电化学检测法的制作方法

专利名称：：电化学检测法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定流体样品中分析物的存在或含量的方法、该方法中使用的结合试剂、该结合试剂用于免疫分析法的用途以及一种用于测量样品中分析物的含量或存在的试剂盒。
背景技术：
：已经知道，用于测定流体样品中分析物的存在或含量的免疫分析法依赖于与所关注的分析物结合的结合试剂的使用。在该类装置中形成结合试剂-分析物复合体然后在捕获点(capturesite)被固定，然后测定分析物的存在或含量。这类测定可以通过各种方法实现，如荧光分析法。然而，这类测定存在的一个问题是在分析物浓度较低时有时不是很有效。这是因为结合试剂-分析物复合体的浓度也会较低，并且测定较低浓度的该物质的存在和/或含量可能是困难的。如果能够开发一种适于测定流体样品中分析物的存在或含量的方法，该方法即使在分析物浓度较低的情况下也有效，这将是有益的。
发明内容本发明人已开发出了一种新的用于测定流体样品中分析物的存在或含量的方法，该方法即使在分析物的浓度水平较低时也能够准确地检测到分析物。因此，本发明提供了一种测定流体样品中分析物的存在或含量的方法，包含(a)将一种流体样品与一种包含多个可裂解物质分子(cleavablespecies)的结合试剂接触，其中所述可裂解物质分子当被裂解的时候能够用电化学方法测出；(b)将形成的所有的结合试剂-分析物复合体与未结合的结合试剂分离；(c)从固定化的结合试剂-分析物复合体上裂解该可裂解物质；和(d)用电化学的方法检测该裂解的物质。本发明也提供一种本发明的结合试剂。本发明进一步提供本发明的结合试剂用于免疫分析法的用途。本发明还提供一种用于测量样品中分析物的含量或存在的试剂盒，包含；(a)一种本发明的结合试剂，(b)一种捕获相(capturephase)，该捕获相包含一种含有一种试剂的载体，所述试剂能够结合或连接到一种结合试剂-分析物复合体上，和；(c)一种能检测出裂解时的可裂解物质的电极，以提供待测分析物存在或含量的指示。所有形成的结合试剂-分析物复合体与未结合的结合试剂的分离可以通过结合试剂-分析物复合体的固定化来实现。图1电化学测量UV裂解的电化学报道基团的一般性方案。图2已经报道过的检测体系的概括。20μm和400nm的珠子符合图1中规定的要求。图3在各种照射时间下，UV可裂解的二茂铁分子9(浓度2.18mM)进行光分解的情况的TLC。图4试剂和条件a)0.4μm乙醛修饰的胶乳颗粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)脱保护9、DMF、PBS(pH7.0)。图5CV’s照射前(重复2次，用和.....表示)。照射5分钟后(重复2次，用实线和---表示)。将17μl的样品施加于丝网印刷电极(screenprintedelectrode)(碳工作电极和对电极、银/氯化银参比电极)。图6CV’s照射前(重复2次，用和.....表示)。照射5分钟后(重复2次，用实线和---表示)。将17μl的样品施加于丝网印刷电极(碳工作电极和对电极、银/氯化银参比电极)。图7CV’s照射前(重复2次，用和.....表示)。照射5分钟后(重复2次，用实线和---表示)。将17μl的样品施加于丝网印刷电极(碳工作电极和对电极、银/氯化银参比电极)。图8计时电流法测量可变的珠子浓度(每17μl中1.16E+08、46600000、23300000、11650000、5825000、2912500个珠子)。图9计时电流法扫描可变的珠子浓度。每种浓度都已经进行PBS背景校正，即使用Autolab控制软件中的消减磁盘文件(subtractdiskfile)/编辑数据(editdata)选项把PBS背景扫描从每种浓度中扣除。图10计时电流法测量珠子的最低浓度(每17μL2912500个珠子)(实线)和PBS对照测量(虚线)。注意电流升高和降低表明该UV裂解的二茂铁分子的消耗。图11计时电流法测量已知浓度的UV裂解的二茂铁分子。测量用与图8中概括的研究中相同的方法。图12UV裂解的二茂铁分子的标定曲线。数值(i/A)来自图11中的200秒处的点。图13颗粒数量与i/A(裂解的FcPEG)的关系的曲线。数值来自图9中的200秒处的点。图14FcPEG(裂解的)与颗粒数量的关系的曲线。用图12将图3.12中的数值(i/A)转换成FcPEG浓度(μM)。图15计时电流法测量UV裂解的二茂铁分子，将用38mV(电压输入LED)对6μL样品在一个毛细管填充电极(capillaryfillelectrode)装置中的测量重复2次，用和.....表示。线---代表的内容如前所述但电压为22mV。实线如前所述代表PBS但电压为38mV。图16与图15所示相同但重新标度。图17试剂和条件a)0.4μm乙醛修饰的胶乳颗粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)修饰的3299、PBS(pH7.0)；d)脱保护的9、DMF、PBS(pH7.0)图18试剂和条件a)0.4μm乙醛修饰的胶乳颗粒、氨基葡聚糖、NaBH3CN(1M)、MES(50mM，pH6.0)；b)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；c)脱保护的9、DMF、PBS(pH7.0)、SHPEG4CO2H；d)氨基葡聚糖、EDCI、NHS、MES(50mM，pH6.0)；e)GMBS、DMF、PBS(pH7.0)；f)修饰的3299、PBS(pH7.0)图19计时电流法测量具有抗体和UV可裂解连接体的400nmTRF珠子。将17μL的溶液施用到电极上(碳工作电极、对电极和银/氯化银参比电极)。线....表示当先偶联抗体再偶联可裂解连接体时得到的结果。实线表示当先偶联可裂解连接体再偶联抗体时得到的结果。图20计时电流法测量具有抗体和UV可裂解连接物的400nmTRF珠子。将17μL的溶液施用到电极上(碳工作电极、对电极和银/氯化银参比电极)。实线表示具有抗体和UV可裂解连接物的400nmTRF珠子、线---表示1/2稀释的具有抗体和UV可裂解连接物的400nmTRF珠子，并且线…表示PBS对照。图21重新标度的计时电流法测量具有抗体和UV可裂解连接物的400nmTRF珠子(源于图19)。该LED输入电压在504秒的时候从22mV转换成38mV，速率的变化可被清晰的观察到。图22试剂和条件a)F108-PMPI、去离子H2O；b)修饰的3468、PBS(pH7.0)。图23计时电流法测量0(实线)和400(虚线)mIUhCG标准液。在使该溶液流过微流体IMF3装置前进行湿的hCG分析，在所述湿的hCG分析中包括将hCG标准液、400nm3299/UV可裂解二茂铁化合物(UVCFC)和20μm3468胶乳珠子预混大约30分钟。图24与图相同但重新标度以突出0和400mIUhCG测量之间的差异。图25电化学二茂铁化合物结合HAS的百分比，这里二茂铁PEG用一个0-12碳链修饰。图26PBS中IT17的用2端的叉指形电极(interdigitatedelectrode)测量的计时电流分析图。2μm的槽(line)和间隔(gap)(CSEM碳电极)。图27PBS中IT17的2端的叉指形电极测定。2μm的槽和间隔(CSEM碳电极)。图28差示脉冲、裸电极。各种浓度下对IT17的灵敏度线---表示2.5μM。线....表示1μM。实线表示750mM。线----表示500nM。线表示250nM。线表示PBS。图29虚线表示PBS。实线表示PBS中的50μmIT17。电位以100mV/s的速度从0V扫描至0.4V，然后在0.4V持续120s，然后以100mV/s的速度扫描回至0V。使用EtOH流延(cast)的0.1％的高氟化树脂包被的电极。将溶液施加于电极后扫描2分钟。图30虚线表示PBS。实线表示PBS中的50μMIT17。电位以100mV/s的速度从0V扫描至0.4V，然后在0.4V持续120s，然后以100mV/s的速度扫描回至0V。使用H2O流延的0.1％的高氟化树脂包被的电极。将溶液施加于电极后扫描2分钟。具体实施例方式测定一种流体样品中分析物存在或含量的方法可以是一种例如非均相分析的分析方法，例如一种其中结合试剂-分析物复合体被固定在一个捕获相的表面上的侧流或微流型分析。一旦结合试剂-分析物复合体被固定在捕获相上，可裂解物质即可以被裂解并且接着用电化学方法检测，所述方法可以包括例如一个电极或一个电极表面。任何合适的方法都可以被用来从未结合的结合试剂中分离结合试剂-分析物复合体。过滤是该方法的一个例子。合适的分离方法的另一个例子涉及形成一种被磁性标记的结合试剂与结合试剂-分析物复合体的复合体，接着用一个磁体从未结合的结合试剂中分离结合试剂-分析物-被磁性标记的结合试剂的复合体。优选地，结合试剂-分析物复合体和未结合的结合试剂通过将结合试剂-分析物复合体固定在捕获相中进行分离。本发明中使用的结合试剂可以从任何能够与所关注分析物结合形成结合对(bindingpair)的试剂中选择。结合对的例子包括抗体抗原、生物素和抗生物素蛋白、聚合的酸和碱、染料和蛋白质结合剂、肽和特定蛋白结合剂、酶和辅助因子、效应物和受体分子，其中术语受体指任何能够识别分子的一种特定的或极性的取向——即表位或决定位点——的化合物或组合物。提及的抗体包含但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人源化和嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab′)2片段、一个Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体和所有以上抗体的表位结合片段。抗体段包括Fv和Fv’的段。因此，所述结合试剂通常包含一种使得所述分析物可被识别的工具。该工具可以包含一个能结合分析物的识别组分。识别组分的一个具体的实例是一种识别分子，例如一种生物识别分子。所述分子可以以多种方式——例如以共价的方式或通过被动吸收——被连接至结合试剂上。如本文使用的术语“分析物”指任何的分子、化合物或颗粒，其存在或含量待检测并且其中所述分子、化合物或颗粒可以结合本发明的结合试剂。合适的分析物包括有机和无机分子，包括生物分子。在一个优选实施方案中该分析物可以是一种环境污染物(包括农药、杀虫剂、毒素等)；一种化学物质(包括溶剂、聚合物、有机物质等)；治疗用分子(包括治疗用和滥用的药物、抗体等)；生物分子(包括激素、细胞因子、蛋白质、肽、DNA及其片段、核苷酸、脂质、碳水化合物、细胞膜抗原和受体(神经的、激素的、营养的和细胞表面受体)或其配体等)；全细胞(包括原核细胞(例如病原菌)和真核细胞)；或孢子。