生物指示器的制作方法

专利名称：生物指示器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于监控灭菌或消毒等处理效果的生物灭菌指示剂，其载体 表面含有与一个或多个微生物通过交联剂共价交联的官能团。该指示剂能按需要 地包含均匀一致的微生物种群，这些微生物种群能用于评估对医疗用具和附件、 器械、溶液、表面、衣物等物品的各种灭菌处理的效果，从而使该指示剂能指示 对这些将要重复使用或做最终消毒物品灭菌处理的程度或灭菌是否成功。
背景技术：
生物指示剂用于检测和/或确定灭菌处理的效果。典型的生物指示剂含有计 量的微生物种群数，所述的微生物种群对灭菌处理有很高的耐受性。在经过灭菌 处理以后，于培养基中培养该生物指示剂以激发存活下来的活性微生物生长。自 带型的生物指示剂内自带培养基，该自带培养基一般是置于一易碎的小瓶中。芽 孢指标生物指示剂在进行灭菌处理后和一单独的含培养基的容器一起使用。接下 来的通过培养基颜色的变化或浑浊来表示的微生物生长，表明灭菌处理是无效 的。
细菌芽孢在选择指示微生物时常受到青睐，因为芽孢比大多数其他类型的微 生物对灭菌处理的耐受性强。因此， 一旦一灭菌处理能杀灭微生物芽孢，那么也 一定己杀灭任何其他污染微生物。
细菌芽孢的选择依赖于灭菌方式、灭菌类型和被评估的技术手段。比如，嗜 热脂肪地芽孢杆菌(Geo6acz7/wWearaAmwo/7Mws)的芽孢用于监测采用湿热、 过氧乙酸、过氧化氢及其他过氧化合物的液相和气相态灭菌系统中，因为这类指 示剂对氧化物有高耐受性。与此相似，枯草芽孢杆菌(5ad//^ 则用于 监测乙二醇消毒及干热灭菌系统中。
微生物通常负载在一载体或基质上，比如一个长条或圆盘上。基质由与灭菌 处理能相容的、且不含有可能影响灭菌程度判定的材料制成。如滤纸、色层分析
纸、吸墨纸、玻璃纤维、聚合塑料、陶瓷、不锈钢以及金属氧化物等材料，都常 用作底物或基质使用。
为了将微生物分散在基质之上，通常将微生物在水或乙醇中的混悬液泵入一 注射针，该注射针是悬于一纸质或其他基质材料网格之上的。纸在注射针下以一 恒定速度移动，在注射针下经过后，其上形成了混悬液的轨迹。或者，通过一微 量加液器将混悬液手动转移到基质上。接下来将浸渍纸网格切割成合适的尺寸用 作指示剂，典型地为检测长条或检测圆盘。
除了置于基质表面的微生物的数量可控的需要外，将微生物充分地固定在底 物表面也是很重要的。将微生物连接在基质表面上的方法很多，包括利用疏水作 用和静电相互作用、离子交换、范德华力进行连接。美国专利US4，478，946公开 了将非功能蛋白质吸附在基质表面，并采用交联剂来共价连接功能蛋白质到已吸
附的非功能蛋白质上的方法。然而，这些固定方法通常达不到所需的连接要求， 特别是在水环境中。美国专利US5,077,210涉及一种将如蛋白质类的活性剂共价 固定在携带有羟基的底物上的方法。将硅烷连接在基质上，并与双异官能团交联 剂配对连接在一官能团上，并保留另一与第一官能团不同自由官能团连接一蛋白 质并保持其高蛋白官能度。所述硅烷一方面含有能与基质上的羟基反应的官能 团，另一方面含有硫氢基末端基团与双异官能团交联剂的一个官能团反应，而双 异官能团交联剂包含一琥珀酰亚胺基团与活性剂的氨基基团反应。
发明概要
一种确定对复杂有机活体进行灭菌、消毒或其他消除生物活性的处理方法是 否有效的生物指示剂，包含基质，所述的基质自带有或添加有官能团，或在所述 的基质上有一自组装的表面层，如包含官能团的单层(SAM)。所述的功能团包 括羟基、卤族基团、氨基等等，并最好不包括硫代基。在一个优选的具体实施方 式中，采用交联剂，如双异官能团化合物，为指示微生物，如芽孢、植物组织、 或病原体到功能底物表面提供共价键连接。在这个具体实施方式
中，该指示微生 物牢固地结合到所述的表面层，优选结合到不带有表面层的基质，并且即使通过 冲洗、湍流冲击及类似方法也很难脱落。
在另一个具体实施方式
中，基质如玻璃的固有官能羟基，也能被利用。在这
个具体实施方式
中，指示微生物或者病原可以通过，但不限于物理的、电子的等
方法或通过氢连接，而不是通过共价键来与羟基官能表面连接。
在一个不理想的具体实施方式
中，功能基通过有机硅垸偶联剂添加到基质
表面，其中采用了两种不同的官能团。在这个具体实施方式
中，指示微生物通过
物理、电子等方法，而不是通过共价键而被连接到硅烷偶联剂上。
在上述的每一个具体实施方式
中，这些功能剂的应用都是均匀一致的，以保 证连接上的微生物种群也是均匀一致的。
生物指示剂广泛用于指示对各种物品如手术器械进行灭菌、消毒或其他消除 生物活性的处理方法的有效性，从而使得所述物品可以再次使用。
一种监测灭菌效力的生物指示剂，基质；位于基质上包含官能末端基团的表 面层；指示微生物；及共价交联到所述表面层官能团和共价交联到所述指示微生 物的交联剂；所述的表面层实质上不含有硅连接原子。
一种生物指示剂，包括基质和非必要地附于基质上的表面层，所述的基质 或所述的非必要的表面层含有官能团；病原，包括生化恐怖制剂、临床类有机体、 细菌的抗性株、或亚细胞成分、或它们的组合；和共价交联到所述基质的官能团 或所述的非必要的表面层官能团和共价交联到所述病原的交联剂。
本发明详细说明
生物指示剂用于监测和/或确定对微生物、蛋白酶传染性因子、病原体等进 行灭菌、消毒或灭活处理的杀灭效果的有效性，而这类微生物、蛋白酶传染性因 子、病原体等对此类杀灭活性的处理通常具有高耐受性。芽孢或孢子，比如，内 生孢子，是生物指示剂的优选微生物，因为它们通常对许多灭菌处理方法都有高 耐受力，而包括真菌、分枝杆菌、活细菌和原生动物等其他微生物，也能代替芽 孢或孢子。这类微生物理想的情况是含有硫基术端基团，如果没有，可以对这类 微生物进行硫醇盐处理以使其含有硫基末端基团。内生孢子的例子包括嗜热脂肪 地芽孢杆菌(Geo/ a"7/tw 5teflra^zenwo/ W/iw)、枯草芽孢杆菌(5a"7/j^抑6"fc)、 枯草芽孢杆菌球形变异(Sac!7/ws wto'/!'s g/oWgh')、产芽胞梭状芽胞杆菌 (C7o砍Wtw s; orage,)、蜡样芽胞杆菌(Saa'肠ce固s)、环状芽孢杆菌
(5ac/〃ws ">rw/a";y)。真菌的例子包括黑曲霉"^erg/〃w;y w/ger)、白色念珠菌 (Ca"(i油"/Wc"似)、须痛癣菌(7Hc/zo/7一o"靴幽grop一es)、 皮炎刀吉拉菌 (『a g^//a cfer/n加'to )。可以用于本发明的分枝杆菌包括龟分支杆菌 (Afyco6a"m', c/2e/0wae)、戈氏分枝杆菌(玲co6a"er/, go油朋e)、耳止始分 丰支杆菌 (^(Kco&a"er/w附^AMegwafc夕禾口地分枝杆菌 (^fyco6a"e〃'ww ,erme入
