专利名称：：糖尿病血管并发症诊断标记的制作方法
技术领域：
：本发明发现结缔组织生长因子(CTGF)是指征血管疾病的发生与恶化的风险增加的诊断标记。
背景技术：
：糖尿病与主要来自心血管并发症的发病率和死亡率上升相关。血管病变的恶化因糖尿病情而加快，且共存的高血压会大大增加这一风险(Christliebetal(1981)Diabetes30(Suppl2):90-96;Krolewskietal(1988)NEnglJMed318:140-145.)。糖尿病和高血压共存并加速血管损伤的机制，至今尚未明确。这两种病况都涉及内皮功能障碍、炎症细胞累积、血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移、以及血管壁中的细胞外基质沉积(参见Ross(1993)Nature362:801-809;ClowesandKamovsky(1977)Nature265:625-626;Clowesetal(1983)LabInvest49:327-333;及JacksonandSchwartz(1992)Hypertension20:713-736,)。在糖尿病和非糖尿患者个体中，微量和大量白蛋白尿的发生会增加发生大血管疾病的风险。在I型糖尿病患者中，有蛋白尿的比无蛋白尿的，患大血管疾病的风险增加了10倍。最近，在I型糖尿病患者的DCCT/EDIC人群中揭示了微量白蛋白尿与血管疾病并发症(例如颈动脉内中膜厚度)的关系(TheDiabetesControlandComplicationsTrial/EpidemiologyofDiabetesandComplicationsResearchGroup(2003)NEnglJMed348:2294-2303)。糖尿病肾病与血压升高和血脂异常有关，这些症状通常在糖尿病患者血管疾病恶化前出现，并通常会加速血管疾病的恶化(Perkinsetal(2003)NEnglJMed348:2285-2293)。CTGF最初被鉴定为人脐静脉内皮细胞的产物，它对成纤维细胞有趋化和促有丝分裂的作用(参见例如，Bradhametal(1991)JCellBiol114:1285-1294和US5，408,040)。CTGF属于CCN基因家族，而CCN是因该家族的原型成员￡TGF、^yr61禾nNov而得名(Bork(1993)FEBSLett327:125-130)。CTGF样因子的分子量介于35-40kDa之间，这些分子的结构由四个模块组成N-末端IFGBP样结构域、VonWillebrand因子C型重复结构域、I型凝血酶敏感蛋白重复结构域、禾卩C-末端二聚化结构域(Bork(1993)FEBSLett327:125-130)。CTGF的特征在于构成其总氨基酸含量的11%以上的38个保守的半胱氨酸残基。该分泌性蛋白的4个外显子编码的半胱氨酸内部配对，形成由一种短而柔性的、蛋白酶敏感的32个氨基酸的肽相联的氨基和羧基末端结构域(Bork(1993)FEBSLett327:125-130)。在这个所谓"铰链"的区域内，CTGF容易被切割形成CTGF的氨基末端片段(CTGFN-片段；参见WO00/035936)，所述片段是CTGF在血液和尿液中存在的主要形式。由于CTGFN片段血浆水平的变化可预测CTGF激活和产生的程度，本研究，是为确定是否血液循环中CTGF及CTGFN片段的水平标志着I型糖尿病患者发生血管疾病和肾脏疾病的风险有所增加。因此，本发明提供了指示血管疾病发生和恶化的风险有所增加的诊断标记。图1通过高血压状态显示了CTGFN片段的对数(log)累积分布。发明概述本发明提供了一种用于诊断患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中发生与糖尿病相关的血管并发症的风险的方法，该方法包括从所述对象获取生物学样品，测量该生物学样品中的CTGF或CTGF片段的水平，以及将该生物学样品中的CTGF或CTGF片段的水平与CTGF或CTGF片段的标准水平相比较，当所述生物学样品中CTGF或CTGF片段的水平升高时，指示有发生与糖尿病相关的血管并发症的风险。典型地，所述患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象是人。在一些实施方式中，所述血管并发症是大血管并发症或微血管并发症。