在另一种优选实施方案中该分析物是一种心脏状况标志物(cardiacmarker)例如脑钠肽(BNP)、N-端连接的BNP、心钠素、硬骨鱼紧张肽、硬骨鱼紧张肽相关肽、肌红蛋白、CK-MB、肌钙蛋白I或肌钙蛋白T。通常，该结合试剂包括多个可裂解物质分子，当被裂解后可以用电化学方法检测。因此可裂解物质必须显示如下两个特征。第一，它们必须能够被从结合试剂上裂解下来并且，第二，一旦它们被裂解下来，它们必须能够利用电化学方法测出。如本文使用的术语“电化学方法”指涉及一个电极表面的氧化和/或还原的任何方法，该方法能够被应用于测定一种电化学活性物质——也称为一种电活性物质——的存在和/或含量。该可裂解物质可以在被从结合试剂上裂解下来的时候显示电化学活性。或者，该可裂解物质可以是一旦被从结合试剂上裂解下来就可转化成一种电化学活性物质。作为另一种选择，该可裂解物质在被从结合试剂上裂解下来以后能够形成有电化学活性的其他物质。然后这些其它物质的存在可以用电化学方法检测，并由此测定裂解物质的存在和/或含量。优选地，可裂解物质在结合到结合试剂上的时候没有电化学活性。对每种结合试剂提供一个以上的可裂解物质分子为放大终信号提供了可能。例如，如果信号能够被放大106，那么皮摩尔级的分析物可给出与毫摩尔级的分析物相当的信号。这种放大提供了一个方便的测量低含量分析物的途径。典型地，每种结合试剂包括至少104个可裂解物质分子。优选地，每种结合试剂包括至少105个的可裂解物质分子。更为优选地每种结合试剂包括至少106个的可裂解物质分子。该结合试剂可以被一个电活性物质分子标记或可以被提供一个电活性部分可以与之连接的结合区域。被标记的结合试剂可以选择为使得从当标记物从结合试剂裂解下的时候具有电化学活性、或能够转化为一种电化学活性物质、或使一种其他物质变成有电化学活性。优选地，被标记的物质在连接到结合试剂的时候没有电化学活性。电活性物质可以是任何能够在一个电极表面被氧化或还原的物质。电活性物质可以是一种氧化还原试剂并因此能够在一个电极表面重复地被氧化和还原。该结合试剂可以用多个电活性部分标记。为每个结合试剂提供一个以上的电活性部分为放大终信号提供了可能。因此对于如放大10的6次幂倍，皮摩尔量级的分析物可给出与毫摩尔量级的分析物相当的信号。这提供一个测量低量级的分析物的方便途径。可裂解物质可以包含任何能够通过电化学方法检测的部分。该部分的例子包括那些二茂铁、硝基苯酚、氨基苯酚、氢醌、水杨酸和磺基水杨酸的衍生物。该部分的另一些例子是二茂铁乙醛、二茂铁甲酸(ferrocenecarboxylicacid)、4-硝基苯酚、p-氨基苯酚、m-硝基苯酚、氢醌、水杨酸和磺基水杨酸。优选的部分是那些二茂铁的衍生物。该二茂铁的衍生物的实例是那些具有由醛、甲基酮、乙基酮、羟基甲烷、羟基乙烷、甲基(羟基亚胺)、羧酸、羧基苯基羧酸和羧基丙酸衍生的基团的二茂铁衍生物。优选地，可裂解物质衍生自二茂铁乙醛。能通过电化学方法检测的可存在于可裂解物质中的部分的另一些例子是亚甲蓝、胶态金、萘醌-4-磺酸盐、p-N，N-二乙基氨基苯基异硫氰酸酯(p-N，N-dithylaminophenylisothiocyanate)、磷酸对氨基苯酯(PAPP)、磷酸对硝基苯酯、3-吲哚氧基磷酸酯(3-IP)、N-(10，12-二十五烷二炔羧)-乙酰基二茂铁、胶态金上的银标记物、氢醌二磷酸酯(HQDP)、磷酸4-氨基-1-萘基酯、1，4-二羟基和1，4-二羟基胺衍生物、对氨基苯基β-D-吡喃半乳糖苷、氢醌、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺、三羰基(η-环戊二烯基)合锰(cymantrene)、TMB(Ox)、磷酸1-萘基酯、萘酚、靛蓝、抗坏血维生素C(ascorbicacid2-phosphate)(AAP)和2，3-二氨基吩嗪。该电化学部分可以是任何适合于为了进行一项检测试验目的的部分。它的一个例子是二茂铁及其衍生物。该电化学物质可以有各种取代基或修饰以使其适合被使用，以例如影响其在所关注的流体样品中的溶解度、影响氧化还原电位、减小或消除与可能存在于流体样品中的组分的结合、使其稳定等等。电化学物质的裂解可以通过多种不同途径完成，例如通过暴露于特定波长的光、用酶或化学法如用一种酸裂解。化学裂解试剂本身可以是光产生的。一般，可裂解物质是光可裂解的或酸可裂解的。上述方法之中光裂解是优选的，因为其不需要加入可能干扰该检测的其它试剂。光可以被应用在该检测装置的单独区域(discreteregion)，例如其捕获区。而且光束的方向和位置也可以通过用镜片、滤光片、挡板等等方便地控制。一个或多个检测电极可以作为该装置的一部分被提供，并可以被安置于与捕获电极很接近的区域。很靠近地放置这些电极使得可以获得较高的捕获裂解的电化学物质的效率。该结合试剂有利地包含多个连接的可裂解不稳定物质分子。因此，当被标记的结合物在捕获区被捕获的时候，大量的氧化还原基团可以从结合试剂中裂解出来，从而提供信号的放大。合适的可裂解基团包含二硫键、邻硝基苯、二醇、重氮键、酯键砜键、缩醛、缩酮、烯醇醚、烯醇酯、烯胺和亚胺。在本发明的一个实施方案中所述不稳定基团是一种光不稳定基团，其可能包含一个芳族硝基，特别是其中硝基在邻位的一个芳族硝基。因此，在一个实施方案中可裂解基团包含一个邻硝基苄基衍生物。合适的酸可裂解基团包括二硫键、羧酸的叔丁酯和酚的叔丁基碳酸酯。或者，该不稳定基团可以是一种酸不稳定基团，其可以被光产酸剂(photoacidgenerator)产生的酸裂解。在本发明的一个实施方案中酸不稳定基团可以在光照之前用一种光产酸剂处理。在一个实施方案中，可裂解物质包括一种可以使用上文定义的电化学方法和上文所定义的可裂解基团检测的部分。这种可裂解物质的一个例子是包含二茂铁乙醛衍生物和邻硝基苯衍生物的物质。为了提供一种有大量——例如大于10的6次幂个——不稳定物质的结合试剂，可以采用各种方法。这种方法之一是提供一个中央核心、例如一个聚合物颗粒作为连接结合试剂和/或被标记物质的位点。基于这点考虑，在一个实施方案中本发明涉及一种包含一个中央核心的结合试剂。该中央核心可以作为可裂解物质能够连接的一个锚位点。该连接可以是直接的，即可裂解物质不使用媒介而与中央核心相连接；或者间接的，即可裂解物质通过一个媒介与中央核心相连接。合适的中央核心包括聚合物球，例如包含胶乳、纳米金颗粒和水凝胶的聚合物球。中央核心的另一个例子是微晶颗粒。优选的中央核心是胶乳珠子。为了把可裂解物质连接于中央核心上，可以直接地或者间接地修饰该核心。合适的修饰包括醛修饰、羧酸修饰和氨基修饰。醛修饰是优选的。在一个优选实施方案中，该中央核心是一个醛修饰的胶乳颗粒。一般，中央核心大小在从5到5000nm之间，优选在从10到1000nm之间，并且更优选在从50到500nm之间。另外一种得到大量不稳定物质的方法是把它们连接在一个直的、支化的或卷曲的聚合物链上，如树枝状聚合物(dendrimer)、互穿聚合物网络(IPN)。所述一条或多条聚合物链可以被连接于基质上、如在颗粒上形成聚合物刷子，或连接在其中聚合物链由基质延伸出来的其它物质上。一个或多个结合物质分子也可以被连接于一条或多条聚合物链或基质等上。在一个实施方案中本发明涉及到一种包含至少一个树枝状部分或聚合物部分的结合试剂。一般，可裂解物质被连接于该树枝状部分或聚合物部分。合适的树枝状部分和聚合物部分包含那些可裂解物质可以连接的部分。合适的树枝状聚合物的例子包括聚(酰氨基胺)PAMAM树枝状聚合物、聚(2-甲基吖丙啶)树枝状聚合物和苯乙炔树枝状聚合物。合适的聚合物的例子包括葡聚糖、PAMAM、PEI、PEG、聚电解质和链霉亲和素(streptavadin)。优选的聚合物部分是葡聚糖。合适类型的葡聚糖的分子量在从10,000到2,000,000Da之间，优选分子量为从100,000到500,000Da。通常该树枝状部分和聚合部分携带官能团，所述官能团可以连接可裂解的物质。这些官能团可以或者是存在于树枝状部分和聚合部分本身或者是额外引入。合适的官能团包括胺、羧酸/羧酸酯、NHS酯、羟基、醛、马来酰亚胺、环氧、巯基。优选的官能团是胺基。关于所述聚合物部分，所述官能团可以存在于聚合物链上或可以通过一种交联剂引入。优选的聚合物部分是氨基葡聚糖。所述树枝状部分或聚合物部分也可以连接于一个中央核心或颗粒上。在一个实施方案中，本发明的结合试剂包含连接于中央核心的至少一个树枝状部分或聚合物部分。在该实施方案中，中央核心优选是醛修饰的胶乳珠子且所述树枝状部分或聚合物部分优选是氨基葡聚糖。可裂解部分可以连接于该树枝状部分或聚合物部分。这是可裂解部分以树枝状部分或聚合物部分作为媒介间接地连接于中央核心的一个例子。本发明的结合试剂也可以通过逐层自组装的方法制备，所述层自组装的方法包括具有相反电荷的聚电解质的连续沉淀。本文所使用的聚电解质是一种具有可离子解离基团的聚合物。可以存在于该聚电解质中的聚阴离子的例子有多磷酸盐、多硫酸盐、多磺酸盐、多膦酸盐、聚丙烯酸盐。可以存在于该聚电解质中的聚阳离子的例子有聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚乙烯亚胺。为了制备这种结合试剂，可裂解物质可以首先连接于一种或多种聚电解质上。这可以通过使用例如功能性交联剂实现。然后，聚电解质可以和具有相反电荷的聚电解质交替地装配到一个中央核心上。合适的中央核心如上定义。合适的聚电解质包含聚(烯丙胺盐酸盐)和聚(苯乙烯磺酸盐)。在聚电解质被装配以后，可以接着加上识别组分。本发明人呈现的一个问题是不稳定物质和结合试剂的非特异性结合的问题。为每个结合试剂提供的不稳定物质越多，这个问题越严重。本发明人已经指出，从空间和/或物理上把结合试剂与不稳定物质分离会减少或消除非特异性结合。因此，本发明也提供一种结合试剂，它们的可裂解物质在其外部表面有树枝状部分或聚合物部分。本发明中，所述可裂解物质的外部表面被认为是它们的一部分，其中当该结合试剂在一个流体样品中时，该部分能够与流体样品相互作用，即该可裂解物质基团的外部表面是该可裂解物质的在该结合试剂的外部的一部分。任何能够减少或消除非特异性结合的聚合物部分或树枝状部分均可以用于此方面。典型的例子是葡聚糖、PEG、一种聚电解质和链霉亲和素。优选的聚合物部分或树枝状部分是葡聚糖。该结合试剂的表面也可以用如PEG的聚合物或树枝状部分嵌段以减少非特异性结合。根据一个实施方案，提供一种具有一条或多条聚合物链例如葡聚糖的颗粒，在所述聚合物链上连接有大量可裂解物质形成一个内核。