr树脂1(上样量-0.25mmol/g)。将0.82g的4-溴甲基-3-硝基苯曱酸2和0.482g的HOBt*H20溶于60mL8o/oDMF的DCM溶液中(v/v)。加入487的DIC。于室温搅拌30分钟后，将获得的溶液转入预洗涤的TentaGelSNHr树脂1上。将获得的混合物于室温振摇19小时。过滤出获得的树脂3，用DMF(6x50mL)、DCM(6x50mL)和MeOH(6x50mL)洗涤，并减压干燥。通过阴性Kaiser水合茚三酮试验验证反应完成。b)树脂3与伯胺类4a，4b的反应向3.18g处于20mLDMSO中的树脂3中加入2.133g1-(3-氨丙基)-吡咯烷-2-酮(4a)。向1.27g处于10mLDMSO中的树脂3中加入0.73g的4-甲基苄胺(4b)。将获得的混合物于室温振摇3小时。过滤出获得的树脂5a和5b，用DMSO(3><6mL)、DMF(6x6mL)、DCM(6x6mL)、MeOH(6x6mL)洗涤，并减压干燥。氯醌试验为阳性。c)树脂5a-b上被保护氨基酸6a-f的偶联及N(a)保护基(Fmoc)的裂解将0.65g树脂5a分成5等份。将0.65g树脂5b分成2等份。将0.45mmol各N-保护的氨基酸6a-f(6a:N(a)-Fmoc画N(y)-Boc-L-2，4曙二氨基丁酸，2倍；6b:Fmoc-(OTrt)-L-高丝氨酸；6c:Fmoc-Asp(OtBu)-OH;6d:Fmoc-Trp(Boc)-OH;6e:Fmoc-L-4-MePhe-OH;6f:Fmoc-L-(4國Boc-氨甲基)Phe-OH各自溶于5mLDMF、93jiLDIC和92mgHOBt*H20中。将获得的溶液在室温搅拌30分钟。将获得的活化6a的溶液分成2等份。将这2等份分别转入树脂5a和树脂5b等份试样中，得到侧链被保护的树脂7a和8a。将获得的活化的6b-e溶液转入剩余的树脂5a等份试样中，得到被保护的树脂7b-e。将含6f的溶液转入树脂5b的第二等份试样中，得到净皮保护的树脂8b。于室温振摇16.5小时后，过滤出获得的树脂，并用DMF(9x10mL)，DCM(6x10mL)和MeOH(6x10mL)洗涤。减压千燥完全4皮保护的树脂7a-e和8a-b。所有氯醌试验均为阴性。将哌啶DMF(400mL，1/1，v/v)贮液的等份试样(5mL)加入到各0.66g被保护的树脂7a-e和8a-b中，以裂解N(a)-Fmoc保护基。将获得的混合物振摇30分钟。过滤出获得的脱保护的树脂7a-e、8a-b，并反复用DMF(9x25mL)、DCM(6x25mL)和MeOH(6x25mL)洗涤。减压干燥获得的树脂。Kaiser水合茚三酮试验为阳性。d)含对称二羧酸亚结构的化合物14a-c的合成Fmoc脱保护的树脂7a和8a-b上对称二羧酸9a和9b的偶联将对称二羧酸9(9a:吡咬-2，6-二甲酸；9b:对苯二甲酸，2倍；各1.5mmol)溶于115mgHOBt*H20、485mgDIEA和95mgDIC的5mLDMF溶液中。将获得的9a的溶液加入到树脂7a中而得到树脂10a。将获得的2等份9b溶液分别加入到树脂8a和8b中而得到树脂10b和10c。于室温振摇20小时后，过滤出获得的树脂10a-c,用DMF(9x20mL)、DCM(6x10mL)、二乙基醚(6xl0mL)洗涤，并减压干燥。所有树脂样品的Kaiser水合茚三酮试验均为阴性。e)树脂结合的二羧酸单酰胺10a-c与氨基酸酰胺11和伯胺12的偶联将339mg三氟乙酸五氟苯酯(pentafluorophenyltrifluoroacetate)和242nL吡咬的5mLNMP溶液加入到各650mg树脂10a-c中。将获得的混合物于室温振摇2.5小时。过滤出获得的树脂，并用NMP(10x5mL)洗涤。将298mg(O-Trt)保护的L-苏氨酸酰胺盐酸盐(ll)溶于20.3mg无水HOBt和3mmolDIEA的3.0mLNMP溶液中，并加入到650mg预活化的树脂10a中而得到树脂13a。将182mg3-甲氧基节胺(12)溶于40.6mg无水HOBt和1.5mmolDIEA)的6.0mgNMP溶液中。将获得的溶液分成2个等份，将它们分别加入到预活化的树脂10b和10c中而得到树脂13b和13c。将获得的混合物于室温振摇14.5小时。过滤出获得的树脂，用NMP(6x10mL)、DMF(6x10mL)、DCM(6x10mL)和MeOH(6x10mL)洗涤，并减压干燥。f)Boc-保护基自氨基酸6侧链上的裂解将5mL50%TFA的DCM(v/v)溶液加入到650mg各树脂13a-c中。将获得的混合物于室温振摇2小时。过滤出获得的树脂，用2(T/。TFA的DCM溶液(Wv，3x5mL)、DMF(6x10mL)、DCM(6x10mL)和无水EtOH(6x10mL)洗涤，并减压干燥。g)最终化合物14a-c从树脂13a-c上的裂解将5mLMeOH+1%TFAv/v)加入到脱保护的各树脂13a-c中。将含树脂的玻璃瓶置于塑料载体中用于光解。