特别地，所述血管并发症可以是心血管并发症或脑血管并发症、或外周血管并发症。在一些实施方式中，所述血管并发症是颈动脉内膜中层厚度。典型地，利用WO03/024308中描述的分析方法，所述生物学样品中的CTGF片段或CTGF的水平是可探测和可量化的。在一些实施方式中，所述生物学样品是来自体液的样品。特别地，所述生物学样品是尿液或血浆。在优选的实施方式中，所述对象患有I型糖尿病。该对象也可具有增高的血压或微量白蛋白尿。发明详述应该理解，本发明不限于本文所描述的特定方法学、方案、细胞系、分析方法和试剂，因为它们可以改变。也应理解本文所用术语意在描述本发明的特定实施方式，而绝非为了限制权利要求书所示的本发明范围。必须注意，除非上下文清楚地指出，否则本文和权利要求书中所用的单数形式"一种(a，和"所述"包括复数形式。因此，例如"一种片段"包括众多这类片段，一种"抗体"指一或多个抗体及本领域技术人员己知的该抗体的等价物，等等。除非另有说明，本文所用所有技术和科学术语具有发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管类似或等价于本文描述的方法和材料的任何方法和材料均可在实施和测试本发明中使用，但是现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文引用的所有出版物以其全文引入本文作参考，其目的是描述和公开在这些出版物中所报道的可用于本发明的方法学、药剂和工具。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明不先于现有技术的公开。除非特别指明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的本领域内的常规方法。这些技术在文献中有充分解释。参见例如Gennaro,A.R.，ed.(1990)Remington'sPharmaceuticalSciences,l她ed"MackPublishingCo.;Colowick,S.etal.，eds.,MethodsInEnzymology,AcademicPress,Inc.;HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds"1986,BlackwellScientificPublications);Maniatis，T.etal.，eds.(1989)MoecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,Vols.I-III,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel，F.M.etal.,eds.(1999)ShortProtocolsinMolecularBiology,4thedition,JohnWiley&Sons;Reametal.，eds.(1998)MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse,AcademicPress);PCR(IntroductiontoBiotechniquesSeries),2nded.(Newton&Grahameds,,1997，SpringerVerlag)。本发明发现CTGF是指征血管疾病的发生和恶化的风险增加的诊断标记。一方面，本发明提供了一种用于诊断在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中发生与糖尿病相关的血管并发症的风险的方法，该方法包括从所述对象获取生物学样品，测量该生物学样品中的CTGF或CTGF片段的水平，以及将该生物学样品中的CTGF或CTGF片段的水平与CTGF或CTGF片段的标准水平相比较，当所述生物学样品中CTGF或CTGF片段的水平升高时，指示有发生与糖尿病相关的血管并发症的风险。在本发明的优选实施方式中，患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象是人。对象.是否患有糖尿病或具有患糖尿病的风险，可以通过本领域技术人员接受和使用的任何方法测定。例如，血糖水平为约200mg/dL以上(例如通过空腹血糖测试、口服葡萄糖耐量测试、或随机血糖测试测定)的对象，便可说是患有糖尿病的对象。