这个核心周围提供另外一个外部核心，该外部核心包含一条或多条聚合物链如葡聚糖，所述聚合物链与结合物质连接。用这种方式把结合物质与可裂解物质分离已经表现出可减少非特异性结合。可以设想其它实施方案以使结合试剂与不稳定物质分离。当使用含蛋白质的生物样品的时候被发现引起的另一个问题是不稳定电化学活性基团与该蛋白质的一种结合。使用二茂铁在生物样品中作为电化学基团通常伴随的一个常见缺点是二茂铁结合血液中的白蛋白和其它生物蛋白质，这会消弱电极产生的电化学信号的效应。本发明人已经通过提供可裂解的电化学分子(即可裂解物质)克服了这个问题，所述电化学分子通过裂解产生一种二茂铁衍生物，其包含一个二茂铁基团和另外的一些阻碍或基本上阻碍二茂铁部分与蛋白质的疏水区结合的其它基团。如本文实施例中更详细地表明，二茂铁衍生物N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基]-乙基}-二茂铁酰胺(ferrocamide)在这个方面有特别的优势，且提供了与该样品中分析物的浓度相当的信号。因此，本发明也提供包含可裂解物质的结合试剂，其中所述可裂解物质是被修饰的从而使其当被裂解的时候不与检测中包含的分析物或其它部分相互作用。该修饰可以通过如聚乙二醇化(pegylation)而实现。通常，当聚乙二醇化的时候每个可裂解部分将包含1至100个、优选1至25个、更优选1至10个乙二醇衍生的部分。当可裂解物质包含一种二茂铁的衍生物的时候，已发现使用两个乙二醇部分衍生的链进行聚乙二醇化是有效的。该可裂解物质可以通过本领域技术人员已知的常规表面连接化学方法连接于颗粒上。然而，该二茂铁部分通过一个巯基和一个马来酰亚胺基官能团形成硫醚键的结合连接于这种颗粒上。该马来酰亚胺基团可以由如氨基葡聚糖或树枝状聚合物连接于这种颗粒表面。本发明的结合试剂可以包含如增溶剂的其它组分，所述增溶剂例如直链或支链PEG或糖衍生物，其在裂解前和裂解后均可以提高可裂解物质的溶解度，这样可以增强应用本发明的结合试剂的检测的效果。可以存在于本发明的结合试剂中的部分的例子显示如下其中L1是一种包含至少一个能够连接于树枝状部分或聚合物部分或者中央核心的官能团的连接体。可以存在于L1中的基团包括胺、羧酸/羧酸酯、NHS酯、羟基、醛、马来酰亚胺、环氧、巯基、卤素基团。L1的长度可以被控制以提高该可裂解物质的溶解度和/或这个(些)官能团的可及度；PRG是一种能够吸收波长范围最低为340nm的UV光的光反应基团。这类基团的一个例子是2-硝基苄基衍生物；L2是一种包含一个或伯苄或仲苄型氢的连接体。仲苄型氢对提高裂解动力而言是优选的；L3促进在L2处的裂解。L3的合适基团包括氨基甲酸酯、酯和酰胺连接体；S1提高可光裂解分子和裂解的衍生物的溶解度。合适的增溶部分是直链或支链PEG、糖衍生物；L4是增溶部分S1和电化学基团间的一个稳定的连接体。合适的连接体的例子是酰胺、酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚基团；并且E是一个可电化学检测的基团。以上部分仅仅是可存在于本发明的结合试剂中的部分的一个例子。基于多种因素如裂解的机制——上述例子涉及光裂解、裂解时候物质的性质——上述的例子中裂解物质本身具有电化学活性、并且基于具体检测的需要，结合试剂中存在的实际的部分可以相应地改变。本发明提供一种如本文限定的结合试剂。本发明也提供了这种结合试剂用于一种免疫分析法的用途。本发明还提供了一种包含这种结合试剂的检测。一般而言，本发明的结合试剂当结合于一种所关注的分析物的时候能够被固定在一个捕获相中。通常，在没有该分析物的时候这种结合将不会发生。在捕获相中的固定可涉及一种本身可固定在捕获相中的或者可移动的第二结合试剂。当为可移动的时候，这些组分通常可形成一种结合试剂-分析物-第二结合试剂的复合体，然后该复合体可以被固定在捕获相中。所述检测可以是一种非均相分析，例如一种侧流或微流型的分析，其中一种结合试剂、分析物或分析物类似物被固定在一种捕获相的表面，这种捕获相起到直接地或者间接地结合一种可移动的被标记试剂的作用。该被标记试剂(也称结合试剂)可以在使用前预先装入装置或者与流体样品混合。该被标记试剂也可以是结合对的成员之一，如抗原或者抗体。本发明的检测、装置、试剂盒和方法依赖于一种捕获相，该捕获相需要一种能够结合一种分析物的结合试剂，并且该结合试剂允许与被标记试剂偶联。一旦该被标记试剂被固定在捕获相，可以从该试剂中裂解出多个或一个所述电化学部分并在一个电极表面被检测到。该捕获相可以例如提供在一个颗粒的表面、多孔载体或无孔表面如一个微流体装置的内表面。多孔载体的一个例子是硝化纤维素或玻璃纤维。颗粒可以是例如聚合物球例如胶乳或水凝胶。无孔表面可以选自例如塑料或玻璃的任何合适的材料，并且可以是光滑的或者是质地粗糙的。该捕获相适合于提供在一个单独区域，该单独区域可以被称为捕获区。一个检测装置可以有一个其中提供一种固定化的结合试剂(也称为第二结合试剂)的捕获区，使得可移动的被标记结合试剂能够或者直接地或者间接地连接于该区域。根据另外的一个实施方案，未被标记的和被标记的结合试剂(其中未被标记的结合试剂也称为第二结合试剂)都可以是可移动的，并且该装置提供将未被标记的结合试剂-被标记试剂复合体或者未被标记试剂-分析物-被标记试剂复合体固定在捕获区的工具。该工具可能允许未结合的被标记试剂通过而不允许结合的被标记试剂通过，例如一个基于尺寸排阻的过滤器。未被标记结合试剂可以例如被一个其尺寸不允许其通过过滤器的颗粒标记，同时被标记的结合试剂能够通过所述过滤器。因此，一个未被标记的结合试剂-被标记的结合试剂复合体的形成将该被标记的结合试剂从过滤器上游固定或固定在过滤器上。因此过滤器和颗粒的尺寸可以被选择。该颗粒可以是例如水凝胶。使用该装置时可以与一个计量器联合使用或可以是一个计量器的组成部分。该装置一般拟作为一次性使用的，而计量器拟作为可重复使用的。当计量器和装置是一个整体单元时，该计量器可为一次性使用的。该计量器可以包含下列选项中的一个或多个信号转导元件、一个光源、显示工具、信号处理工具、接收或连接该装置的工具、一个电源、存储工具和信号输出及输入工具。对于本发明的目的，所提及的一种被标记的结合试剂或连接于一种结合试剂的被标记物质并不一定意味着该结合试剂是直接连接于所述的标记上。例如，一个或多个标记和一个或多个结合试剂可以被连接于相同的或不同的其它基质例如聚合物或颗粒上，从而有效地间接连接或键合该标记物质和结合试剂。一个结合试剂可以包含一个连接于基质的结合物质。本发明的检测装置和试剂盒适合于检测流体样品中一定范围的分析物。该样品可以是自然界中生物的、环境的或工业的样品。生物样品可以来自于动物或人。该样品可以是选自血液、血清、血浆、组织液、尿、脑脊液、泪、唾液、鼻涕(nasalfluid)等的任何生物样品。该样品可以是一个固体样品例如细胞碎屑或细胞，其可以与一种液体混合以提供一种流体样品。本发明的一方面提供一个检测装置或试剂盒用于测定一个样品中一种分析物的含量或存在，所述装置或试剂盒包含；(a)一种结合试剂，其能够结合样品中所关注的分析物或一种固定化的试剂以形成结合对，其中该结合试剂用一种含有不稳定基团的物质标记，该物质对一种刺激的反应是可裂解以提供一种不稳定的电化学活性物质，(b)一个捕获相，其包含一种含有一种试剂的载体，所述试剂能够结合或连接于所述分析物或所述被标记试剂，和；(c)一个电极，其能够检测该不稳定电化学活性物质以指示待测分析物的存在或含量。该装置可以任选地被提供裂解该不稳定物质的其它试剂或工具。如果裂解的工具为例如通过光，则该装置可以具有一个光源。或者，该光源可以提供在一个计量器中，其中该装置与该计量器相配合安装。该光源的位置设置为使其照亮所关注的区域，例如捕获相或区。考虑到利用光作为裂解刺激物，本发明有特别的优越性，因为使用该试剂盒仅需要一个步骤就可以鉴定分析物的浓度，所述步骤即将特定波长的光应用于裂解不稳定键，以进行对该样品中该分析物的含量和存在的电化学测定。该电极表面的电化学化合物的氧化和/或还原产生的电流可以与该样品中分析物的含量或存在相关联。在本发明的一个实施方案中，在放大相或捕获相中或者同时在二者中所使用的颗粒可以是任何合适的具体底物，例如胶乳、金或二氧化硅珠子。当该检测试剂盒与一个微流体装置联合使用时，放大相的颗粒可以有利地以粉或可印刷油墨(printableink)的形式提供，其可以由一微通道的表面提供，并且其可以在样品通过其以后被重新悬浮。根据本发明的电极可以以任何合适材料构成，例如钯、铂、金、银、碳、钛或铜。该电极被一种离子交换膜如高氟化树脂膜包被，其当与例如作为电化学氧化还原基团的二茂铁共同使用的时候特别有利。该高氟化树脂膜涂层有利地允许Fc+离子聚集，所述涂层可从电极表面剥落。电极可以间距很近，例如一个电极和另一个电极的距离是5u，这为信号的进一步放大提供了可能。电极可以是叉指形的。本发明也涉及免疫分析中使用的被标记的结合试剂以及其相关的可用于鉴定或测量流体样品中想要的分析物含量的免疫分析、检测装置和试剂盒。本发明也涉及一个被设计为与检测装置和/或试剂盒联合工作的计量器。根据第一个方面，本发明提供一种用于免疫分析中的被标记的结合试剂，其中结合试剂用一种可被从该结合试剂上裂解以产生一种不稳定电化学活性物质的不稳定物质标记，所述不稳定电化学活性物质可随后在电极表面被检测到。根据另一方面，本发明提供一种用于测定样品中一种分析物的存在或含量的免疫分析装置，其中所述装置包含根据前一方面的一种被标记的结合试剂。根据另一方面，本发明提供一种包含一种根据第一方面的试剂的免疫分析试剂盒。还根据另一方面，本发明提供一种使用一种根据第一方面的试剂进行免疫分析的方法。本发明提供一种用于免疫分析的结合试剂，其中该结合试剂被通过一个可裂解基团连接于该结合试剂上的一个或多个不稳定的可裂解电化学活性物质分子所标记。本发明也提供这样一种结合试剂，其中可裂解基团可以选自光可裂解基团和酸可裂解基团。本发明进一步提供这样一种结合试剂，其中电化学活性物质是一种氧化还原活性物质。这种活性物质可为二茂铁或二茂铁衍生物。本发明也提供这样一种结合试剂，其中该结合试剂具有多个不稳定的可裂解电化学活性基团。本发明也提供一种检测流体样品中分析物的存在或含量的方法，该方法包括把一种被怀疑含有所关注分析物的流体样品与标记有一个或多个不稳定的电化学活性基团的结合试剂和第二结合试剂混和，以形成被固定于捕获区的第二结合试剂-被标记的结合试剂复合体；从该固定化的复合体上裂解该一个或多个电化学活性基团并接着在一个电极表面检测这些电化学活性基团，以提供该流体样品中待测分析物的含量或限度或者存在的指示。