活细菌的实例包括嗜水气单胞菌(v4m w朋cw /^dra;^7fl)，粪肠球菌 (yheca/k )， 粪链球菌 (5ifre/7tococcMS y^ecafc )， 屎肠球菌 (五"feracoccws y^ec/w附)，胺链球菌 (iSf，fococcws p少rage"e5 )， 大肠杆菌 (Esc/^〃'c/n'a co//),月小'炎克氏杆菌(A7e&S7'e〃a/wewwom'ae)， 嗜月市性军团病杆菌 (丄eg/o"e〃a ;7加wmop/zz'/fl )， 甲基杆菌 (Me^y/o6fl"e〃'ww )， 绿脓假单胞菌 ( Psewtfowomw am^g/"aya)，猪霍舌L沙门菌(5b/,"e〃a c/w/eraew\s)，幽门螺旋 杆菌(7/e/ico6a"er;3y/o"')，金黄色葡萄球菌(5"to/ /^/ococcws a,ws)，表皮葡萄 球菌 (S啤/^/ococcws —flfem/tfo )， 嗜麦芽寡养单胞菌 (5"加o加/^o附o"a wfl/to;^///fl)。就活细菌而言，营养细胞和/或其组分可以以同样的机理附着在一 固体支持基体上，并能在干燥和保存的条件下，借着一种或多种的不同种类的辅 料的沉积作用而存活。辅料可以是广义上的普通可以用以使不稳定物质变得稳定 的惰性化合物。辅料的一个小类包括碳水化合物，特别是单糖和多糖。其中的一 个例子就是海藻糖的二糖化合物。有机体组织中的高浓度海藻糖使得这些有机体 可以在缺乏水分的环境中生存，并可以在脱水作用后复原其功能细胞组分。事实 上，众所周知海藻糖能为膜和其他大分子提供一种稳定性，这对于细胞在极端环 境(如冷冻干燥)中的生存是至关重要的。其他能起稳定作用的辅料化合物包括 (但不局限于此)单糖，如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、长链聚合物，长链聚合物如 葡聚糖、淀粉、琼脂糖和纤维素。其他的非碳水化合物基辅料也可包括蛋白质、 碳磷酸盐化合物、缓冲剂、蜡、脂质、油脂或其他碳氢化合物基材料。
原生动物的实例包括肠兰伯鞭毛虫(GiflW/a /awW/a)和小球隐孢子虫 (0>^tos/70〃Www / fl/-vw/w)。
本发明优选芽孢，因为芽孢对灭菌等处理有很高的耐受性。 除了监测和/或确定关于灭菌等各种处理的有效性以外，本发明也利用了内 生孢子、真菌等指示剂来关注和/或确定灭菌或消毒处理过程的效力。
病原和其他非模拟因子
病原包括恐怖生化制剂、临床制剂、亚细胞成分和某些细菌抗性株。除了用 以代表"最具耐受性"物质(如嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geo&acz7/^ W^ra/terwo/^7w))和前面提到的其他微生物为基础的模拟有机体以外，由于 非自我复制因子和其亚细胞组分或细胞产物的临床意义或因为它们在生化恐怖 武器上的应用，这些非自我复制因子和其亚细胞组分或细胞产物也能被应用。这 类微生物通常是天然的或经人工修饰后的对普通抗菌处理方法或化学消毒方法 有耐受性的菌株。上述类型的实例至少包括抗万古霉素肠道链球菌(Vancomycin Resistant ￡"/m>cocc/ ， VRE)，耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant S啤一ococcws， MSRA)禾口龟分枝杆菌(A^co6a"m'謂c/je/om')。 这些有机体具有重要的临床意义并引起特别兴趣，因为其典型代表VRE和 MASA，它们对典型临床治疗对策的抗性(抗生素抗性)己增大，而龟分枝杆菌 类的有机体对迄今为止有效的消毒方法具有耐受性(戊二醛抗性)。还有许多重 要的潜在病原，虽然它们目前还没有模拟替代物，但是它们对治疗过程或消毒方 法来说是个特殊的危险或挑战。其中一个例子就是蛋白酶传染性因子。蛋白酶传 染性因子本质上是没有生命的有机体，但是其作为致病因子的功能与其结构有 关，而且这种结构/功能关系能用以确定其相对传染性。其他非自养因子(如病 毒)，亚细胞因子和蛋白酶传染性因子一样，也考虑在本发明中。
能用于制成恐怖生化制剂或致病的病原包括炭疽(炭疽杆菌^ c/Z/"s "wAmc/i0， 肉毒(肉毒梭菌毒素C7oyWWww 6o/w//m/w toc/")，布氏菌属(波浪 热)，鼻疽假单胞菌w"〃e/ (鼻疽)，类鼻疽假单胞菌BwrttoWeha 戸ew^ww/Ze/ (类鼻疽)，鹦鹉热衣原体C7z/a附^^戸故ad (鹦鹉热)，霍乱(霍乱 弧菌W6n'o cto/erae)，产气荚膜梭状芽胞杆菌C/orfnWww戸7/n'"ge w (s-毒素)， Q热病原体C/oWnWiww，T/n'"ge";s(Q热)；传染病类包括如尼巴病毒(nipah virus) 和汉坦病毒属，大肠杆菌0 157:H7 (￡. Co//)，对食品安全的威胁(如沙门氏菌 种)，兔热病杆菌Fra"dse〃a ^/aw"w's (兔热病)，鼠疫(鼠疫耶氏菌yery/m'a ; e幼's)，蓖麻i /cz'mw comww"/s (蓖麻籽)中的蓖麻毒素，普氏立克次(氏)体 i /c&to!'a(斑疹伤寒)，伤寒沙门菌0^"'(伤寒)，志贺(氏) 杆菌(志贺(氏)菌病)，天花(重型天花Fan'o/a wa_/w)，葡萄球菌肠毒素B
5to;^j//c>cocca/e"/^ra/o;H>7B，霍舌L弧菌W6n'o c/w/erae (霍舌L)，病毒性脑炎Wra/ e ce/ /7"//to ( a病毒[如委内瑞拉马脑炎，东方马脑炎，西方马脑炎])，病毒性出 血热(纤丝病毒[如Ebola, Marburg])和沙粒病毒[如Lassa, Machupo],水安全威 胁物(如小球隐孢子虫Co^tospoW&iwiparvMW),禾B鼠疫耶氏菌J^w'w'"pejto(鼠 疫)，或它们的组合。
用于检测的微生物可以是单一种属或是多个种属的结合。当使用多个种属的 结合时，对医疗器械的典型灭菌过程的检测多优选嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geo6"a'〃ws 57^"厂0/77￡"附0/7////船)与枯草芽孢杆菌(^8"c/〃w5"jw^"7/50结合使用。
固体基质是芽孢载体材料的优选。这种基质可以是任意的无机材料，如硅，
包括结晶硅；各种玻璃包括苏打石灰、硼硅玻璃、磷酸盐玻璃、硼磷酸盐玻璃、 硼铝硅酸盐玻璃以及具有片状、纤维状、珠状、玻璃细球状等形状的类似物；称 为地球原材料的各种陶瓷，其中硅、硅的氧化物和被称作硅酸盐的复杂化合物为 其主要成分以及被加热到高温的陶瓷如结构粘土产品，包括瓦、陶、各种瓷、瓷 釉等；金属，例如钯、铂、铁、铜、金；各种带有刚刚罗列的金属表面的无机基 质或者元素周期表从第4族到第14族的各种金属氧化物，包括二氧化钛、氧化 锆、三氧化二铁、氧化铜、氧化铝、以及二氧化硅如石英、蓝宝石及其类似物。
其他可用的基质是各种有机化合物，包括各种形式的纤维素，比如纸、滤纸、 厚纸板及其类似物。基质也可以是各种多聚物，例如(但不限于)包括丙烯酸聚 合物和丙烯酸盐聚合物的丙烯酸脂聚合物，以及各种聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯、 聚乙烯醇、聚苯乙烯及其类似物。上述基质也可以是上述化合物的复合材料。
基质可以利用等离子、电子束、Y辐射、光子活化等进行电子和/或物理修 饰。这种处理可以利用基质现有的官能团、附加官能团，或使可以起作用的固有 官能团(如活性官能团)连接到基质表面的如羟基等官能团上。通常，这种被暴 露的表面至少需要部分是一个平面，虽然也可以根据本发明对曲面表面进行处 理；例如，基质的表面可以在试管的外表面或内表面形成，或者在多层板上形成， 或在珠状物或容器的外表面形成。基质优选为实体，但也可以是部分多孔或整体 多孔结构。
只要能为基质提供一暴露表面，基质就可以以各种形式存在。合适的形式 包括纤维、细丝、薄片、圆盘、片板、载玻片、结晶皿、封闭吸收池、玻璃安瓿
及其类似物。优选的基质包括多种形式的纤维素，如纸、滤纸、碱土铝硼硅酸盐 玻璃、聚苯乙烯及其类似物。
本发明的基质上可天然地或固有地包含官能团，如各种玻璃通常含有羟基或 胺基。作为替代， 一个单独的含有官能团的表面层能以单层的形式驻留或存在于 基质表面，这种单层可以是本领域技术人员熟知的SAM (自组装单分子层法)。 这种固有的或附加的官能团包括羟基、胺基、羧酸、羰基、各种卤素化合物(如 氯和溴)，以及碳原子数在2到20的各种烯烃。但一般不采用硫代基。