在配备有NECBlacklightT5，FL8B1，8W-灯的Stratagene，UVStrataliner1800上于366nm处搅拌进行光解90分钟。在光裂解过程中使用加压气流冷却室。过滤出获得的树脂材料，并用DCM(2x5mL)洗涤。从获得的滤液中蒸发溶剂。可以通过制备型HPLC对此粗提材料进一步进行纯化。实施例1:获得吡啶-2，6-二甲酸2-({3-氨基-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙基氨基曱酰基I-丙基}-酰胺)6-[(1-氨基曱酰基-2-羟基-丙基)-酰胺l。iWTF-49丄5552保,^/7《丄8为、斧1C-MS/iW^i//:"2实施例2:获得N-3-絲-l-(4-甲基-千絲甲酰基)-丙基-N，-(3-甲緣-苄基)-对苯二甲酰胺。MfF=M&5"保萝^A7:为、斧1C-MS/M"好/V4卵实施例3:获得N-[2-(4-氨甲基-苯基)-l-(4-甲基-苄脉甲酰基)-乙基-N，-(3-甲氧基-苄基)-对苯二甲酰胺。5".6P谬萝^/>7:为、伊IC-MS/M4^/":565实施例4-7:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>a)树脂7b-e的乙酰乙酰化将N(a)脱保护的树脂7b-e放入5mL注射器。将359mgN-羟基琥珀酰亚胺基乙酰乙酸酯15溶于17.0mLDCM。加入310mgDIEA，并将4mL该J^液的等分试样转入650mg各树脂7b-e的各注射器中。于室温振摇5小时后，过滤出获得的乙酰乙酰化树脂16a-d，用DCM(3x5mL)、DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和MeOH(6x5mL)洗涤并干燥，Kaiser水合茚三酮试验为阴性.b)树脂l"-d与伯胺na-c的反应(烯胺酮形成)将5mLTHF和TMOF的贮液(1/1，v/v)加入到650mg各树脂16a-d中。加入1.5mmol各伯胺17a-c(17a:与树脂16a反应的2-甲氧基乙胺；17b:与树脂16b反应的2-(3-甲氧基苯基)-乙胺；2倍17c:分别与树脂16c和16d反应的千胺)，并于室温将获得的混合物振摇18小时。过滤出获得的树脂18a-d,用THF/TMOF(1/1，v/v)(3x6mL)、DMF(6x6mL)、DCM(6x6mL)和MeOH(6x6mL)洗涤并干燥。c)自树脂结合的烯胺酮18a-d与1,4-二溴-2,3-丁二酮19合成吡咯将230mg2，6-二-叔丁基吡梵和292mg1，4-二溴-2，3-丁二酮19溶于24mL二噁烷而得到贮液。将获得的贮液的等分试样(6mL/树脂)加入到650mg各树脂18a-d中。将获得的混合物于室温振摇1.5小时。过滤出获得的树脂20a-d,用二巧悉烷(6x6mL)、DMF(6x6mL)、THF(6x6mL)和DCM(6x6mL)洗涂。d)用仲胺21a和21b取代树脂结合的溴乙酰基-吡咯20a-d将192mg各仲胺21(21a:与128mg树脂20a反应的哌咬-4-甲酰胺，21b:与128g树脂20b-d反应的哌咬)和DMSO(4x6mL)加入到650mg各树脂20a-d中。将获得的混合物于室温振摇15.5小时。过滤出获得的树脂22a誦d,用DMSO(3x1mL)、DMF(6xlmL)、DCM(6x1mL)和MeOH(6x1mL)洗涤并干燥。e)保护基从氨基酸6侧链上裂解(树脂22a-c)将5mL20%TFA的DCM溶液(v/v)加入到各树脂22a-c中以便除去RZ上的侧链保护基(Trt、"Bu、Boc)。将获得的混合物于室温振摇1小时。过滤出获得的脱保护的树脂22a-c，用20°/。TFA的DCM溶液(v/v，3xlmL)、DMF(6x2mL)、DCM(6x2mL)、EtOH(6x2mL)和乙醚(3x2mL)洗涂并干燥。f)最终化合物23a-d从树脂22a-d上裂解将5mL酸性甲醇和1%v/vTFA加入到各脱保护的树脂22a-c和未经TFA处理的树脂22d中.将玻璃瓶置于塑料载体中。在配备有NECBlacklightT5，FL8B1，8W-灯的StratageneUVStratalinerTM1800上在搅拌和366nm辐照下光解90分钟。在光-裂解过程中使用加压气流冷却室，过滤出获得的树脂材料并用DCM(2x5mL)洗涤，蒸发获得的合并滤液中的溶剂。可以通过制备型HPLC对化合物的粗提材料进一步进行纯化.实施例4:获得1-{2-4-{3-羟基-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙基氨基甲酰基l-丙基氨基甲酰基}-1-(2-甲氧基-乙基)-5-甲基-111-吡咯-2-基1-2-氧代-乙基}-哌啶-4-甲酸酰胺。MTT=576.699保,时河2.