本发明还提供一种用于测量样品中分析物的含量或者存在的检测试剂盒，该试剂盒包括；(a)一种结合试剂，其能够结合该样品中所关注的分析物或者一种被固定的试剂以形成结合对，其中该结合试剂被一种含有不稳定基团的物质所标记，该物质对一种刺激的反应是可被裂解以产生一种不稳定的电化学活性的物质，(b)一个捕获相，其包含一种含有一种试剂的载体，所述试剂能够结合或连接于所述分析物或所述被标记的试剂，和；(c)一个电极，其能够检测该不稳定电化学活性物质以提供待测分析物的存在或含量的指示。本发明也提供这样的检测试剂盒，其中电极被装置于捕获区的附近区域。这种电极可以包被有一层离子交换膜。这种离子交换膜的一个例子是高氟化树脂膜。下面的实施例对本发明进行说明。实施例3.1放大载体/相的设计3.1.1UV可裂解的电化学分子邻硝基苄基衍生物已经被广泛的应用于有机合成中——特别是作为一个保护基，以及在生物学应用中用于分离、纯化和鉴定靶生物分子，由于其在使用低能量的UV光时也有很高的光裂解效率。一个假想的邻硝基苄基衍生物的光分解机制在图示3.1中显示。此假想机制认为与环状形式B快速平衡的酸式硝基中间体A由一个三步的过程形成1)UV光激活硝基2)分子内氢从苄基碳转移到硝基的氧上。3)电子重排。接着化合物D的释放和亚硝基衍生物C的形成通过氧从氮转移到苄基碳而实现。图示3.1提出的邻硝基苄基衍生物光分解的机制我们打算应用此光裂解性质作为一种手段设计一个电化学检测法，其中电化学信号由不稳定键的UV裂解引发。3.1.2UV可裂解的二茂铁分子的合成我们的第一个目标是合成一种新的分子，该分子包含一个邻硝基苄基核心、一个使该分子连接于载体上的官能团、一个电化学基团和一个可光裂解键，该可光裂解键可以在UV的照射下被高效地裂解以快速地把一种电化学衍生物释放到溶液中。这种分子的一个例子表示如下。UV可裂解的二茂铁分子UV可裂解的二茂铁分子9的合成在图示3.2中显示。前体1-(5-溴甲基-2硝基-苯基)-乙酮4根据Doppler等人的方法由市售的5-甲基-2-硝基苯甲酸起始通过5个步骤得到。然后用硼氢化钠处理酮4将其转化成其相应的仲醇5。接着，巯基以硫代乙酸盐的形式被引入，其作为二茂铁衍生物8的引入过程中的一个保护基团。该二茂铁衍生物8根据图示3.3通过直接把二茂铁甲酸与大量过量的2，2′-(亚乙二氧基)二-(乙胺)偶联得到。过量物质的使用是为了以生成二取代物为代价促进单烷基化产物的形成。然后，将8的伯氨基官能团与活性的(N-羟基正丁二酰亚胺)酯偶联形成一个氨基甲酸酯键。图示3.2试剂和条件a)SOCl2、CH2Cl2；b)Mg、EtOH、甲苯、回流；c)甲苯、回流；d)H3O+、回流；e)NBS、过氧化苯甲酰(benzoylperoxide)、CCl4、回流；f)NaBH4、二氧杂环己烷/甲醇；g)CH3C(O)S-K+、DMF；h)DSC、Et3N、CH3CN；i)8、Et3N、CH2Cl2。图示3.3试剂和条件a)EDCI、HOBt、ET3N、H2N(CH2CH2O)2CH2CH2NH2、CH2Cl2。3.1.3溶液中的光分解鉴于分子已被合成，我们下一个目标是证明它在溶液中的光裂解。根据图示3.1(3.1.1节)，UV可裂解的二茂铁9的光分解(hv365nm)将导致两种主要产物的形成(图示3.4)。根据中间的pH值，二茂铁衍生物8可以是质子化的或者是非质子化的。图示3.4UV可裂解的二茂铁分子9可能的光裂解裂解研究以后进行薄层色谱法(TLC)，该薄层色谱法在UV可裂解的二茂铁9的甲醇/PBS溶液经过设定时间的照射后进行(图3)。-经过2分钟的照射后，观察到两种新产物的出现；一个与二茂铁产物8(在基线上)相对应，另一个可能与亚硝基衍生物10(恰好在前沿线下面)相对应。-在所用的照射条件下，UV可裂解二茂铁分子在不到6分钟的时间内被完全裂解。3.2把UV可裂解的二茂铁分子连接于载体上/从载体上光裂解我们的下一个目标是评估分子9当连接于一个载体上的时候裂解的效率。如简介部分所示，可以考虑使用多种不同的载体，只要所述载体包含大量的连接位点。在我们的实施例中选择0.4μm的乙醛修饰的胶乳颗粒。3.2.1把UV可裂解的二茂铁分子连接于胶乳颗粒为了达到检测最低至pM量级的分析物的目的，每个颗粒上需要连接大量的UV可裂解二茂铁。因此，考虑使用表面修饰以提高该颗粒上可用的连接位点的数量。实际的UV可裂解的二茂铁分子9具有一个被保护的巯基，该巯基在脱保护后呈现一种允许其结合一个马来酰亚胺基官能团形成一个硫醚键的活性(图示3.5)。图示3.5巯基结合马来酰亚胺基因此，我们决定探索在该颗粒表面引入多个马来酰亚胺基的方法。表面修饰的一个例子在图4中显示。UV可裂解二茂铁的连接从市售的0.4μm珠子(1.6％的固体物，高分子微球，红色荧光，乙醛修饰)起始通过3个步骤完成。在第一步，氨基葡聚糖通过还原性胺化作用被偶联到珠子上。因为氨基葡聚糖的聚合性质，所以希望剩下的没有偶联的氨基官能团在胶乳的表面仍然可进行进一步的偶联。因此，在第二步中马来酰亚胺基通过使用一种异双官能(heterobifunctionnal)交联剂GMBS(马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯)被引入。最后，根据图示3.6进行巯基的脱保护后，UV可裂解二茂铁分子通过硫醚键共价偶联到胶乳上。图示3.6试剂和条件a)MeOH/PBS(50/50)、EDTA(0.1M)、羟基胺.HCl(1M)。3.2.2从胶乳颗粒上光裂解UV可裂解的二茂铁分子3.2.2.1用B100A型的UV灯进行光裂解二茂铁衍生物8被从珠子上光裂解并且因此被释放到溶液中，然后对其用循环伏安法进行研究。用一个B100A型的UV灯在365nm的波长(10”处强度为8,900μW/cm2)下对不同浓度的珠子照射5分钟。照射前后的电化学响应的差异在图5、6和7中显示，该差异归因于从胶乳颗粒上对二茂铁衍生物8进行光释放的差异。3.3用UV可裂解二茂铁分子敏化的对400nmTRL珠子性质的研究实验关注于实时跟踪UV可裂解的二茂铁分子的裂解(而不是进行例如循环伏安法的单点测量，以更多地理解裂解过程)，并且测定每个珠子的UV可裂解二茂铁分子的数量的近似值。制备了许多珠子溶液，其浓度随后通过流式细胞术测定(每17μL中1.16E+08、46600000、23300000、11650000、5825000、2912500和1456250个珠子)。实验的细节在2.5.2节中描述。结果总结在图8中，显示的原始数据中包含PBS对照。经过大约50秒的计时电流法测量，开启绿色LED提供360nm的UV光。有意思的是即使没有UV可裂解的二茂铁分子存在(即PBS对照)的时候也观察到电流的最初升高，目前这个现象的原因仍然是未知的。所测量的电流与珠子浓度逻辑上相关，并因此与裂解的二茂铁分子的量相关，最高的珠子浓度产生最大电流且最低的珠子浓度产生最小电流。同样的数据经归一化(扣除PBS的数据进行基线校正)和重新标度后在图9中显示。电流随珠子浓度变化的现象更清楚地显示出来。必须指出，在四个最高的珠子浓度(1.16E+08、46600000、23300000、11650000)下当计时电流法测量结束时电流仍然在增加，这说明在给定的时间范围内UV裂解是不完全的。最低的珠子浓度(每17μL中2912500个珠子)显示电流的增加接着是电流的减小，这说明UV可裂解的二茂铁分子正在被耗尽，相比之下PBS对照没有显示这个现象，如图10所示。为了计算每个400nm珠子有大约多少个UV裂解的二茂铁分子，做出了电流与UV可裂解的二茂铁分子8的关系的标定曲线。这包括用相同的方法在UV可裂解的二茂铁分子的一个已知浓度范围内测量电流响应，以用于对珠子浓度和电流强度进行研究。这些数据总结在图11中。从图11中，可以得到电流与UV裂解的二茂铁分子的关系的标定曲线。从图9的200秒处的点得出每个浓度下的数值(i/A)。所得的标定曲线在图12中显示。颗粒数量与i/A(UV裂解的二茂铁分子)的关系曲线清楚地显示这两个参数间的很好的相关性。这在图13中显示。该标定曲线(图12)使得可以将图10中的来自400nm珠子的UV裂解的二茂铁分子产生的电流转换成浓度，因此可以得到如图14中所示的UV裂解的二茂铁(μM)与珠子浓度的关系曲线。利用图14可以计算每个400nm珠子上UV可裂解的二茂铁分子的数量的近似值。计算如下所示用图14的22μM的值。每ml中颗粒的数量＝每ml2.74E+09-流式细胞术测得的数量每μL中颗粒的数量＝每μL2.74E+06每17μL中颗粒的数量＝1.16E+08每μM分子的数量＝6.02E+17因此每ml中分子的数量＝6.02E+14因此每μL中分子的数量＝6.02E+11因此每17μL中分子的数量＝1.02E+14因此在17μL中在22μM下＝2.25E+14个FcPEG分子每个颗粒FcPEG分子的大约数量＝2.25E+14/1.16E+08＝每个颗粒4.83E+06这个大约的数量是一个低估值，因为在200秒的点处电流仍然在增加。并且必须注意到仅仅是UV可裂解二茂铁分子与400nm珠子偶联。一旦抗体也与400nm珠子偶联，UV可裂解的二茂铁分子的数量将会明显地减小。3.4二茂铁分子在薄层室(thinlayercell)/毛细管填充装置中的UV裂解二茂铁分子从400nm珠子上的UV裂解已经在前文证明，然而进行这些测量是把总体积为17μL的溶液滴加到丝网印刷电极上。在3.4节我们证明使用薄层室/毛细管填充装置进行的非常相似的测量。如材料和方法部分所述，用双面胶带和条状盖在丝网印刷电极上构造薄层室/毛细管填充装置。结果的总结在图15中显示。相同数据经过重新标度在图16中显示。该简单实验证明UV裂解能够在薄层室/毛细管填充装置中用小体积的样品实现，虽然所用6μL体积的样品中大约仅2μL覆盖电极。另外，通过改变LED输入电压并因此改变UV光的量，可改变裂解的量。3.5把UV可裂解的二茂铁分子和抗体都偶联到胶乳颗粒上尝试两种相反的策略把UV可裂解的分子和抗体(在这个例子中是3299)都偶联到胶乳颗粒上-第一种方法把抗体与载体偶联之后再连接UV可裂解的二茂铁分子。-第二种方法连接UV可裂解的二茂铁分子之后偶联抗体。3.5.1方法1偶联抗体之后偶联UV可裂解的分子需要再次考虑表面修饰以使珠子偶联的抗体和UV可裂解的分子最多。这个方法中使用的表面修饰的一个例子在图17中显示。与抗体和UV可裂解的二茂铁分子的偶联通过4个步骤实现，其使用与上述的过程相同的化学作用把UV可裂解的二茂铁分子连接于胶乳颗粒上。第1、2步和UV可裂解的分子9的脱保护也在这一节中说明。在第3步中，按照图示3.7修饰的3299抗体被结合到连接在珠子上的马来酰亚胺基上。