本发明的一个重要的内容就是利用了各种不同类型的交联剂来将指示微生 物共价交联到基质上。交联剂可以含有相同的官能团，也可以是不同的多种类型 的官能团共同存在，而且这些多种类型的官能团的存在种类可多于一种，比如， 各种胺化合物，包含伯胺、仲胺和叔胺、各种亚胺、各种酰亚胺，包括苯胺、羧 酸的酰亚胺酯、羟基、羧酸、碳原子数为2到20的链烯烃、卣素化合物，如氯 和溴、硝基苯基卤化物、碳原子数为至少1到20的烃氧基、酐、醛、氰基、各 种含硫官能团，如硫代硫酸根、二硫化物或联硫基等及其类似物。交联剂中用于 参与反应的优选末端官能团通常包括首选为伯胺的各种胺、硫代硫酸根或其他 含硫基团、羧基和羟基。通常内含胺类的化合物包括丁二酰亚胺活化脂、顺丁烯 二酰亚胺、叠氮化合物以及碘乙酰胺。
合适的交联剂包括双同官能团交联剂、双异官能团交联剂、三官能团交联剂、 零长交联剂以及光反应交联剂。双异官能团交联剂为优选。
双同官能团交联剂的实例包括各种胺，比如二[硫代琥珀酰亚胺]辛二酸盐 (BS3)，以及3-[2-氨乙基二硫代]丙酸盐酸(AEDP)。
双异官能团交联剂的实例包括N-琥珀酰亚胺-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐 (SPDP)、 N-磺基琥珀酰亚胺-2-吡啶二硫-3，丙酰氨基6-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、 N-琥珀酰亚胺-2-吡啶二硫-3,丙酰氨基6-己酸盐(LC-SPDP)、 N-琥珀酰亚胺-乙 酰硫代醋酸酯(SATA)、 N-琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己垸-卜羧酸酯 (SMCC)、 N-磺基琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己烷-l-羧酸酯 (Sulfo-SMCC)、 N-琥珀酰亚胺(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、 N-磺基琥 珀酰亚胺(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯(Sulfo-SIAB)、间(N-马来酰亚胺基)N-琥珀酰 亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、磺基琥珀
酰亚胺-4-(对马来亚酰胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)、 N- (a-马来酰亚胺乙酸基) 琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺-6-( P-马来亚胺丙基阿米酚己酸酯)(SMPH)、 N-琥珀酰亚胺碘醋酸酯(SIA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸酯(KMUA)、琥珀酰亚 胺-3-溴乙酸丙酸酯(SBAP)，其他交联剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 3- (2-氨基乙基二硫代)盐酸丙酸(AEDP， 也可以作为双异官能团交联剂使用)、甲基-N-琥珀酰亚胺已二酸酯(MSA)、 N-(3-马来酰亚胺丙酸(BMPA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸肼(KMUH)、 N-p-马来酰亚 胺苯基丙酸酰肼(BMPH)和N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)。 三官能团交联剂的一个实例是三琥珀酰亚胺氨基三乙酸(TSAT)。 零长交联剂的实例包括1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐 (EDC)o
光反应交联剂(即利用紫外线照射与有效亲核物质发生特定反应的交联剂) 的例子包括胺类物质，如4-叠氮基-2，3,5，6-四氟苯甲酸及其琥珀酰亚胺酯(ATFB， SE); 4-叠氮基-2,3,5，6-四氟苯甲酸的三聚磷酸酯以及钠盐(ATFB,STPester); 二 苯甲酮-4-异硫氰酸酯(Benzophenone-4-isothiocyanate); 4-苯酰苯甲酸及其琥珀 酰亚胺酯(4-benzoylbenzoic acid, succinimidyl ester); 5-叠氮-2-硝基苯酰氧琥珀 酰亚胺酯"讨8^03);磺基琥珀酰亚胺-(间-叠氮-邻-硝基苯甲酰胺)2-乙基-1,3，-二硫代丙酸(SAND);琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH); 磺基琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮-2，-硝基苯氨)己酸酯(Sulfo-SANPAH);琥珀酰亚胺 -[4-(补骨脂内酯-8^010^)丁酸酯(SPB)。此外，还有硫醇类物质，如(2-吡啶 二硫代)乙基-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺(thiol reactives include A/-([2-pyridyldithio]ethyl)-4-azidosalicylamide ); 二苯甲酮-4-马来酰亚胺 (Benzophenone-4-maleimide)。羰酰化合物包括4-叠氮-基-2，3,5,6-四氟苯胺盐酸 化物(4-azido-2，3，5,6-tetrafluorbenzylamine hydrochloride)。
其他交联剂包括N-Y-马来亚酰丁酰氧琥珀酰亚胺酯(W-gamma-maleimidobutyryloxy succinimide ester)、 1，3陽二马来酰亚月安丙'烷(1 ，3-bismaleimido propane)(分子式如下)、 <formula>formula see original document page 18</formula>N-4-羧基环丙烷己基甲基-马来酰亚胺的羟基琥珀酰亚胺酯化物 (W-hydroxysuccinimide ester of jV"-(4)-carboxycycIohexylmethyl)- maleimide)、以及 3(2-吡啶-二硫代)-丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯化物(iV -hydroxysuccinimide ester of 3(2-pyridyl-dithio)- propionic acid)(分子式如下)。
这些双同官能团交联剂、双异官能团交联剂、三官能团交联剂、零长交联剂 以及光反应交联剂通过其一个末端官能团与基质或独立表面层上的功能化合物 反应而形成一共价键，而剩余的一个或多个官能团将与一个指示微生物或病原反 应，也形成一共价键。而两个反应的顺序不重要，交联剂可以先与表面或表面层 上的官能团反应再与微生物反应，也可以先与微生物反应再与表面或表面层上的 官能团反应。
本发明的一个重要方面就是通过强共价键将指示微生物结合到基质上，而这 种共价结合的能量为至少每摩尔约IO千卡能量，理想的情况为为约10 150千 卡，优选为约25 125千卡。这种指示微生物或病原与基质之间的强力结合或支 抗，对伴随有清洗消毒器和/或液体化学灭菌处理等逆向的或不稳定的环境都有 耐受性。换言之，本发明的生物指示剂对冲洗或从基质上剥离等具有高度耐受性， 比如对喷射冲击，紊流流体静力等的高耐受性。