^/为、斧丄C-AfS/M"jy/":577实施例5:获得3-{1-2-(3-甲氧基-苯基)-乙基-2-甲基-5-(2-哌啶-1-基-乙酰基)-lH-吡咯-3-羰基卜氨基)-N-3-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-丙基-琥珀酸。3/fF=621756錄勢#/《7.59为、妒1C-MS7A^H广实施例6:获得1-苄基-2-甲基-5-(2-哌咬-1-基-乙酰基)-111-吡咯-3-甲酸口-(lH-吲咮-3-基)-1-[3-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-丙氨基甲酰基-乙基}-酰胺。MW=65汰S2S錄^^/>7:为、妒LC-MS/Af1^/:65/实施例7获得1-苄基-2-甲基-5-(2-哌咬-1-基-乙酰基)-lH-吡^"3-曱酸{1-[3-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-丙氨基甲酰基卜2-对甲苯基-乙基}-酰胺，实施例8:抑制结合HuR的mRNA稳定性调控的小分子抑制剂的鉴定为了鉴定抑制结合HuR的mRNA稳定性调控的小分子抑制剂，进行了三种不同的互补HT筛选(1)使用处于IL-2或TNF-a富含AU元件控制下的萤火虫荧光素酶的细胞报告基因测定。设计本测定法用于抑制鉴定ARE介导的mRNA稳定的细胞活性无毒性抑制剂。使用荧光素酶CDS在IL-2或TNF-a启动子控制下的对照试验中测试确认的命中抑制剂，以排除在转录水平上起作用的化合物。作为定义，鉴定的命中化合物沿ARE路径在一定水平上干扰短寿命AREmRNA的转录后稳定。(2)使用共焦波动光镨法体外筛选HuR-ARE抑制剂。本测定法使用2D-FIDA监测HuR12即HuR截短变体与TMR标记的ARERNA在溶液中的结合。预计在本筛选中鉴定的化合物通过结合ARE或HuR12而干扰HuR-ARE识别。(3)4吏用HuR的CONA。使用CONA对珠上的组合文库筛选高亲和力HuR结合剂。在采集了命中的珠并从固相支持物上裂解珠上的结合剂后，通过jiHPLC-MS对化合物结构进行解码。在溶液中测试重新合成的命中化合物与HuR的结合。作为初步结果，鉴定的化合物代表了高亲和力HuR结合剂。它们在功能上可以为任意HuR活性的抑制剂，所述HuR活性包括ARE识别、核质穿梭和防止mRNA的ARE依赖性降解。基于^=^/wJ/(rT/wwJ+2()w^"，由各向异性数据计算结合的RNA级分》其中r三测量的各向异性，r油、r麵分别三游离和结合HuR的RNA的各向异性，gs猝灭。使用Mathematica5.0.0中的XMfl汰拟合的非线性曲线，假定l:l:l的化学计量竟争性抑制，来测定解离常勤W。。表l.HuR抑制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>基于结合HuRn的ARERNA的竟争性实验测定化合物的解离常数权利要求1.鉴定调节mRNA与靶蛋白质之间相互作用的物质的测定法，包括a)提供长度至少为100个核苷酸的标记的mRNA，任选作为均质溶液提供，所述标记为对mRNA环境中的改变敏感的物质；b)在不存在和存在候选化合物的情况下使靶蛋白质与步骤a)中提供的mRNA接触，所述候选化合物预期将在所述mRNA与所述靶蛋白质之间能够形成复合物的足够长的时间内调节所述mRNA与所述靶蛋白质之间的相互作用；c)检测步骤b)中形成的复合物；d)测定在步骤b)中不存在或存在候选化合物的情况下所形成的复合物的量是否存在差异；和e)将在步骤d)中测定到差异的候选化合物选为鉴定物质。2.权利要求1所述的测定法，其中的标记为荧光染料，如Cy3或Cy5。3.权利要求1或2中任一项所述的测定法，其中通过测量荧光强度来检测复合物。4.权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中所述靶蛋白质为HiiR蛋白。5.权利要求1至4中任一项所述的测定法，其中mRNA选自IL-2、IL國1(J和TNF-a,6.权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中mRNA长度为100至500个核苷酸，优选300个核苷酸。7.权利要求1至6中任一项所述的测定法，用于高通量筛选，8.试剂盒，其包括-标记的mRNA，例如荧光标记的mRNA;-把蛋白质；-使用这类试剂盒的说明书；和-任选的候选化合物，9.下式I的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ri为被如下基团取代的(Cw)烷基未被取代或取代的(Q.一芳基或具有5或6个环成员和1-4个选自N、O和S的杂原子的杂环基；R2为被如下基团取代的(C一烷基羟基、氯基、氨基或未被取代或取代的(<:6.18)芳基，或R2为未被取代或取代的(Cw8)芳基；且R3为未被取代或取代的(Cw8)芳基，或具有5或6个环成员和1-4个选自N、O和S的杂原子的杂环基。