因为大量的马来酰亚胺基官能团存在于该颗粒表面并且因为抗体的巨大体积，预计剩下的马来酰亚胺基仍然可以在第4步与UV可裂解的二茂铁分子偶联。图示3.7试剂和条件a)SAMSA、DMF、PBS；b)EDTA(0.1M)、羟基胺(1M)、PBS。3.5.2方法2偶联UV可裂解的分子之后偶联抗体这个方法使用的表面修饰的一个例子在图18中显示。对UV可裂解的二茂铁分子和3299抗体的偶联通过6个步骤实现，其使用的化学作用涉及记载把UV可裂解的二茂铁连接于胶乳颗粒(A)的节中和上述方法1中所用的化学作用。第1、2步和UV可裂解的分子9的脱保护在上文关于A的节中进行了说明。抗体的修饰在方法1中说明。这里使用的策略包含同时连接UV可裂解的二茂铁分子和一个第二双官能团连接体，以在胶乳的表面引入可利用的羧基官能团，以便进一步偶联抗体。为了达到这个目的选择HSPEG4CO2H。在此阶段，第二层的氨基葡聚糖通过酰胺键被偶联到胶乳上，然后是交联剂GMBS的连接以结合修饰的3299。3.6当抗体也偶联上后对每个400nm珠子上UV可裂解的二茂铁分子数量的研究用与3.3节中所述相同的测量方法和步骤测定当抗体也偶联到400nm珠子上的时候UV可裂解的二茂铁分子的数量。特别检验了两种方法，第一种是先偶联3299(抗hCG)抗体再偶联UV可裂解的二茂铁分子，第二种相反方案，先偶联UV可裂解的二茂铁分子再偶联抗体。结果被总结在图19和图20中。然后，用200秒处的i/A值计算每个珠子上UV可裂解的二茂铁分子的数量。结果总结在表3.1中。表3.1因此，首先在400nmTRL珠子上偶联UV可裂解的二茂铁分子然后偶联抗体获得每个400nm珠子上最大数量的UV可裂解的二茂铁分子。有意思的是，在图19中显示的计时电流法测量过程中，LED输入电压在测量开始大约504秒时被从22mV调到38mV。清晰地观察到如所预期的速率的变化，如图21中所突出显示的，这证实了前面的观察结果(见图15)。3.7设计捕获相/区如在简介部分所知，捕获相/区必须包括至少2个明确限定的部件一个表面和一个生物识别部分，该生物识别部分能够被动地吸收在表面上或者在表面修饰后共价连接在表面上。制备的捕获相的一个例子显示在图22中。在这个例子中，我们选择用硫醚键将3468抗体共价连接经过修饰的20μm珠子。抗体的偶联起始于市售的基于聚苯乙烯的20μm的颗粒，通过2个步骤完成。在第1步中，马来酰亚胺基通过吸收被引入到F108-PMPI(合成见以下图示3.8)珠子的表面，所述珠子是一种三嵌段聚合体洗涤剂。然后将根据3.5.1节的图示3.7修饰的抗体3468结合到该马来酰亚胺官能团上。图示3.7F108-PMPI的合成3.8用IMF3用计时电流法进行测量的hCG“湿分析”进行一种湿分析，其中将20μm颗粒、400nm颗粒和hCG标准样品(0或400mIU)预混合大约30分钟(更详细内容见材料和方法部分)。计时电流法测量(见图23和24)用IMF3装置(见材料和方法部分)进行。每个浓度仅进行一次测量，因为400nm颗粒(抗hcg抗体、UV可裂解二茂铁分子)和最终的UV可裂解的二茂铁分子供应量有限。将来的研究将会在能够获取这些颗粒之后报道。然而，0和400mIUhCG标准样品之间很明显有很大不同，这在图24中有更清晰的显示。用0hCG在UV光源开启时观察到电流的最初升高，接着是电流的降低。在对比研究中观察到同样的电流的最初升高，接着是电流的继续升高并在大约117秒的点处开始降低。这说明该溶液正在耗尽UV可裂解的二茂铁分子。3.9UV可裂解的二茂铁分子的选择有几种不同类型的二茂铁分子可被选择进行电化学测量。优选的分子是二茂铁PEG，因为之前的实验鉴定其特征有利于蛋白质、血浆或血液溶液中进行的电化学测量。测量这类样品中电化学标记物的问题之一是电化学标记物与蛋白质分子特别是人血清白蛋白(HSA)的结合并因此损失信号。一个先前的研究二茂铁分子与HSA结合的研究被总结在图25中。合成了一系列的被二茂铁标记的脂肪酸探针，其包含二茂铁、一个连接体、一个增溶间隔基(spacer)、一个第二连接体和一个碳长度不同的脂肪酸。碳长度的变化方案包括3个(化合物4)、6个(化合物6)、9个(化合物)、11个(化合物2)和16个(化合物10)碳原子，所述碳原子数目包括末端羧基的碳(图示3.8)。循环伏安法被用来在HSA存在或者不存在的情况下测量被二茂铁标记的脂肪酸探针的浓度，使得可以计算结合百分比。图3.24清晰地表明被二茂铁标记的脂肪酸探针物质(25μM)与HSA(500μM)的结合百分比可通过变化碳链的长度的方法进行控制。有意思的是，发现0个碳的对照分子二茂铁甲醇与HSA的结合相对较强，50％地结合HSA。目前，我们不确定二茂铁结合HSA的位置，并且我们不打算研究这个，尽管认为可能涉及其中一个药物结合位点并且这是正在进行的工作的主题。当二茂铁通过一个PEG连接体分子结合到一个短碳链上，该链将阻止二茂铁结合HSA，这可能是因为空间位阻或二茂铁上电荷的改变，或者综合二种原因。图示3.8被二茂铁标记的脂肪酸探针的一般结构3.10UV裂解的二茂铁分子的电化学测量现在没有尝试进行对UV裂解的二茂铁分子的电化学测量技术的优化。计时电流法被应用于整个研究之中是因为其相对简单的测量而且也能提供有质量的数据，例如给出电位电化学检测早期发展中必须的动力学数据。然而有许多其它电化学测量方法能够对二茂铁分子进行更灵敏的测量。以前的研究已经确定了多种电化学技术可以用于提高测量灵敏度。例如已经用叉指形微电极阵列进行二茂铁分子的高灵敏度测量。总结的结果在图中显示，灵敏度为300nM(测量技术的灵敏度，并非针对所有与之相关的检测)。相似地，已经研究了差示脉冲测量可作为一种可能的测量二茂铁分子的方法。结果总结在图28中。另外，以前的研究显示二茂铁分子可以在高氟化树脂包被的电极中聚集。特别地，高氟化树脂包被电极时的反向峰值电流(reversepeakcurrent)比未包被电极时的大。这可能是由于信号分子在高氟化树脂中的聚集所致。为了证实这一点，进行了溶出伏安法，其中电位从0V扫描到信号分子被氧化的电位，然后在保持两分钟后扫描回来。从扫描回来得到的电流可以总结出信号分子在用水流延的高氟化树脂包被中显著地聚集。在用乙醇流延的高氟化树脂中没能发现这种聚集(见图29和30)。高氟化树脂膜(用水流延)除了具有二茂铁聚集性质之外，也显示出能够在尿酸和抗坏血酸的存在下测量二茂铁化合物。这些化合物是血液中发现的两种主要的电化学干扰物。高氟化树脂膜使尿酸/抗坏血酸的电流贡献累加到所测的二茂铁电流上，而不出现“居间”现象，即在尿酸/抗坏血酸的存在下所测的二茂铁电流大于分别测定的二茂铁和尿酸/抗坏血酸电流的和。但该电流仍然是累加的电流，并且需要进行尿酸/抗坏血酸电流贡献的背景测量以进行背景校正。材料和方法所有湿敏感型的反应在氮气氛下用烘干的玻璃器皿和无水溶剂进行。除非另有说明，试剂从供应商处获得并且使用时不作进一步纯化。反应通过使用Kieselgel60F254板的UV检测的TLC进行监测。闪式柱色谱用硅胶60进行。1HNMR谱用BrukerAMX-300或AVANCE400在300MHz或400MHz下被记录。13CNMR谱在75MHz或100MHz下被记录。相对积分、峰裂数(s单峰、d双峰、t三重峰、m多重峰)和偶合常数，单位为Hz，在可能存在的地方被标出。用Micromass的QuattroLC仪器(ES)获得质谱。第6步的反应在黑暗中进行。终产物和所有中间体均避光保存。2.1合成UV可裂解的二茂铁分子第1步合成5-甲基-2-硝基-苯甲酰氯1在溶于20ml无水二氯甲烷中的5-甲基-2-硝基苯甲酸(1.50g，8.28*10-3摩尔)的溶液中加入两滴的无水DMF和亚硫酰氯(1.82ml，2.48*10-2摩尔)。室温下搅拌该溶液30分钟。然后蒸发溶剂并且将残留物溶于20ml乙醚中，再次除去溶剂。粗品中间体1不经过纯化被使用。第2步合成乙氧基镁丙二酸二乙酯制备一种由在10ml无水甲苯中的镁屑(0.294g，1.21*10-2摩尔)、丙二酸二乙酯(1.84ml，1.21*10-2摩尔)、乙醇(1.21*10-2摩尔)组成的反应混合物。将该混合物加热至回流1小时30分。在这个过程中大部分的镁被消耗。直接使用这个物料。注使用干燥管。如果10分钟后反应没有开始(自持的剧烈的回流)，将4滴四氯化碳加入至混合物中。第3和4步合成1-(5-甲基-2-硝基-苯基)-乙酮3将中间体1溶解在5ml的无水甲苯中并将其加入到中间体2的溶液中。该反应混合物回流30分钟。然后蒸发溶剂，然后将45ml的6M的硫酸加入到残留物中。该混合物回流3h。在冷却之后，将该混合物倒入一个分液漏斗中并且用乙醚萃取。经碱洗后，有机相用水洗然后用硫酸钠干燥，过滤并且在减压下除去溶剂，获得1.365g(经过四步后产率92％)橙色油状产物。该物质可以直接在下一步中使用。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.39(s，3H，CH3)，2.45(s，3H，CH3)，7.12(1H，m，ArH)，7.29-7.32(m，1H，ArH)，7.98-8.02(m，1HArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC21.2(CH3)，30.0(CH3)，124.2，127.5，130.g，137.9，143.0，146.0(Ar)，200.4(CO).第5步合成1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)-乙酮4将4ml无水四氯化碳中的1-(5-甲基-2-硝基苯基)-乙酮3(0.700g，3.91*10-3摩尔)、N-溴代琥珀酰亚胺(0.765g，4.30*10-3摩尔)和过氧化苯酰(10mg)的混合物加热至回流1小时30分。然后将该混合物冷却、过滤并蒸发至干。用柱色谱(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至80％的己烷)纯化产物，得到0.603g(60％)的标题化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.53(s，3H，CH3)，4.48(s，CH2Br)，7.41(m，1H，ArH)，7.60(m，1H，ArH)，8.04(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC30.0(CH3)，37.3(CH2Br)，125.0，127.8，131.0，138.3，144.8，147.6(Ar)，199.4(CO).m/z(+ES)279.9[M+Na]+.