本发明的生物指示剂的制备方法包括将一层交联剂直接结合于基质表面，或 将交联剂结合于与基质分离的其上含有官能团的单独层上。这些官能团最好实质 上没有或不含有硅结合原子。当使用了硅垸偶联剂的时候就会产生硅结合原子。 而实质上没有硅结合原子的定义是，官能团通过中介硅结合原子而与基质连接的 比例少于官能团的约10%，理想的情况为少于约5%，优选为少于约2%或3%， 或者全无，即完全没有。基质也实质上不含有蛋白质、部分水解蛋白和肽，如果
存在，这类蛋白质在连接到基质的功能团中的含量较低，如通常少于约10%,理 想的情况为少于约5%、优选为少于约2%或3%。根据基质或表面层上含有的上
述官能团的种类，所使用的交联剂应含有至少一个容易与所述的官能团反应且能 形成共价键的末端基团。比如，如果基质表面含有一胺官能团，那么交联剂(如 双异官能团交联剂)的一个官能团就应容易与胺官能团发生反应并形成共价结 合，该官能团如醛基、亚胺基、羧基、羧酸的酰胺酯、酐及其类似物。 一种在缓
冲液中利用交联剂的方法例如在相对中性的磷酸盐缓冲溶液环境中，即pH值为 6 8下，与基质上的官能团反应合适的时间以形成共价键。过量的交联剂可以 采用诸如漂洗或洗涤等传统方法除去。
交联剂上剩余的一个或多个末端基团易与指示微生物或病原反应，并能形成 共价键的官能团。因此，这些指示微生物，或病原、或致病因子或其刺激物等， 就能通过交联剂共价交联到基质的官能团上。上述与微生物反应的官能团包括卤 素、三聚氰胺盐生物、硫代基、马来酰亚胺、苹果酰胺等。如果交联剂上的剩余 官能团被吡啶基阻止，可用常规还原剂将之除去。这类合适的还原剂的实例包括 二硫苏糖醇(DTT)、 p-巯基乙醇、DMF、 DMSO、氢化铝锂、四氢硼酸钠等。本 发明的一个优选的具体实施方式
就是利用一种双异官能团交联剂SPDP，通过将 化合物还原以除去吡啶基团，剩下的硫化氢基团就很容易与芽孢的硫代基上的硫 反应并形成共价键，从而达到将芽孢固定在基质表面的目的。
因为本发明的优选微生物为细菌芽孢，且芽孢上通常含有含硫末端基团，因 此这也印证了本发明的一个理想具体实施方式
。而要是芽孢或微生物不含有含硫 末端基团，也可以将其在与交联剂反应之前与硫醇盐反应硫醇化。微生物的硫醇 化是本领域的已知技术。
各种单一的或多种交联剂的反应方式也很多，如室温下反应、加热反应、紫
外照射等辐射反应等等。
本发明的另一重要方面就是在基质上植入的指示微生物或病原等微生物种 群是均匀的和/或一致的，以形成微生物种群分布的一个低标准偏差或结合。这 种均匀分布程度以一定区域上的比值来定，均匀分布程度可以通常为50%或以 下，较优为25%或以下，最优选为10%或以下，比如，以平方厘米(cm2)为单 位来比较一区域与另一区域的一致程度。要达到指示微生物或病原的均匀分布，
可以将选择的芽孢微生物制备成混悬液，其液体一般是水或溶剂。溶剂可以是乙 醇、甲醇以及其他醇，优选乙醇。然而，只要能保持芽孢的活性及耐受性，可以 理解为芽孢是可以悬浮于广泛种类的溶液中的。
如上所述的交联剂可以先与一种或多种类型的指示微生物或病原等反应，再 于液体溶液或溶剂中与含有官能团的基质反应，在基质表面上形成共价键而交 联。
用于反应的基质拥有固有官能团、或者由与交联剂共价交联的自组装单分子 层提供官能团。接着将微生物接种于基质上，例如将一定浓度的芽孢悬液接种。 芽孢悬液的浓度范围很大，主要依实际需要量和接种于基质上的需求比例而定， 但是其浓度一般为104 109菌落形成单位/毫升。将芽孢悬液接种到基质载体的 过程是由将基质表面浸渍或浸没于芽孢悬液中、吸液、喷雾或将固定容量的悬、液 印记于基质上等过程实现的。生物指示剂产品上微生物的实际存储或存在量为约 104 107菌落形成单位/一支生物指示剂。当基质通常是平展表面时，如封闭吸收 池或载玻片等，该载体的整个表面可以被菌落覆盖。而当基质通常是曲面表面时， 如玻璃安瓿，可能只有一个末端部分部菌落覆盖，或者被全部覆盖。
接种好的基质在17'C 25'C的环境中干燥1 30分钟。或者升温干燥以减 少干燥时间。将载体基质接种后，用水或溶剂冲洗以除去未牢固交联在基质表面 的芽孢。接下来利用光学测量仪器(如光学或扫描探针显微镜)来检査确定载体 表面的指示微生物菌群的均匀度。载体表面的菌群也可以通过被浸渍滴定、或声 处理取样，或其他本领域公知技术方法来计算。
除了指示微生物(如芽孢)以外，各种病原也可以用相似的方法，以理想的 浓度量交联于基质表面上。
由于可以使基质或其表面层上含有均匀一致浓度的官能团，并通过交联剂共 价交联到微生物或病原上，这些微生物或病原可以牢固地附着在基质上且损失很 少，即便有损失，也是在紊流和/或化学灭菌处理或过程中损失的。诸如芽孢或 病原等微生物可以用作十分有效的生物指示剂来测定各种灭菌处理的效力。例 如，本发明的生物指示剂最适用于液体的化学灭菌处理，也能用于各种灭菌方法， 诸如蒸汽、化学、辐射、气相等。当一个或多个生物指示剂的一个灭菌周期完成 后，可以用本领域已知的方法来培养。如果任意微生物，如芽孢或病原在灭菌处
理后仍存活，那么利用本领域公知技术，在适当的培养条件下将生长。任何生长 表现都表示了该灭菌周期可能不彻底。因此，在培养了生物指示剂之后，就可以 用常规方法来确定消毒或灭菌的程度。最终结果常常是通过对数减少来反应灭菌 的情况，理想的对数减少为至少4到12，优选为至少5或6到8或9。当对数减 少为6时，表示100万个微生物在灭菌处理后存活了一个或少于一个。
生物指示剂中使用的微生物，芽孢、或者病原与特殊有机体一样，对其灭活 需要特殊处理。例如生化战制剂，如果认为一成分或容器中可能含有炭疽，就可 以利用炭疽芽孢来用作判断对含有炭疽的成分或容器的灭菌是否完成的依据，这 种生物指示剂可以确定灭活炭疽的处理方法的效力。
能利用本发明中的生物指示剂来监测其灭菌效果的物质很多，包括仪器， 如手术器械；设备，包括用于传输医药化合物的管道；其他物质，如各种粉剂、 混合物、溶液、衣物、以及任何灭菌或消毒过程需要表征效果的物质。
下面例举具体实施例来帮助理解本发明的具体功能和优点。以下实施例用于 说明本发明的优势，但并没有说明本发明的全部范围。
实施例1A
采用含有胺基末端表面的基质，所述基质采用带有该功能的玻璃或聚苯乙烯 制成、或是含有需要的末端基团的自组装单分子层修饰后的基质、或是用某些物 理或化学方法处理后释放了或获得了官能团的基质。双异官能团交联剂N-琥珀 酰-3-2-联硫基吡P定-丙酸盐(SPDP)与胺基末端表面在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中反 应30 60分钟(20毫摩尔SPDP原液溶于二甲亚砜或乙醇中)，反应温度优选为 17'C 4(TC。过量的SPDP通过在磷酸缓冲液中浸洗除去。接着利用二硫苏糖醇 (DTT)将基质还原处理约30分钟。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geo6"d〃附 饰araA"w印M^)的芽孢与还原后的基质表面反应1秒 18小时。这样，芽孢 就通过共价键交联到一端已与基质表面的胺基官能团交联的交联剂上。
实施例1B芽孢的硫醇化
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制106~109菌落形成单位/毫升(cfb/mL)的 菌悬液。取实施例1A中的配制的20毫摩尔SPDP溶液中的120微升(pL)加