因此，在某种意义上，具有约200mg/dL以上血糖水平的人是适于用本发明所提供药物或方法进行治疗的对象。可通过评估一或多个已知与发生糖尿病的风险增加相关的因素鉴定具有患糖尿病的风险的对象(例如具有患糖尿病的风险的人)，这些因素包括糖尿病家族史、某些人种或种群、妊娠糖尿病史、肥胖(尤其是高水平的内脏或腹部脂肪)、静坐式生活方式、年龄、高血压、精神分裂症等，以及葡萄糖代谢异常(包括葡萄糖耐量降低(IGT)或糖尿病前期)。在某些实施方式中，所述血管并发症是大血管并发症；在其它实施方式中，是微血管并发症。在各实施方式中，所述并发症选自心脏病、肾病、神经病以及视网膜病。在一个实施方式中，所述并发症是心血管并发症或脑血管并发症。在另一实施方式中，所述并发症是外周血管并发症。在本发明的方法的优选实施方式中，生物学样品中CTGF片段或CTGF的水平的测量包括利用WO03/024308(该文献全文引入本文作为参考)中所描述的任一分析方法检测和量化CTGF或CTGF片段的水平(参见例如WO03/024308中的实施例5)。优选地，所述生物学样品来自体液、分泌物、组织或细胞，其中包括但不限于唾液、血液、尿液、血清、血浆、玻璃体等。结缔组织生长因子(CTGF)作为可指示糖尿患者血管并发症的发生的风险增加的诊断标记，其关联性和重要性在一个横向研究中得以揭示。研究了来自糖尿病控制和并发症试验/糖尿病干预和并发症的流行病学(DCCT/EDIC)研究组的1050位I型糖尿患者的循环(即血浆中)及尿CTGF水平和CTGFN片段水平。发现有高血压糖尿病的对象相对于血压正常的对象，其血浆CTGFN片段的对数值明显更高(3±0.04ng/mlvs.3.21±0.03ng/ml，P=0.0005)。回归分析确定CTGFN片段水平作为连续变量，与心脏收縮压明显正相关(PO.OOOl)。单变量和多变量回归分析表明CTGFN片段水平与白蛋白排泄率(AER)的对数独立正相关(pO.OOOl)。在分类分析(categoricalanalysis)中，大量白蛋白尿的患者比微量白蛋白尿或正常白蛋白尿糖尿病患者有显著较高的CTGFN片段水平(p0.0001)。单变量和多变量回归分析表明CTGFN片段的对数与颈总动脉内膜中层厚度(IMT)有独立显著相关，IMT为大血管疾病的替代标记(p0.0428)。最后，血浆CTGFN片段水平升高的大量白蛋白尿患者相对于血浆CTGFN片段水平正常并的正常白蛋白尿患者，颈动脉IMT增加的相对危险度(RR)更高(RR=4,76;95%置信区间2.21-10.25，P<0.0001)。本研究结果证实，在I型糖尿病对象中，CTGFN片段水平的升高与血压的升高相关、与AER独立相关并且在大量白蛋白尿患者中无条件地升高、与颈动脉IMT独立相关、与IMT增加正相关。因此，血浆CTGF水平是具有患糖尿病血管疾病风险的标记。本研究结果表明血浆CTGF水平与低密度脂蛋白(LDL)之间显著正相关，证实LDL可调节糖尿病患者的CTGF水平。此外，先前的报告已显示LDL可以诱导CTGF在人大动脉内皮细胞和系膜细胞中的表达(Sohnetal(2005)KidneyInt67:1286-1296)。在系膜细胞中，LDL通过TGF-卩的自分泌激活及通过c-Jun氨基末端激酶激活诱导CTGF(Sohnetal(2005)KidneyInt67:1286-1296)，这表明在糖尿病中CTGF提供了以脂蛋白促进血管硬化的途径。微量白蛋白尿是I型糖尿病患者中糖尿病肾病的一个标志，指示存在进行性肾功能衰竭和肾脏疾病的高风险。微量白蛋白尿已被指与在糖尿病和非糖尿病对象中都增加的心血管病死亡率相关，也与广泛的肾小球内皮功能障碍相关(Stehouweretal(1992)Lancet340:319-323)。鉴定有助于发生微量白蛋白尿的生物标记后，可有助于了解糖尿病血管损伤的机制。如本申请所示，大量白蛋白尿患者相对于微量白蛋白尿或正常白蛋白排泄率的患者，其血浆和尿液中CTGFN片段水平高两倍。这些结果表明CTGF是进行性肾病的标记。单变量和多变量回归分析揭示CTGFN片段与AER之间独立正相关。这些研究结果与以前文献中以较小样品容量的I型糖尿病患者研究后证实CTGFN片段与AER相关的结论是一致的(参见例如WO03/024308)。本申请实施例第一次为CTGFN片段与收缩压和舒张压的升高相关提供证据。