第6步合成1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)乙醇5反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。将固体的硼氢化钠(0.081g，2.13*10-3摩尔)快速加入到冰冷的1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)-乙酮4(0.500g，1.94*10-3摩尔)的二氧杂环己烷(4ml)和甲醇(6ml)溶液中。0℃下搅拌30分钟后，剩余的硼氢化钠通过加入丙酮停止反应。然后蒸发溶剂。将粗产物溶于二氯甲烷，用HCl/水洗涤并最后用盐水洗涤。然后，有机相经硫酸钠干燥、过滤并蒸发至干。用柱色谱(1)己烷/乙酸乙酯90/10、2)己烷/乙酸乙酯75/25)纯化产物，得到0.353g(70％)的标题化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH1.54(m，3H，CH3CH)，4.49(s，CH2Br)，5.43(m，1H，CHCH3)，7.45(m，1H，ArH)，7.85-7.88(m，2H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC24.4(CH3CH)，38.5(CH2Br)，66.5(CH3CH)，125.1，128.1，128.6，141.8，143.7(Ar).m/z(+ES)281.9[M+Na]+.第7步合成硫代乙酸S-[3-(1-羟基-乙基)-4-硝基-苯基]酯6反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。向溶于5ml无水DMF的1-(5-溴甲基-2-硝基-苯基)乙醇5(0.350g，1.35*10-3摩尔)的溶液中加入硫代乙酸钾(0.170g，1.49*10-3摩尔)。室温下搅拌该混合物2个小时。然后将该溶液在水和二氯甲烷之间分配。之后该有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用柱色谱(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至70％的己烷)纯化产物，得到为0.242g(70％)的标题化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH1.55(d，J＝6.3Hz，3H，CH3CH)，2.36(s，3H，CH3CO)，4.14(s，2H，CH2S)，5.41(m，1H，CH3CH)，7.31-7.34(m，1H，ArH)，7.75(m，1H，ArH)，7.83-7.86(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC24.2(CH3CH)，30.3和32.8(CH2S+CH3CO)，65.6(CH3CH)，124.9，127.9，128.4，141.5，144.4(Ar)，194.5(SCO).m/z(+ES)278[M+Na]+.第8步合成硫代乙酸3-[1-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)乙基]-4-硝基苯甲酯7反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。向溶于3ml无水乙腈的硫代乙酸S-[3-(1-羟基-乙基)-4-硝基-苄基]酯6(0.220g，8.66*10-4摩尔)的溶液中加入三乙胺(2当量)。然后加入N’，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.288g，1.126*10-3摩尔)。在0℃下搅拌该混合物30分钟，之后在室温下放置过夜。然后在减压条件下蒸发溶剂。用柱色谱(梯度己烷/乙酸乙酯，100％的己烷至40％的己烷)纯化产物，得到0.171g(50％)的标题化合物。1HNMR(CDCl3，400MHz)δH1.75(D，J＝6.4Hz，3H，CH3CH)，2.32(s，3H，CH3CO)，2.77(s，4H，CH2琥珀酰亚胺基)，4.16(s，2H，CH2S)，6.38(m，1H，CH3CH)，7.40，7.61，7.94(m，ArH).13CNMR(CDCl3，100MHz)δC21.9(CH3CH)，25.4(CH2琥珀酰亚胺基)，30.1和32.5(CH2S+CH3CO)，75.8(CH3CH)，125.2，127.1，129.4，136.1，145.4，150.5(Ar)，165.5，169.0，194.2(CO).m/z(+ES)419.1[M+Na]+.第9步合成硫代乙酸S-[3-(1-{2[2-(2-二茂铁羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基氧基}-乙基)-4-硝基-苄基]酯9反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。将硫代乙酸3-[1-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙基]-4-硝基苯甲酯7(0.150g，3.80*10-4摩尔)溶解于无水二氯甲烷中，并加入到搅拌的8(0.164g，4.56*10-4摩尔)的无水二氯甲烷溶液中。然后加入三乙胺(1.2当量)。在室温下搅拌该混合物过夜。有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用以下洗脱液通过柱色谱纯化产物洗脱液1)乙酸乙酯/己烷(30/70)、2)乙酸乙酯/己烷(60/40)、3)100％乙酸乙酯，得到0.097g(40％)的标题化合物。产物在4℃避光保存。1HNMR(CDCl3，400MHz)δH1.59(d，J＝6.5Hz，3H，CH3CH)，2.35(s，3H，CH3CO)，3.33(m，2H，CH2NH)，3.50-3.60(m，10H，CH2O+CH2NH)，4.11(s，2H，CH2S)，4.20(m，5H，Cp)，4.33(m，2H，Cp)4.67(m，2H，Cp)，5.30(br，1H，NH)，6.22(m，2H，CH3CH+NH)，7.31(m1H，ArH)，7.52(m，1H，ArH)，7.85(m，1H，ArH).13CNMR(CDCl3，100MHz)δC22.1(CH3CH)，30.2和32.7(CH2S+CH3CO)，39.2和40.7(CH2NH)，68.1-75.9(几个信号，Cp+CH2O+CHCH3)，124.9，127.4，128.4，139.0，144.1，146.8(Ar)，155.2(CO氨基甲酸酯)，170.3(COCp)，194.1(SCO).m/z(+ES)664.2[M+Na]+.第10步合成N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}二茂铁酰胺8向二茂铁甲酸(0.500g，2.17*10-3摩尔)的无水二氯甲烷溶液中加入1-羟基苯并三唑水合物(0.326g，2.87*10-3摩尔)。在室温下搅拌10分钟后加入EDCI(0.457g，2.87*10-3摩尔)和三乙胺(2.2当量)。在室温下搅拌该混合物30分钟。然后在0℃把该溶液逐滴加到2，2′-(亚乙二氧基)双-(乙胺)(3.21g，2.17*10-2摩尔)的溶液中。在室温下搅拌该混合物过夜。在过滤后将滤液洗涤三次，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用柱色谱(洗脱液二氯甲烷/甲醇/三乙胺，85/10/5)纯化产物，得到0.312g(40％)的标题化合物。1HNMR(CDCl3，300MHz)δH2.87(m，2H，CH2NH2)，3.48-3.61(m，10H，CH2O+CH2NH)，4.17(m，5H，Cp)，4.29(m，2H，Cp)，4.69(m，2H，Cp)，6.38(br，1H，NH).13CNMR(CDCl3，75.56MHz)δC39.0(CH2NH2)，41.2(CH2NH)，68.0-75.8(几个信号，Cp+CH2O)，170.1(CO).m/z(+ES)383[M+Na]+.2.2将UV可裂解的二茂铁分子偶联至颗粒上2.2.1用氨基葡聚糖包被400nmTRL珠子(具有CHO官能团)/胶乳理论浓度为0.3％固体向悬浮于392.5μlMES(pH6.0，50mM)中的400nmTRL珠子(具有CHO官能团，187.5μl，1.6％w/v)的悬浮液中加入400μl的氨基葡聚糖溶液，所述氨基葡聚糖溶液通过在600μl的MES(pH6.0，50mM)中溶解3mg的氨基葡聚糖得到。该悬浮液经台式旋涡仪(benchvortex)搅拌，然后加入20μl的NaBH3CN(1M)的溶液。该胶乳在室温下搅拌(立式圆筒形混合仪(end-over-endmixer))保温过夜。然后将该悬浮液离心(15,500rpm，15℃)20分钟。弃去上清液，加入1ml的MES(pH6.0，50mM)，沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮。然后将该悬浮液离心(15,500rpm，15℃)20分钟。弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。最后，将沉淀物重新悬浮于1ml的MES(pH6.0，50mM)中，声波处理并在4℃下保存。氨基葡聚糖包被的胶乳的终浓度理论上是0.3％(w/v)。2.2.2UV可裂解的二茂铁分子的连接反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。2.2.2.1引入交联剂(马来酰亚胺基丁脱基氧基-琥珀酰亚胺酯)将氨基葡聚糖-胶乳悬浮液(1ml，根据2.2.1节制备)离心(15,500rpm，15℃)20分钟。弃去上清液，沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于900μl的PBS(pH7.0)中。将含5mgGMBS交联剂的100μlDMF溶液加入到该胶乳中并且将悬浮液在室温下搅拌(立式圆筒形混合仪)保温45分钟。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于1mlPBS(pH7.0)中。