入0.5毫升芽孢悬液中(溶液量可适当按比例放大)。SPDP溶液与芽孢反应时间 为1秒到大约2小时，优选为1秒到30分钟。而SPDP上的反应胺基官能团， N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将与芽孢膜蛋白质上的可用胺基反应。接下来用一些 典型方法除去未反应的SPDP，典型的方法如透析、过滤、或两者的结合、或者 其他本领域技术人员知道的方法。在除去未反应的SPDP后，将新制成的被硫醇 化的芽孢与以前用SPDP修饰过的基质表面接触(方法与其它实例中采用的方法 相同)然后进行还原。这样，芽孢就可以与基质表面通过二硫键形成共价连接。
实施例2 (无还原剂)
采用固有羟基官能团的基质(或采用经等离子照射处理过并形成了具羟基功 能的多聚表面)，将双异官能团交联剂N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI) 与含有羟基的表面在碱性pH的不含羟基的缓冲液中反应30分钟(PMPI原液在 二甲亚砜或乙醇中制成，其浓度为约超过基质表面存在的羟基摩尔量的10倍)。 PMPI的异氰酸末端基团与基质表面的羟基反应形成氨基甲酸乙酯连接。随后， 嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geoftad/^s^eara^e/vno/^z'/ws)芽孢上的硫氢基与交联剂 上的马来酰亚胺官能末端在pH中性环境、室温下反应2小时。这样，所述的双 异官能团交联剂就一端共价交联了芽孢，另一端与基质的羟基交联。
实施例3 (无还原剂)
将带固有双键如基质表面的乙烯基的基质，或其表面经处理后形成了双键的 基质浸没于pH值为7 9的磷酸钠溶液中，该磷酸钠溶液中存在有10%的10毫 摩尔N-琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH)的二甲亚砜或二 甲基甲酰胺溶液。将样品(基质和溶液)在波长为300 460纳米(理想的为300 370纳米)的紫外线下照射处理，处理时间少于l分钟。SANPAH上的硝基苯基 叠氮基团形成氮烯基团，这种氮烯基团引起与基质表面上双键的附加反应。在 pH值为7的磷酸盐缓冲液中，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geo^c说w WearaAenm^M^)芽孢悬液(浓度为107菌落形成单位/毫升)与修饰后的基质 表面接触，于室温下反应60分钟。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酯与伯胺基反应 形成稳定的酰胺键。如此，SANPAH交联剂就共价交联了芽孢和位于基质表面乙
烯基团。
在本发明的另一个具体实施方式
中，利用官能化硅烷偶联剂为基质添加一官 能团，所述的官能团能直接连接指示微生物，而不需要交联剂。相应地，在基质 的官能团与芽孢等微生物之间不再存在共价键，而是形成了一种物理的或其他类 型的非共价连接。所述的官能偶联剂可以是分子式为(FR)nSiX4.n的物质，其中
n=l 3，理想的为1 3。 R为有机化合物，如碳原子数为1 20，理想的碳原子 数为2-18，优选的碳原子数为3-16的的烷基；R或者是碳原子数为6 20，理想 的为6 15的芳香族化合物；R还可以是烷基与芳香基的结合，如垸基芳基、或 芳基垸基及其类似物。X为卤素，如氯基或溴基，优选氯基；X也可为垸氧基、 OR1，其中W是碳原子数为1 10的烷基，而优选碳原子数为1 2的烷基。相 应地，大量的硅垸偶联剂也可以采用，代表性的例子包括丙基三甲氧硅垸、丁基 三甲氧硅烷、丙基三乙氧硅烷、丁基三乙氧硅垸、丙基三氯硅烷、丙基三溴硅烷、 丁基三氯硅烷、丁基三溴硅烷、l，l-十六烷基三氯硅垸、1,5-十五烯基三氯硅烷、 l，l-溴十一烷基三氯硅垸、单氯硅烷、二氯硅烷及其类似物。硅烷偶联剂上的官 能基团F，为能与细菌、芽孢等通过物理连接的方法进行连接的化合物。合适的 官能基团包括硫化物、胺化合物、含羰基化合物、溴化物、环氧化合物、含羧基 化合物、烯烃化合物、炔烃化合物及其类似物，和它们的衍生物。因此，官能硅 烷偶联剂包括3-氨基丙基三甲氧硅烷、3-氨基丙基三乙氧硅烷、3-巯基丙基三甲 氧硅垸、3-巯基丙基三乙氧硅垸、3-氨基丙基三氯硅垸、3-巯基丙基三氯硅烷及 其类似物。
由于各种有机硅烷通常含有超过一组X基团，且通常含有3组，因此它们 可以与如玻璃或纤维素等带有固有羟基的基质交联，形成一层平面的以
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结构连接的网状单层，其中所述的氧原子来源于连接到基质表面上的羟基。当然， 可以使用单一的官能硅烷偶联剂，也可以将两种或多种不同的官能偶联剂混合使 用。获得的结果是固定在基质表面的指示微生物的密度高。
将一层官能有机硅烷偶联剂结合到基质的方法包括首先将硅垸化合物溶于
一溶剂中，该溶剂在垸基硅烷沉积前需预先加热到6(TC 75。C。适宜的溶剂为
任意无水有机溶剂，包括芳香族碳氢化物，如甲苯、十六垸、苯、萘、二甲苯， 和无水的酮，如丙酮及其类似物，其中优选十六垸。
诸如芽孢等指示微生物可以通过基质上的官能团和芽孢膜上的蛋白质之间 的疏水作用或静电相互作用物理吸附到基质表面。芽孢也可以利用蛋白质上的胺 基化学吸附到基质表面。
实施例4 (硅垸偶联剂)
通过采用硫酸溶液和过氧化氢溶液清洗除去表面上的有机杂质制备包含封 闭吸收池或结晶皿的基质材料样品。接着用大量水冲洗这种基质以除去残留酸和 过氧化物。
接着将上述基质浸泡于硅垸溶液中，于60。C 75。C水浴中反应30秒 5小 时，该硅烷溶液含1%的十六垸基三氯硅烷、或1,1-溴十一垸基三氯硅烷、或1，5-十五烯基三氯硅烷的溶液，溶剂为十六烷。反应完成后，用非极性溶剂冲洗基质 以除去残留的硅烷分子。
为了制备生物指示剂，将官能化的基质淹没或浸泡于大约5 100毫升的芽 孢悬液中1秒到大约18小时，优选1秒到3小时。也可以选择用接种、喷涂或 印记等方法将芽孢悬液连接到基质上。在基质被淹没或浸泡在芽孢悬液的过程完 成后，将该基质在自然条件下(17°C 25°C， 1 30分钟)干燥。干燥一旦完成， 用无菌水冲洗该生物指示剂以除去连接松弛的芽孢。这样只有牢固连接在基质表 面的芽孢才能在冲洗过程后保留下来。再次自然条件下干燥生物指示剂，并检查 确定其上芽孢群的数量和分布情况。
实施例5 (硅烷偶联剂)
玻璃基质材料经修饰后含有胺末端基团表面。用30%的过氧化氢(35%)和 70%的浓硫酸溶液清洗玻璃表面。胺基官能表面的制备方法为将上述清洗后的玻 璃表面浸没入1%的3-氨基丙基三甲氧硅烷的无水溶剂溶液中，该无机溶剂优选 十六烷或丙酮。将胺基官能表面在17'C 25'C下浸入磷酸盐缓冲盐溶液中大约 30 60分钟。所述的磷酸盐缓冲盐溶液含有溶剂为二甲亚砜或乙醇的SPDP溶 液，SPDP母液的含量为20毫摩尔。最后用磷酸盐缓冲液冲洗以除去过量的 SPDP。
接下来用二硫苏糖醇(DTT)含量为25毫克/毫升的醋酸盐缓冲溶液来还原基 质表面。在17'C 25"下，基质表面在醋酸盐/DTT溶液中浸渍30分钟，再用 大量醋酸盐缓冲溶液来除去所有的DTT。
为了制备生物指示剂，需要将连接有异双官能交联剂的基质浸没入一适当体 积的芽孢悬液中大约30秒 20小时。在芽孢悬液中淹没或浸泡完成后，将基质 在自然条件下(I7°C 25°C)干燥。
实施例6