这些数据证实在曾有高血压纪录的糖尿病对象中，不管他们目前的血压如何或目前有没有使用抗高血压药物，都比血压正常的糖尿病对象有显著更高水平的血浆CTGFN片段。这一发现非常重要，因为高血压会加剧糖尿病中进行性肾损伤和心血管疾病的风险。以ACE-抑制剂(ACEI)控制血压的介入性研究显示ACEI能显著减缓糖尿病肾损伤的发展(Lweisetal(1993)NEnglJMed329:1456-1462)。ACEI治疗的成效，可归因于血管紧张素I转换为血管紧张素II的减少，或缓激肽降解的减少(Gaineretal(1998)NEnglJMed339:1285-1292)。已证实，接受ACEI治疗的糖尿病患者中CTGFN片段的血浆水平显著增加。这种因ACEI治疗而增加的血浆CTGF水平可归因于缓激肽水平增强，而非血管紧张素II生成的减少。在这个方面，本研究证实(数据未显示)缓激肽诱导人主动脉内皮细胞及血管平滑肌细胞中CTGF的表达，而这种调节是经由TGF-p的自分泌激活介导的。本发明进一步证实血浆CTGFN片段水平与颈动脉及内部内膜中层厚度独立正相关，而颈动脉及内部内膜中层厚度是公认的I型糖尿病患者具有冠心病以及脑血管疾病的标记(TheDiabetesControlandComplicationsTrial/EpidemiologyofDiabetesandComplicationsResearchGroup(2003)NEnglJMed348:2294-2303)。鉴于高血糖和高血脂与内膜中层厚度的相关，以及LDL和高血糖对CTGF调节的影响，CTGF可能是一个机制途径，通过这一途径，脂蛋白和高血糖介导其在糖尿病患者中促进血管损伤的有害影响。总之，本研究中的发现证实血浆CTGFN片段水平是I型糖尿病患者具有患血管疾病的风险的独立标记；并证实CTGF可用作诊断标记，指征血管疾病发生和恶化的风险升高。实施例本发明参照以下实施例进一步理解，这些实施例仅仅是本发明的示例。这些实施方案仅仅是为了举例说明本发明请求保护的内容。本发明的范围不限于仅用作举例说明本发明的某些方面的示例性实施方式。任何功能等价的方法均落入本发明的范围内。参照上述描述和附图，针对本发明的描述所做的各种修饰对于本领域技术人员将会是显而易见的。这些修饰也落入权利要求书保护的范围。实施例l:研究方法本研究采用下列方法舰荐沐研究群体是北美DCCT/EDIC硏究组，由最初1441位DCCT对象中的1325位I型糖尿病患者组成。最初的DCCT(DiabetesControlandComplicationsTrial,糖尿病控制并发症试验)研究组由年龄介于13-40岁的男性和女性组成，他们在1983-1989年间加入研究，加入研究时有1-15年禾唐尿病史(TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup(1993)NEnglJMed329:977-986)。将一半患者群体随机分派进行常规糖尿病治疗，另外一半分派进行强化糖尿病治疗。1993年，在平均随诊期6.5年，强化治疗清楚表明可以减少视网膜病变、肾病和神经病的风险之后，j亭止DCCT石JF究(TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup(1993)NEnglJMed329:977-986)。接着，所述患者应邀参加一个名为EDIC的多中心纵向观测研究，以观测研究大血管并发症的发生和微血管并发症的进一步恶化(EDICResearchGroup(1999)DiabetesCare22:99-111)。以1994年为EDIC基准年份，DCCT/EDIC研究组的平均年龄是35岁(范围是19-50岁)。该研究组的54%为男性，平均有12±5年的糖尿病史。从所述对象采集的空腹血浆样品由各参与EDIC的诊所直接运送到南卡罗莱纳医科大学(MUSC)进行CTGF测量。MUSC的伦理审查委员会及所有参加DCCT/EDIC的诊所都批准了本研究，并且已从每一个参与的患者取得书面知情同意。在参加DCCT大约一周年时，每个EDIC研究对象接受一个标准化的年度病史和体格检查，内容包括详细的总体健康评价、糖尿病管理、糖尿病并发症的发生、新的疾病的发生、以及药品的使用。年度检查还包括HbAlc、静息心电图及手臂血压的测量。血压及HbAlc测量在采集血液样品的同时进行。