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。将沉淀物重新悬浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后，加入(搅拌)175μl的DMF，之后加入500μl的脱保护的UV可裂解的二茂铁分子(UV可裂解的二茂铁分子9的脱保护根据后文2.2.2.2节的表述进行)的溶液。在声处理之后在室温下将该胶乳搅拌(立式圆筒形混合仪)保温过夜。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮。在室温下搅拌30分钟以后，离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。然后，将沉淀物重新悬浮于含20％DMF的PBS溶液中，经声波处理。在室温下搅拌20分钟以后，离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。该洗涤步骤再重复1次。然后，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，声波处理并且离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。最终将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，进行声处理并在4℃下在暗处保存。2.2.2.2UV可裂解的二茂铁分子9的脱保护将UV可裂解的二茂铁分子9(3mg，4.68*10-6摩尔)溶解在500μl的甲醇中。加入400μl的PBS、40μl的EDTA(0.1M)和最终80μl的羟基胺.HCl(1M)。将该混合物在室温下搅拌30分钟。然后加入二氯甲烷(4ml)。将该混合物倒入一个分液漏斗，收集有机相并在减压条件下除去溶剂。然后将该脱保护的UV可裂解的二茂铁分子溶解于200μl的DMF中。然后加入300μl的PBS(pH7.0)(如果溶液变浑浊可以再加入几滴的DMF)，该溶液可以直接使用。2.3把UV可裂解的二茂铁分子和3299抗体都偶联于胶乳上反应在黑暗中进行以避免与UV的任何接触。2.3.1先偶联3299抗体再偶联UV可裂解的二茂铁分子[3299指的是用于检测孕激素hCG(人绒毛膜促性腺激素)的抗-αhCG的克隆数]将氨基葡聚糖-胶乳悬浮液(1ml，根据2.2.1节制备)离心(15,500rpm，15℃)20分钟。弃去上清液，沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于900μl的PBS(pH7.0)中。将5mgGMBS交联剂的100μlDMF溶液加入到该胶乳中并且在室温下将该悬浮液搅拌(立式圆筒形混合仪)保温45分钟。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS(pH7.0)中并进行声处理。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。然后将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于858μl的PBS(pH7.0)中。然后加入142μl的修饰的3299抗体(按照后文2.3.3节的叙述制备)且在室温下将该胶乳搅拌(立式圆筒形混合仪)保温1小时30分。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS(pH7.0)中并进行声处理。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液并将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后加入(搅拌)175μl的DMF，接着加入500μl的脱保护的UV可裂解的二茂铁分子的溶液(根据2.2.2.2节的叙述进行UV可裂解的二茂铁分子的脱保护)。在声处理后将该悬浮液室温下搅拌(立式圆筒形混合仪)保温过夜。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，重新悬浮(声处理)沉淀物。在室温下搅拌30分钟以后，离心(15,500rpm，15℃)该悬浮液20分钟。弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。然后，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于含20％DMF的PBS溶液中。在室温下搅拌30分钟以后，离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。该洗涤步骤再重复1次。然后，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，用声波处理并且离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。最终将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，进行声处理并在4℃黑暗保存。2.3.2先偶联UV可裂解的二茂铁分子再偶联3299抗体将1ml的氨基葡聚糖-胶乳悬浮液(根据2.2.1节制备)离心(15,500rpm，15℃，20分钟)。弃去上清液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于900μl的PBS(pH7.0)中。将5mg的GMBS交联剂的100μlDMF溶液加入到该胶乳中并且在室温下将该悬浮液搅拌(立式圆筒形混合仪)保温45分钟。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS(pH7.0)中并进行声处理。离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，然后将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于325μl的PBS(pH7.0)中。然后加入(搅拌)175μl的DMF，之后加入500μl的脱保护的UV可裂解的二茂铁连接体(基于9计为4.68*10-6摩尔)(UV可裂解的二茂铁9的脱保护根据2.2.2.2节的叙述完成)的溶液。在声处理后，将该胶乳在室温下搅拌5分钟。然后加入44μl的巯基-dPEG4-酸(3.54*10-2摩尔/l)溶液并在室温下搅拌(翻转混合仪(endovermixer))保温该悬浮液过夜。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，加入1ml的含35％DMF的PBS溶液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮。在室温下搅拌30分钟以后，离心(15,500rpm，15℃)该悬浮液20分钟。弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。然后，将沉淀物重新悬浮于含20％DMF的PBS溶液中并进行声处理。在室温下搅拌30分钟以后，离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液。该洗涤步骤再重复1次。然后，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，声波处理并且离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮(声处理)于500μl的MES(50mM，pH6.0)中。向该悬浮液中加入含5mgEDCI的150μlMES溶液和含2mgNHS的150μlMES溶液同时进行搅拌。室温下搅拌(立式圆筒形混合仪)5分钟后，然后加入含2mg氨基葡聚糖的200μlMES溶液。该胶乳在室温下搅拌保温过夜。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于1ml的MES中。离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液并且将沉淀物重新悬浮(声处理)于900μl的PBS(pH7.0)中。然后，将含5mgGMBS的100μlDMF溶液加入到该悬浮液中，然后在室温下搅拌45分钟。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于1ml的PBS(pH7.0)中。离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮(声波处理)于750μl的PBS(pH7.0)中。接着，将250μl的修饰的3299抗体(根据2.3.3节的叙述制备)加入到悬浮液中并且在室温下搅拌(翻转混合仪)保温该胶乳过夜。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中并进行声处理。然后离心(15,500rpm，15℃，20分钟)该悬浮液并弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。最后，将沉淀物重新悬浮(声处理)于1ml的PBS中。2.3.33299抗体的制备把1ml的32994抗体(3.41mg/ml)上样到一个用30mlPBS平衡的Nap10柱上。然后在柱子上加入1.5mlPBS并收集。蛋白质浓度用UV分光光度计在280nm下测量向100μl的抗体溶液加入900μlPBS。该1∶10的稀释液给出的吸光度是0.297→C＝0.297*10(稀释度)/1.4＝2.12mg/ml。向1.4ml的3299溶液(2.97mg，1.98*10-8摩尔)中加入15μl的含8mg/ml的SAMSA的DMF溶液。在室温下搅拌该混合物过夜。向400μl的3299/SAMSA溶液中加入35μl的EDTA(0.1M)和65μl的羟基胺.HCl(1M)。在室温下搅拌该混合物10分钟，然后将其上样到15mlPBS平衡的Nap5柱子。然后将1ml的PBS加入到该柱子并收集。脱保护的抗体不能储存，需要立即使用。2.4捕获相2.4.1F108-PMPI的合成向溶于10ml无水苯中的F108(1.13g，7.80*10-5摩尔)溶液中加入PMPI(50mg，2.34*10-4摩尔)。