在又一个实施例中，如硼硅玻璃等羟基官能表面可用于制备生物指示剂。将 官能基质淹没或浸泡于大约5 100毫升的芽孢悬液中1秒 24小时，优选1秒 3小时。在芽孢悬液中淹没或浸泡完成后，将基质在自然条件下(17°C 25°C， 1 30分钟)干燥。干燥一旦完成，用无菌水冲洗该生物指示剂以除去连接松弛 的芽孢。这样只有牢固连接在基质表面的芽孢才能在冲洗后保留下来。再次于自 然条件下干燥生物指示剂，并肉眼检查确定其上芽孢群的分布和数量情况。如果 芽孢菌群分不布均匀，其标准偏差大约为25%或更少。
根据专利法规，本说明书给出了最好的模式和优选的具体实施方式
，但本发 明的范围并不局限于此，而是由所附的权利要求书的范围进行限定。
权利要求
1、一种用于监测灭菌效力的生物指示剂，包括基质；位于基质上包含官能末端基团的表面层；指示微生物；及共价交联到所述表面层官能团和共价交联到所述指示微生物的交联剂；所述的表面层实质上不含有硅连接原子。
2、 如权利要求l所述的监测灭菌效力的生物指示剂，其中所述的指示微生 物为内生孢子、真菌、分枝杆菌、活细菌、原生动物；所述的交联剂为双同 官能团交联剂、双异官能团交联剂、三官能团交联剂、零长交联剂或光反应 交联剂；并且所述的硅原子的含量为交联到所述基质上的官能团总量的约 10%或更少。
3、 如权利要求2所述的监测灭菌效力的生物指示剂，其中所述的表面层官 能团包括羟基、胺基、羧酸、羰基、碳原子数为2 20的烯烃、或卤素、或 它们的组合；所述的内生孢子指示微生物包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌球形变异、产芽胞梭状芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、或环状芽孢 杆菌、或它们的组合；所述的真菌指示微生物包括黑曲霉、白色念珠菌、须疮癣菌、或皮炎万 吉拉菌，或它们的组合；所述的分枝杆菌指示微生物包括龟分支杆菌、戈氏分枝杆菌、耻垢分枝 杆菌、或地分枝杆菌、或它们的组合；所述的活细菌指示微生物包括嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎 肠球菌、脓链球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基杆 菌、绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮 葡萄球菌、或嗜麦芽寡养单胞菌、或它们的组合；和所述的原生动物指示微生物包括肠兰伯鞭毛虫、或小球隐孢子虫、或它 们的组合。
4、 如权利要求3所述的生物指示剂，其中所述的硅原子的含量少于约5%;所述的双同官能团交联剂包括二[硫代琥珀酰亚胺]辛二酸盐(BS3)、或 者3-[2-氨乙基二硫代]丙酸盐酸(AEDP);禾口所述的双异官能团交联剂包括N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)、 磺基琥珀酰亚胺-2-吡啶二硫-3'丙酰氨基6-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、琥珀酰 亚胺-2-吡啶二硫-3'丙酰氨基6-己酸盐(LC-SPDP)、琥珀酰亚胺-乙酰硫代醋 酸酯(SATA)、琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、 磺基琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己烷-l-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、 N-琥珀酰亚胺(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、 N-磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙 基)氨基苯甲酸酯(Sulfo-SIAB)、间(N-马来酰亚胺基)N-琥珀酰亚胺酯(MBS)、 琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺-4-(对马 来亚酰胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)、 N- (a-马来酰亚胺乙酸基)琥珀酰亚 胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺-6- (P-马来亚胺丙基阿米酚己酸酯)(SMPH)、 N-琥珀酰亚胺碘醋酸酯(SIA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸酯(KMUA)、琥珀酰 亚胺-3-溴乙酸丙酸酯(SBAP)、 N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 3- (2-氨基 乙基二硫代)盐酸丙酸(AEDP)(也可作为双同官能团交联剂使用)、甲基 N-琥珀酰亚胺已二酸酯(MSA)、 N-P-马来酰亚胺丙酸(BMPA)、 N-K-马来 酰亚胺十二酸肼(KMUH)、 N-P-马来酰亚胺苯基丙酸酰肼(BMPH)、 N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)、或它们的组合；所述的三官能团交联剂包括三琥珀酰亚胺氨基三乙酸(TSAT);所述的零长交联剂包括1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC);所述的光反应交联剂包括4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸、琥珀酰亚胺酯 (ATFB、 SE)、 4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸的三聚磷酸酯、钠盐(ATFB, STP ester)、 二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯酰苯甲酸或其琥珀酰亚胺酯、N-5-叠氮 -2-硝基苯酰氧琥珀酰亚胺酯(ANB-NOS)、磺基琥珀酰亚胺-(间-叠氮-邻-硝基苯甲酰胺)2-乙基-l，3，-二硫代丙酸(SAND)、 N-琥珀酰亚胺-6-(4，-叠氮 -2'-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺-6-(4，-叠氮-2，-硝基苯氨) 己酸酯(Sulfo-SANPAH)、琥珀酰亚胺-[4-(补骨脂内酯-8-yoloxy)丁酸酯 (SPB)、 N- (2-吡啶二硫代)乙基-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺、二苯甲酮-4-马来 酰亚胺、或4-叠氮-基-2，3,5,6-四氟苯胺盐酸化物、或它们的组合。
5、 如权利要求4所述的生物指示剂，其中所述的表面层官能团为胺基或羟 基；所述的指示微生物上有磺基末端基团，微生物为嗜热脂肪地芽孢杆菌或 枯草芽孢杆菌；所述的表面层官能团硅原子的含量为约2%或更少； 所述的交联剂为N-琥珀酰亚胺-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐； 所述的指示微生物的浓度为大约104 107菌落形成单位/生物指示剂；和 所述的微生物在基质上分布的标准偏差为大约25%或更少。
6、 一种生物指示剂，包括其上有官能团的基质，通过交联剂与所述官能团共价交联的指示微生物，所述的指示微生物包括内生孢子、真菌、分枝杆菌、 活细菌、或原生动物、或它们的组合。