患者采取坐姿以水银柱血压计测量右臂血压。每隔一年进行肾功能评估，包括测量尿白蛋白排泄率，样品以标准化的4小时方法收集(参见TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup(1993)NEnglJMed329:977-986.)。DCCT以AER为40-299mg/24h定义微量白蛋白尿，以AER^300mg/24h定义大量白蛋白尿。正常白蛋白排泄的定义为AERS40mg/24h。约98%的AER测量在采集血液样品的一年内完成。.超声艘鄉像藩如先前所述(EpidemiologyofDiabetesInterventionsandComplications(EDIC).ResearchGroup(1999)Diabetes48:383-390)，作为EDIC基准检査的一部分，在1994年6月至1995年4月期间(测量CTGF之前2年)，在1325位患者(最初的DCCT研究组的92%)中进行颈动脉超声检查。采用先前所述的ELISA分析测量血浆和尿液中CTGF(参见例如WO03/024308的整个说明书，该文献的全部内容在此以其整体引入本文作为参考)(参见Gilbertetal(2003)DiabetesCare26:2632-2636.)。简单地说，以成对的CTGF特异性单克隆抗体构建两个不同的ELISA以捕获并检测整个CTGF(W分析)和捕获并检测N末端CTGF片段+整个CTGF(N+W分析)。在所述分析中，以用于捕获CTGF的CTGF单克隆抗体(10jug/mL)于4°C包被微量滴定板过夜，然后洗涤微量滴定板并用含1%BSA的PBS阻断至少2小时。另一个与用作捕获单抗不同的、直接与碱性磷酸酶缀合的非交叉阻断的抗CTGF单抗用于检测。比色反应底物是对硝基苯酚磷酸盐(PNPP)。滴定板以405nm波长读取(VmaxPlateReader，MolecularDevices,Sunnyvale,CA)。标准曲线于每一套样品用标准rhCTGF重复检测三次后产生。样品以含50吗/ml肝素、0.1%TritonX-100及0,1%BSA的分析缓冲液作1:10稀释，然后分为两份分析；两份之间的CV是在15%以内。对标准曲线进行二次拟合以校准。重组人CTGF加标回收率实验证实患者样品可作定量检测。分析灵敏度(LLOQ)在N+W分析的尿液样品中为0.6ng/ml，在W分析及N+W分析的血清样品中为5ng/ml。用于ELISA中的抗体对CTGF具特异性，不与CCN家族成员cyr61及nov交叉反应。虽然尿液中CTGF含量是用N+W分析进行测量，但是这些分析所测量的尿液中存在的CTGF形式基本上是N-片段。批内CV为5%，批间CV为15%。血浆和尿液中CTGF实测水平作偏态分布，对CTGF实施Box-Cox变换。原CTGF数据经对数变换为正态；因此，本文用变换后的CTGFN片段的对数作分析。此外，AER的对数变换用以提供残差的正态。用t检验来单独分析相对于每个协变量的连续结果。x2检验用于分析相对于每个协变量的离散结果。计算皮尔逊相关系数(Pearson'scorrelationcoefficients)以及Spearman非参数相关(Spearmannonparametriccorrelation),以评估血浆CTGFN片段的对数与血压(BP)、AER及IMT中每一个的相关性。血浆CTGFN片段的对数、AER的对数、颈动脉IMT都用作回归分析中的结果。具体而言，当以血浆CTGFN片段的对数作为结果时，采用ANOVA及ANCOVA确定在肾病亚组之间，血浆和尿液中的血浆CTGFN片段的对数的平均水平的差异。以AER的对数和颈动脉IMT结果，采用单变量分析结果构建多元线性回归分析的初始模型，然后对该模型应用后向模型选择程序(backwardmodelselectionprocedures)消除具有非显著局部试验的变量和/或共线性的变量。在AER的对数和IMT的回归模型中，血浆CTGFN片段的对数均被视为协变量。在颈动脉IMT的模型中，AER的对数被视为协变量。这些回归模型亦已为其它协变量(例如年龄、HbAlc、糖尿病史、性别和DCCT治疗组别)进行了调整。计算多元偏相关系数的平方以估计因独立变量方差的百分比的增加(通过将该变量引入包括所有其它协变量的模型中加以解释)。为进行多元比较，进行Bonferroni调整。