在室温下搅拌该溶液过夜。然后把该溶液倒入600ml的乙醚中同时搅拌。通过过滤收集沉淀并真空干燥。然后，将该固体溶解于8ml的无水苯中，并且用乙醚再沉淀2次。然后，将该产物在高真空下干燥并在4℃下氮气中保存。2.4.2将3468抗体偶联到胶乳——理论上胶乳浓度为1％固体(3468抗体指一种抗-βhCG)。向100μl的基于聚苯乙烯的20μm颗粒(10％的固体)中加入900μl去离子水(胶乳浓度现在为1％固体)。然后，离心(13,500rpm，15℃)该悬浮液10分钟。弃去上清液并且将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮于1ml去离子水中。这个洗涤步骤再重复两次。然后将沉淀物重新悬浮于500μl去离子水中。加入F108-PMPI(5mg于500μl去离子水中)并且在室温下搅拌(立式圆筒形混合仪)该悬浮液45分钟。然后，离心(13,500rpm，15℃，10分钟)该悬浮液。弃去上清液并且将沉淀物重新悬浮于1ml的去离子水中。离心(13,500rpm，15℃，10分钟)该悬浮液。弃去上清液并且将沉淀物重新悬浮于500μl的PBS(pH7.0)中。然后加入500μl的修饰的3468抗体(根据下文2.4.3节的叙述制备)并且将该胶乳在室温下搅拌保温过夜。然后，离心(13,500rpm，15℃，10分钟)该悬浮液。弃去上清液，将沉淀物用台式旋涡仪和超声波浴器重新悬浮在1ml的PBS中。离心(13,500rpm，15℃，10分钟)该悬浮液。弃去上清液。该洗涤步骤再重复2次。最后，将沉淀物重新悬浮于1ml的PBS中，4℃下保存。2.4.3制备修饰的3468抗体把1ml的3468抗体(2.1mg/ml)上样到一个用30mlPBS(pH7.0)平衡的Nap10柱上。然后在柱子上加入1.5mlPBS(pH7.0)并收集。蛋白质浓度用UV分光光度计在280nm下测量向100μl的抗体溶液中加入900μlPBS(pH7.0)。该1∶10的稀释液给出的吸光度是0.221→C＝0.221*10(稀释度)/1.4＝1.578mg/ml。向1.4ml的3468溶液(2.21mg，1.47*10-8摩尔)中加入12μl的含8mg/ml的SAMSA的DMF溶液。混合物在室温下搅拌过夜。向900μl的3468/SAMSA溶液中加入35μl的EDTA(0.1M)和65μl的羟基胺.HCl(1M)。该混合物在室温下搅拌10分钟，然后上样到30ml的PBS平衡的Nap10柱子上。然后，将1.5ml的PBS加入该柱子上并收集。脱保护的抗体不能储存，需要立即使用。2.5光分解2.5.1溶液中的UV可裂解的二茂铁分子的光分解向溶解于250μl甲醇的UV可裂解的二茂铁9(0.7mg，1.09*10-6摩尔)溶液中加入250μl的PBS。将30μl的该溶液用B100A型UV以365nm波长和10”处8,900μW/cm2的强度下照射。该UV在距离溶液大约为15cm的位置施加。裂解后每两分钟进行一次TLC。应用的洗脱液乙酸乙酯/己烷(80/20)和DCM/MeOH/Et3N(85/10/5)。2.5.2UV可裂解的二茂铁分子从胶乳颗粒上的光裂解用B100A型UV灯以365nm波长和10”处8,900μW/cm2的强度下对不同浓度的珠子进行5分钟的照射。该UV在距离溶液大约为15cm的位置施加。珠子浓度a)50μl的珠子(理论上0.3％的固体)+10μl的PBSb)25μl的珠子(理论上0.3％的固体)+25μl的PBSc)10μl的珠子(理论上0.3％的固体)+40μl的PBS循环伏安法在每个溶液的照射前和照射后通过将17μl的该溶液施加到丝网印刷电极(碳工作电极和对电极以及银/氯化银参比电极)上实施。2.6第3.3节的方法把17μL用UV可裂解的二茂铁化合物敏化的400nm(％固体物)TRL颗粒加到丝网印刷电极上(碳工作电极和对电极以及银/氯化银参比电极)。溶液覆盖工作电极、对电极和参比电极。一旦将上述溶液施加到电极上就开始计时电流法测量并在大约50秒钟后开启UV光源(绿色LED，360nm波长)。LED的输入电压是20mV且该LED正好位于电极的上方。这个方法在几种不同浓度的400nm的珠子上重复，所用的浓度为每ml6.8E+09、2.74E+09、1.37E+09、6.85E+08、3.43E+08、1.71E+08、8.56E+07、4.28E+07个。一个UV可裂解的二茂铁分子的标定曲线通过对已知浓度的UV可裂解的二茂铁化合物(预先合成的)实施与上述相同的测量获得。这里使用的浓度是100、50、25、12.5、6.25和3.125μM。计时电流法测量参数如下。第一条件电位(firstconditioningpotential)＝0V平衡时间＝4秒间隔时间＝1秒电位阶跃数＝10.42V电位300秒持续时间2.7第3.4节的方法一个薄层室/毛细管填充装置以如下方式构建。将双面胶带(编号7840，adhesiveresearch)置于丝网印刷电极(碳工作电极和对电极以及银/氯化银参比电极)上，在这之上放上一个玻璃条状盖形成一个90μm毛细缝隙。将6μL的样品溶液(400nm珠子，PBS)施加到该毛细填充装置上并进行计时电流法测量(与实验1的步骤相同)。变化LED的输入电压(22和38mV)。2.8第3.8节的方法将50μL(％固体)的3468(抗hCG)/UV可裂解的二茂铁分子敏化的400nm珠子与50μLhCG标准品(0或400mIU)和75μL(％固体)的用3299(抗hCG)抗体敏化的20μm珠子混合30分钟(用平板振荡器搅拌)。以下面的方式构建一个包含免疫过滤器3(IMF3)装置的微流体装置。将双面胶带(编号7840，adhesiveresearch)置于IMF3装置的过滤区域和毛细通道的上面和周围。将丝网印刷电极(聚酯基质、碳工作电极、参比电极和对电极)放置于胶带上形成微流体装置。将20μL的保温的样品溶液施用到该微流体装置上并通过一个凝胶吸收皿(gelblotsink)抽吸流过装置，该凝胶吸收皿施用在实际的免疫过滤器的末端。然后将10μL的PBS洗液抽过该装置并且最后加入2.5μL的“再悬浮”PBS。进行计时电流法测量，电化学条件如前面所述。LED输入电压是22mV。权利要求1.一种测定流体样品中分析物存在或含量的方法，其包含(a)将一种流体样品与一种包含多个可裂解物质分子的结合试剂接触并且其中所述物质当被裂解的时候能够用电化学的方法测出；(b)将形成的所有的结合试剂-分析物复合体与未结合的结合试剂分离；(c)从固定化的结合试剂-分析物复合体上裂解该可裂解物质；和(d)用电化学的方法检测该裂解的物质。2.根据权利要求1的方法，其中所述结合试剂-分析物复合体通过把结合试剂-分析物复合体固定在捕获相中与未结合的结合试剂分离。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述结合试剂包含至少106个可裂解物质分子。4.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述可裂解物质是可光裂解的或者是可酸裂解的。5.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述可裂解物质当从结合试剂上裂解下来的时候显示电化学的活性。6.根据权利要求1至4的任一项的方法，其中所述可裂解物质在从结合试剂上裂解下来后可以变成电化学活性的物质。7.根据权利要求1至4的任一项的方法，其中所述可裂解物质在从结合试剂上裂解下来后产生变得有电化学活性的其它物质。8.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述可裂解物质当连接于结合试剂的时候没有电化学活性。9.根据上述权利要求的任一项的方法试剂，其中所述可裂解物质包括由二茂铁、硝基苯酚、氨基苯酚、氢醌、水杨酸或磺基水杨酸衍生的部分。10.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述可裂解物质包括由二茂铁乙醛衍生的部分。11.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述可裂解物质包括由乙二醇衍生的一个或多个部分。12.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述结合试剂包含一个中央核心。13.根据权利要求12的方法，其中所述中央核心是一个聚合物球。14.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述结合试剂包含至少一个树枝状部分或聚合物部分。15.根据权利要求14的方法，其中所述可裂解物质连接于树枝状部分或聚合物部分。16.根据权利要求15的方法，其中所述树枝状部分或聚合物部分连接于中央核心上。17.根据权利要求14至16的任一项的方法，其中所述树枝状部分或聚合物部分在可裂解物质的外表面上。18.根据权利要求14至17的任一项的方法，其中所述聚合物部分由葡聚糖衍生而来。19.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述电化学方法包含一个电极。20.一种适用于免疫分析的结合试剂，所述结合试剂如权利要求1至18的任何一项所限定。21.一种结合试剂在免疫分析中的用途，所述结合试剂如权利要求1至18的任何一项所限定。22.一种用于测量样品中分析物的含量或存在的检测试剂盒，包含(a)一种如权利要求1至18的任何一项中所限定的结合试剂；(b)一个捕获相，其包含一个含有一种试剂的载体，所述试剂能够结合或连接结合试剂-分析物复合体；和(c)一个能够在可裂解物质被裂解时检测该可裂解物质的电极，以提供待测分析物存在或含量的指示。全文摘要一种测定流体样品中分析物存在或含量的方法，其包含(a)将一种流体样品与一种包含多个可裂解物质分子的结合试剂接触并且其中所述可裂解物质裂解时能够用电化学的方法测出；(b)把形成的所有的结合试剂-分析物复合体与未结合的结合试剂分离；(c)由固定化的结合试剂-分析物复合体中裂解出可裂解物质；和(d)用电化学的方法检测裂解的片断。文档编号G01N33/543GK101184996SQ200680019004公开日2008年5月21日申请日期2006年3月31日优先权日2005年3月31日发明者D·E·威廉斯,P·洛,C·J·斯莱文,A-C·郝维,S·J·卡莱尔,A·汤姆森申请人:因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司