7、 如权利要求6所述的生物指示剂，其中所述的官能团包括羟基、胺基、羧 酸、羰基、碳原子数为2 20的烯烃、或卤素，或它们的结合；和所述的交联剂为双同官能团交联剂、双异官能团交联剂、三官能团交联剂、 零长交联剂、或光反应交联剂，或它们的组合。
8、 如权利要求7所述的生物指示剂，其中所述内生孢子指示微生物包括嗜热 脂肪地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌球形变异、产芽胞梭状芽胞杆 菌、蜡样芽胞杆菌、或环状芽孢杆菌，或它们的组合；所述的真菌指示微生物包括黑曲霉、白色念珠菌、须疮癣菌、或皮 炎万吉拉菌，或它们的组合；所述的分枝杆菌指示微生物包括龟分支杆菌、戈氏分枝杆菌、耻垢分枝杆 菌、或地分枝杆菌，或它们的组合；所述的活细菌指示微牛物包括嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠 球菌、脓链球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基杆菌、 绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球 菌、或嗜麦芽寡养单胞菌，或它们的组合；和所述的原生动物指示微生物包括肠兰伯鞭毛虫、或小球隐孢子虫，或它 们的组合。所述的双同官能团交联剂包括二[硫代琥珀酰亚胺]辛二酸盐(BS3)、或 者3-[2-氨乙基二硫代]丙酸盐酸(AEDP);禾口所述的双异官能团交联剂包括N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)、 磺基琥珀酰亚胺-2-吡啶二硫-3'丙酰氨基6-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、琥珀酰 亚胺-2-吡啶二硫-3'丙酰氨基6-己酸盐(LC-SPDP)、琥珀酰亚胺-乙酰硫代醋 酸酯(SATA)、琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、 磺基琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己垸-l-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、 N-琥珀酰亚胺(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、 N-磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙 基)氨基苯甲酸酯(Sulfo-SIAB)、间(N-马来酰亚胺基)N-琥珀酰亚胺酯(MBS)、 琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺-4-(对马 来亚酰胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)、 N- (a-马来酰亚胺乙酸基)琥珀酰亚 胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺-6- (p-马来亚胺丙基阿米酚己酸酯)(SMPH)、 N-琥珀酰亚胺碘醋酸酯(SIA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸酯(KMUA)、琥珀酰 亚胺-3-溴乙酸丙酸酯(SBAP)、 N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 3- (2-氨基 乙基二硫代)盐酸丙酸(AEDP)(也可作为双同官能团交联剂使用)、甲基 N-琥珀酰亚胺己二酸酯(MSA)、 N-p-马来酰亚胺丙酸(BMPA)、 N-K-马来 酰亚胺十二酸肼(KMUH)、 N-(3-马来酰亚胺苯基丙酸酰肼(BMPH)、 N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)、或它们的组合；所述的三官能团交联剂包括三琥珀酰亚胺氨基三乙酸(TSAT);所述的零长交联剂包括1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC);所述的光反应交联剂包括4-叠氮基-2，3，5,6-四氟苯甲酸、琥珀酰亚胺酯 (ATFB、 SE)、 4-叠氮基-2，3，5,6-四氟苯甲酸的三聚磷酸酉旨、钠盐(ATFB,STP ester)、 二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯酰苯甲酸或其琥珀酰亚胺酯、N-5-叠氮 -2-硝基苯酰氧琥珀酰亚胺酯(ANB-NOS)、磺基琥珀酰亚胺-(间-叠氮-邻-硝基苯甲酰胺)2-乙基-l，3，-二硫代丙酸(SAND)、 N-琥珀酰亚胺-6-(4，-叠氮 -2，-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺-6-(4，-叠氮-2'-硝基苯氨) 己酸酯(Sulfo-SANPAH)、琥珀酰亚胺-[4-(补骨脂内酯-8-yoloxy)丁酸酯 (SPB)、 N- (2-吡啶二硫代)乙基-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺、二苯甲酮-4-马来 酰亚胺、或4-叠氮-基-2，3，5,6-四氟苯胺盐酸化物、或它们的组合。
9、 如权利要求8所述的生物指示剂，其中所述的表面层官能团为胺基或羟 基；所述的指示微生物上有磺基末端基团，微生物为嗜热脂肪地芽孢杆菌或 枯草芽孢杆菌；所述的交联剂为N-琥珀酰亚胺-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐； 所述的指示微生物的浓度为大约104 107菌落形成单位/生物指示剂；和 所述的微生物在基质上分布的标准偏差为大约25%或更少。
10、 一种生物指示剂，包括基质和非必要地附于基质上的表面层，所述的基质或所述的非必要的表面层含有官能团；病原，包括生化恐怖制剂、临床类有机体、细菌的抗性株、或亚细胞成 分、或它们的组合；和共价交联到所述基质的官能团或所述的非必要的表面层官能团和共价交 联到所述病原的交联剂。
11、 如权利要求IO所述的生物指示剂，其中所述的交联剂为双同官能团交 联剂、双异官能团交联剂、三官能团交联剂、零长交联剂、或光反应交联剂， 或它们的组合。
12、 如权利要求11所述的生物指示剂，其中所述的官能团包括羟基、胺基、羧 酸、羰基、碳原子数为2 20的烯烃、或卤素，或者它们的组合。所述的病原包括抗万古霉素肠道链球菌(VRE)、耐甲氧苯青霉素金黄色葡 萄球菌(MSRA)、龟分枝杆菌、病毒、蛋白酶传染性因子、炭疽(炭疽杆菌)、 肉毒(肉毒梭菌毒素)、布氏菌属(波浪热)、鼻疽假单胞菌(鼻疽)、类鼻疽假 单胞菌(类鼻疽)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、霍乱(霍乱弧菌)、产气荚膜梭状 芽胞杆菌(S-毒素)、Q热病原体(Q热)，传染病类包括如尼巴病毒和汉坦病 毒属、大肠杆菌0 157:H7 (A Co//)、对食品安全的威胁物(如沙门氏菌种)、 兔热病杆菌(兔热病)、鼻疽(鼻疽假单胞菌)、鼠疫(鼠疫耶氏菌)、蓖麻(蓖 麻籽)中的蓖麻毒素、普氏立克次(氏)体(斑疹伤寒)、伤寒沙门菌(伤寒)、 志贺(氏)杆菌(志贺(氏)菌病)、天花(重型天花)、葡萄球菌肠毒素5、霍乱弧 菌(霍乱)、病毒性脑炎(a病毒[如委内瑞拉马脑炎，东方马脑炎，西方马脑 炎])、病毒性出血热(纤丝病毒[如Ebola, Marburg])和沙粒病毒[如Lassa， Mach叩o]，水安全威胁物(如小球隐孢子虫)，或鼠疫耶氏菌(鼠疫)，或它们 的组合。