所有统计分析用SAS(v.91)统计软件进行。中心趋势的测量值以平均值土标准差(mean士SD)表示，其中统计显著性用双侧检验测定，并假设pS0.05为显著。实施例2:1型糖尿病患者的DCCT/EDIC研究组中的CTGFN片段水平进行CTGF测量的研究群体的临床特征列于表l(DCCT/EDIC硏究组按性别分类的临床特征*)。测量1052位I型糖尿病患者循环系统血浆中的CTGFN片段水平和CTGFN片段尿排泄率。患者研究组中的CTGFN片段的对数与生化参数之间关系列于表2(进行单变量回归分析以预测CTGFN片段水平的对数)。表2中的单变量回归系数可以解释为给定协变量的每单位改变量所导致的CTGFN片段的对数平均值的改变。另一解释是exp(p)大约等于协变量的每单位改变量所导致的CTGFN片段的相对增加。表1参数N男性平均值±标准差N女性平均值±标准差P年龄56239.91±6.7445239.09±7.200.0632体重(Kg)56186.83±14.8445172.52±14.950扁〗BMI(kg/m2)55127.06±3.8643926.34±4.330.0055腰臀比例5500.89±0.064380.77±0.060扁1糖尿病史(年)56217.15±4.6645217.69±4.890,0743HbAlc(%)5558.23±1.314478.22±1.370.8643DCCT组5621.50±0.504521.47±0.500.2870收缩压(mmHg)551122±13.3439116±13.820扁1舒张压(mniHg)55177.09±9,2743972.60±9.010細1MBP(mmHg)55192.26±9.6143987.08±9.550細1LDL(mg/dl)529118.5±31.19423110.0±29.820扁1总月旦固醇(mg/dl)533189.7±36.24424188.2±33.750.5162甘油三酸酯(mg/dl)53398.02±70.8842477.21±49.330扁1HDL(mg/dl)53351.62±12.8542462.69±14.820扁1LogAER(mg/24h)5532.77±1.464462.48±1.260观1颈总动脉IMT(mm)5200.6015±0.09004150.5620±0.07610細1颈内动脉IMI(mm)5110.6740±0.24334010.6148±0.腕0扁2高血压°/。5540.44±0.494420.26±0.440細1ACE抑制剂Q/。5620.14±0.354420.10±0.300.0325H十算组间差异时，连续变量用t检验，分类变量用f检验。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>单变量分析表明血浆CTGFN片段水平的对数与年龄、糖尿病史、DCCT密集组、收縮压、AER的对数、LDL、总胆固醇、颈内动脉IMT、颈总动脉IMT、以及ACE抑制剂的使用呈强正相关。而血浆CTGFN片段的对数与HbAlc、性别、体重、体重指数(BMI)及腰臀比不相关。观察到尿液CTGFN片段的对数与体重、腰臀比、收缩压、舒张压以及性别呈强相关。CTGFN片段的对数排泄率不受年龄、糖尿病史、HbAlc、AER的对数、总胆固醇、低密度脂蛋白及ACE抑制剂的影响。实施例3:血浆CTGFN片段与血压的相关图1中的结果显示非高血压(n=668)和高血压(n=382)患者(所有患者确诊为高血压，收缩压>140，舒张压>90;并应用抗高血压药物治疗)的血浆CTGFN片段的对数的估计累积分布。这些结果证实高血压对象比正常血压的对象往往有较高的血浆CTGFN片段对数值。证实有高血压的患者的血浆CTGFN-片段对数平均值明显高于没有高血压的患者(前者3.36±0.04ng/ml，而后者3.21±0.03ng/ml，P=0.0005)。在高血压患者中测得的实际平均血浆CTGF水平为41.57±3.47ng/ml，而在血压正常的患者中测得的实际平均血浆CTGF水平为32.28±1.81ng/ml，P=0.0109。在CTGFN片段的对数尿排泄率与收縮压、舒张压和平均压之间呈强相关(全部p<0.0001)。这些结果证实在有高血压的I型糖尿病患者中，血浆CTGFN片段水平升高。有些高血压患者正在接受ACE抑制剂(ACEI)治疗，对这一患者组中可能存在的ACEI对血浆和尿液CTGFN片段水平的影响也进行检测。