10.权利要求9的化合物，其中&为被如下基团取代的(Cw)烷基未被取代或取代的苯基或具有5个环成员和N作为杂原子的杂环基；R2为被如下基团取代的(Cw)烷基羟基、羧基、氨基或未被取代或取代的苯基，或R2为未被取代或取代的苯基；且R3为未被取代或取代的苯基，或具有5或6环成员和N作为杂原子的杂环基。11.权利要求9或10中任一项的式I的化合物，其中R,为被对甲基苯基取代的甲基或被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基；R2为被g取代的甲基、被对甲基苯基取代的甲基、被111-吲哚-3-基取代的甲基、被羟基取代的乙基、被ll^或对甲基苯基取代的乙基；且R3为下式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R4为l-哌啶或l-(对氨基羰基)-哌啶；Rs为甲氧基乙基、苄基或(对甲氧基苯基)-乙基；或下式III的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R6为对苯基或间吡啶；且R7为被间甲氧基苯基或l-氨基羰基-2-羟基丙基取代的甲基,12.下式I的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中a)Ri为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被M取代的乙基；且Rs为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>b)R为被对甲基苯基取代的甲基，R2为被ll^取代的乙基；且R3为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>c)R为被对曱基苯基取代的甲基，R2为被对氨基甲基-苯基取代的曱基，且R3为如b)中定义的化合物；d)Ri为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为净皮羟基取代的乙基，且R3为下式的化合物e)Rt为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为^J^取代的甲基，且R3为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>f)A为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被1H-吲哚-3-基取代的甲基，且R3为下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>12.g)R为被l-吡咯烷-2-酮取代的正丙基，R2为被对甲基苯基取代的甲基，且R3为如f)中定义的化合物。13.权利要求9至12中任一项的化合物，为盐的形式。14.权利要求9至13中任一项的化合物作为抑制剂的用途，所述抑制剂抑制含ARE的mRNA与靶蛋白质之间的复合物形成。15.权利要求14所述的用途，其中靶蛋白质为HuR。16.权利要求9至13中任一项的化合物作为药物的用途。17.权利要求9至13中任一项的化合物在制备治疗病症的药物中的用途，所述病症具有与选自下列的物质的产生相关的病因细胞因子、生长因子、原癌基因或病毒蛋白质，优选选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c-fos和c-myc。18.药物组合物，包括权利要求9至13中任一项的化合物与至少一种药物赋形剂，19.权利要求18的药物组合物，还包括其他药物活性物质。20.治疗病症的方法，所述病症具有与选自下列的物质的产生相关的病因细胞因子、生长因子、原癌基因或病毒蛋白质，优选选自IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL誦8、GM-CSF、TNF-a、VEGF、AT-R1、Cox-2、c画fos和c-myc，所述治疗方法包括对有这类需要的受试者施用有效量的权利要求9至13中任一项的化合物。21.权利要求20的方法，其中同时或序惯地联合施用权利要求9至13中任一项的化合物与另一种药物活性物质。全文摘要本发明涉及鉴定调节mRNA与靶蛋白质如HuR之间相互作用的物质的测定法，以及式I的有机化合物，其中R<sub>1</sub>、R<sub>2</sub>和R<sub>3</sub>如文中所定义；并且本发明涉及这些化合物的用途，例如作为针对含ARE的mRNA与靶蛋白质之间复合物形成的抑制剂。文档编号G01N33/536GK101133325SQ200680006844公开日2008年2月27日申请日期2006年3月1日优先权日2005年3月3日发明者H·格斯塔奇,M·奥尔,M·欣特施泰纳,N-C·梅斯纳,T·申德勒申请人:诺瓦提斯公司