13、 如权利要求12所述的生物指示剂，其中所述的双同官能团交联剂包括二[硫 代琥珀酰亚胺]辛二酸盐(BS3)、或者3-[2-氨乙基二硫代]丙酸盐酸(AEDP); 禾口所述的双异官能团交联剂包括N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)、 磺基琥珀酰亚胺-2-吡啶二硫-3，丙酰氨基6-己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、琥珀酰 亚胺-2-吡啶二硫-3，丙酰氨基6-己酸盐(LC-SPDP)、琥珀酰亚胺-乙酰硫代醋酸 酉旨(SATA)、琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己垸-l-羧酸酯(SMCC)、磺 基琥珀酰亚胺-反-4-马来酰亚胺甲基环己垸-l-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、 N-琥珀 酰亚胺(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、 N-磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙基) 氨基苯甲酸酯(Sulfo-SIAB)、间(N-马来酰亚胺基)N-琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥 珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺-4-(对马来 亚酰胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)、 N- (a-马来酰亚胺乙酸基)琥珀酰亚胺酯 (AMAS)、琥珀酰亚胺-6- (P-马来亚胺丙基阿米酚己酸酯)(SMPH)、 N-琥珀 酰亚胺碘醋酸酯(SIA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸酯(KMUA)、琥珀酰亚胺-3-溴乙酸丙酸酯(SBAP)、 N-对-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)、 N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS)、 N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 3- (2-氨基乙基二硫代) 盐酸丙酸(AEDP)(也可作为双同官能团交联剂使用)、甲基N-琥珀酰亚胺已 二酸酯(MSA)、 N-p-马来酰亚胺丙酸(BMPA)、 N-K-马来酰亚胺十二酸肼 (KMUH)、 N-p-马来酰亚胺苯基丙酸酰肼(BMPH)、 N-对-马来酰亚胺苯基异 氰酸酯(PMPI)、或它们的组合；所述的三官能团交联剂包括三琥珀酰亚胺氨基三乙酸(TSAT);所述的零长交联剂包括1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC);所述的光反应交联剂包括4-叠氮基-2,3，5，6-四氟苯甲酸、琥珀酰亚胺酯 (ATFB、 SE)、 4-叠氮基-2，3,5，6-四氟苯甲酸的三聚磷酸酯、钠盐(ATFB, STP ester)、 二苯甲酮-4-异硫氰酸酯、4-苯酰苯甲酸或其琥珀酰亚胺酯、N-5-叠氮 -2-硝基苯酰氧琥珀酰亚胺酯(ANB-NOS)、磺基琥珀酰亚胺-(间-叠氮-邻-硝基苯甲酰胺)2-乙基-l，3，-二硫代丙酸(SAND)、 N-琥珀酰亚胺-6-(4，-叠氮 -2，-硝基苯氨)己酸酯(SANPAH)、磺基琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮-2，-硝基苯氨) 己酸酯(Sulfo-SANPAH )、琥珀酰亚胺-[4-(补骨脂内酯-8-yoloxy)丁酸酯 (SPB)、 N- (2-吡啶二硫代)乙基-4-叠氮邻羟基苯甲酰胺、二苯甲酮-4-马来 酰亚胺、或4-叠氮-基-2,3,5,6-四氟苯胺盐酸化物、或它们的组合。
14、 如权利要求13所述的生物指示剂，其中所述的非必要表面层不存在； 所述的基质官能团为胺基或羟基；所述的交联剂为N-琥珀酰亚胺-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐；和 所述的微生物在基质上分布的标准偏差为大约25%或更少。
15、 如权利要求14所述的生物指示剂，其中所述的病原的浓度为约104 107 菌落形成单位/生物指示剂。
16、 一种生物指示剂，包括基质及附于基质上的非必要的表面层，所述的基 质或所述的非必要的表面层具有一暴露的表面；化学偶联到所述暴露表面的官能硅烷偶联剂；和非共价交联到所述官能硅烷偶联剂上的指示微生物，所述微生物包括内生 孢子、真菌、分枝杆菌、活细菌、或原生动物，或它们的组合。
17、 如权利要求16所述的生物指示剂，其中所述的官能团是硫代基、胺基、 羰基、溴、环氧基、羧基、或链烃或炔烃，或它们的组合。
18. 、 如权利要求17所述的生物指示剂，其中所述的非必要表面层不存在，所述的内生孢子指示微生物包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢 杆菌球形变异、产芽胞梭状芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、或环状芽孢杆菌、或它 们的组合；所述的真菌指示微生物包括黑曲霉、白色念珠菌、须疮癣菌、或皮炎万吉 拉菌，或它们的组合；所述的分枝杆菌指示微生物包括龟分支杆菌、戈氏分枝杆菌、耻垢分枝杆 菌、或地分枝杆菌，或它们的结合；所述的活细菌指示微生物包括嗜水气单胞菌、粪肠球菌，粪链球菌、屎肠 球菌、脓链球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基杆菌、 绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球 菌、或嗜麦芽寡养单胞菌，或它们的组合；所述的原生动物指示微生物包括肠兰伯鞭毛虫、或小球隐孢子虫、或它们 的结合。
19、 如权利要求18所述的生物指示剂，其中所述的表面层官能团为胺基或羟基；所述的指示微生物上有磺基末端基团，微生物为嗜热脂肪地芽孢杆菌或枯 草芽孢杆菌；所述的指示微生物的浓度为大约104 107菌落形成单位/生物指示剂；和 所述的微生物在基质上分布的标准偏差为大约25%或更少。
全文摘要
本发明公开了用于监测灭菌、消毒等处理过程效力的生物指示剂，所用的化合物和条件。所述的生物指示剂包括其上具有表面层的基质，该表面层含有官能团，且该官能团在理想的情况下不含有硅连接基团。选定量的官能团在理想的情况下以单层形式存在，且分布均匀。诸如芽孢和/或病原等各种微生物通过交联剂共价交联到表面层官能团上，从而形成数量均匀分布的微生物和/或病原。在与如器械等各种需要处理的物品一起经过灭菌或其他类似处理后，培养所述指示剂以确定灭菌、消毒等处理过程的效力。
文档编号G01N33/543GK101189519SQ200680016923
公开日2008年5月28日 申请日期2006年5月16日 优先权日2005年5月24日
发明者崔西娅·A·克雷格, 罗伯特·E·小比罗, 菲利普·P·弗兰西斯科维奇, 马克·J·杜达 申请人:斯泰尔瑞斯公司