结果证实接受ACEI治疗的患者中的血浆CTGFN片段水平的对数平均值为3.43±0.07ng/ml(n=126);不同的是，没有接受ACEI治疗的患者中的血浆CTGFN片段水平的对数平均值为3.25±0.02ng/ml(n=984)，P=0.0159。另一方面，ACEI治疗没有显著影响CTGFN-片段的对数尿排泄率。接受ACEI治疗的患者中的尿CTGFN片段的对数平均值为2.13±0.07|ig/24h(n=122)，而没有接受ACEI治疗的患者中的尿CTGFN片段的对数平均值为2.08±0.02jig/24h(n=906)，P=0.4344。实施例4:CTGFN片段与白蛋白排泄的关系观懂1052位I型糖尿病患者的血浆及尿CTGF水平，结果以平均值士标准误(mean±SE)表示，列于表3(依白蛋白尿病情而分类的血浆和尿CTGFN片段水平；P值是与基准组(AER<40)比较，并已根据年龄调整)。AER<40mg/24hAER40-299mg/24h(n=896)(n=105)平均值标准差平均值标准差AER>300mg/24h(n=51)平均值标准差血浆(ng/ml)LogCTGFN3.2270.6573.2970.5423.7500.921CTGFN尿液(pg/24h)LogCTGFN34.19155.11632.38627.958(尸=0.5瑪2.0980.7191.9430.82165.79284.8422.2851.083CTGFN10.61110.1429.2487.18918.53430.918数据证实大量白蛋白尿患者(白蛋白排泄率>300mg/dl)的血浆和尿液中的CTGFN片段水平明显高于微量白蛋白尿患者(40-299mg/dl)或正常白蛋白排泄率患者(白蛋白排泄率<40mg/dl)的血浆和尿液中的CTGFN片段水平，这与先前的报道所显示的尿液中的CTGFN片段水平与白蛋白尿的程度的相关性相一致(参见WO03/024308)。血桨CTGFN片段水平在AER2300mg/dl的患者中为65.79±11.89ng/ml，在AER为40-299ng/dl的患者中为32.39±2.73ng/ml，在AER<40mg/dl的正常白蛋白排泄率患者中为34.19±1.84ng/ml(p=0.0005)，这与先前的报道所显示的尿液中的CTGFN片段水平与白蛋白排泄率的相关性相一致(参见WO03/024308)。CTGFN片段的排泄率在AER^300mg/dl的患者中为18.53±4.33吗/24h，在AER为40-299mg/dl的患者中为9.25±0.70吗/24h，在AER<40mg/dl的正常白蛋白排泄率患者中为10.61±0.34吗/24h;P=0.0001。这些研究结果表明CTGF可作为诊断标记，有效地鉴定大量白蛋白尿病发风险增加的患者。表2显示，血浆CTGFN片段的对数与白蛋白排泄率的对数之间呈显著正相关(p=0.001，n=1052)。用多元线性回归分析进一步评估血浆CTGFN片段的对数与AER的对数之间的相关强度。多元回归模型以表2中的数据所用的单变量回归分析为基础，不同的是以AER的对数而非血浆CTGFN片段的对数为结果。可能影响AER的对数的多个变量都被纳入这一模型。通过后向回归分析消除非显著变量和共线性变量，以开发能最佳解释显示风险增加的诊断标记与结果之间的函数关系的模型。表4(logAER的多元线性回归模型)所示结果证实，调整年龄、体重、BMI、糖尿病史、HbAlc、DCCT密集组、收縮压及总胆固醇的影响之后，血浆CTGF的对数与AER的对数呈显著相关(pO.OOOl)。这些结果被诠释为:血浆CTGFN片段的两倍差异可引致AER增加20%。表4_95%置信区间变量效果下上尸截距-4.3388-5.5492-3.18240扁1血浆CTGFN片段的对数0.31830.19590.44070細1年龄-0.0272-0.0393-0.01500細1体重(kg)0扁80細20.01610.0445BMI(kg/m2)-0.0348-0.0645-0.00500.0221腰臀比0.2832-0,81491.38590.6143糖尿病史(年)0.03880.02190.05570細1HbAlc(%)0.24140.17970.30260扁1DCCT密集组0.37920.21790.54050扁1收缩压(mmHg)0.02400.01790.03010扁1总胆固醇(mg/dl)0.00520麓80.00760扁1实施例5:CTGF与颈动脉壁厚度检测CTGF活性与颈总动脉和/或颈内动脉内膜中层厚度(IMT)的关系，以确定血浆CTGFN片段水平的差异是否与大血管疾病相关。单变量分析证实在1050名参加者中，血浆CTGFN片段水平的对数与颈总动脉及颈内动脉IMT之间呈显著相关(都是p<0.0001)(表2)。这些研究结果表明，血浆CTGF水平与颈动脉IMT呈正相关，是大血管疾病的替代标记。构建多元回归模型以评估血浆CTGFN片段的对数与颈总动脉IMT之间的相关强度。以含血浆CTGFN片段的对数、AER的对数、年龄和性别的模型进行后向回归分析(表5，颈总动脉IMT的多元线性回归模型)，结果证实CTGFN片段的对数与颈总动脉IMT独立地显著相关。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>以第75个百分位数为基础，将IMT分为高和低两个类别，并拟合到一个以类别的高低作为结果的logistic回归模型中。logistic模型调整年龄的影响之后，确认CTGF与颈动脉IMT风险的增加相关。结果证实具有高CTGF水平而且AER2300mg/天的对象相对于具有低CTGF水平且AER<40mg/天的对象，颈动脉IMT增加的风险显著增加(相对风险4.76;95%CI，2,21-10.25，P<0.0001)。(参见表6，依据血浆CTGFN片段和AER而定的颈动脉IM1^增加的相对风险)表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>RR=相对风险(95%置信区间)@IMT增加的定义是男女合并的分布的首四分位数**经调整的年龄的估计值如上文所述，本研究基于来自I型糖尿病患者的DCCT/EDIC研究组的数据，并表明糖尿病血管疾病与异常CTGF水平有联系。这些研究结果提供证据表明CTGFN片段水平与大血管疾病(颈总动脉与颈动脉IMT)的替代标记之间呈独立的正相关。此外，本硏究结果证实CTGFN片段水平与高血压和微量白蛋白尿独立相关，而后两者都是指示发生大血管疾病的风险升高的诊断标记。再者，这些横向研究结果证实，在具有高CTGF水平的糖尿病研究对象中，颈动脉IMT的相对风险升高。权利要求1.一种用于诊断在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中发生与糖尿病相关的血管并发症的风险的方法，该方法包括从所述对象获取生物学样品，测量该生物学样品中CTGF或CTGF片段的水平，以及将该生物学样品中CTGF或CTGF片段的水平与CTGF或CTGF片段的标准水平相比较，当所述生物学样品中CTGF或CTGF片段的水平升高时，指示有发生与糖尿病相关的血管并发症的风险。2.权利要求l的方法，其中所述患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象是人。3.权利要求l或权利要求2所述的方法，其中所述血管并发症是大血管并发症或微血管并发症。4.前述任一项权利要求的方法，其中所述血管并发症选自心血管并发症、脑血管并发症和外周血管并发症。5.前述任一项权利要求的方法，其中所述血管并发症是内膜中层厚度增加。6.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物学样品中的CTGF片段或CTGF的水平可使用WO03/024308所述方法进行检测和量化。7.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物学样品来自体液。8.前述任一项权利要求的方法，其中所述生物学样品是尿液或血浆。9.前述任一项权利要求的方法，其中所述对象患有I型糖尿病。10.前述任一项权利要求的方法，其中所述对象血压升高。11.前述任一项权利要求的方法，其中所述对象有微量白蛋白尿。全文摘要本发明发现结缔组织生长因子(CTGF)可作为诊断标记，用于指征血管疾病的发生与恶化的风险的增加。文档编号G01N33/68GK101213456SQ200680024469公开日2008年7月2日申请日期2006年5月5日优先权日2005年5月5日发明者A·A·贾法,W·R·乌辛格申请人:菲布罗根公司