用于血癌分析与临床处理的细胞抗原及靶信号转导蛋白的复合分布的制作方法

专利名称：用于血癌分析与临床处理的细胞抗原及靶信号转导蛋白的复合分布的制作方法
用于血癌分析与临床处理的细胞抗原及靶信号转导蛋白的复合分布
背景技术：
白血病是骨髓和血液中的一种恶性癌症。白血病表现为异常白细胞的过度增生，充满骨 髓和/或外周血。这导致正常血细胞的生长减少和功能减弱。慢性淋巴细胞性白血病(CLL) 是人类罹患的四种主要类型白血病中的一种，其余为急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓 性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
白血病患者经历不同的临床进程。白血病的治疗很复杂并且取决于白血病类型。在白血 病患者中发现缓解期存在大量的临床可变性，哪怕是在那些接受了一个疗程治疗的患者身上 也会发生。有的患者在没有接受确切治疗的情况下能够存活很长时间，而有的患者接受攻击 性治疗后仍然迅速死亡。那些对治疗有抗性的患者只能存活很短时间，不管抗性何时发生。 虽然目前已有各种的分期系统用于对付这种临床多样性，但是它们并不能精确地预测一个早 期或中期的患者是否经历疾病的惰性期还是攻击期。确切的说，因为这些系统考虑了疾病的 总体表现，包括血液水平和骨髓中淋巴细胞计数、淋巴结的大小及分布、脾的大小、贫血度 数以及患者血液中血小板数，它们只能通过当疾病发展到更进一步的状态时采用有限的预测 结果来鉴别病人。
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是美国和欧洲最常见的白血病，2004年美国新诊断的CLL 患者超过1万人，其中大多数患者为40岁以上的男性。CLL表现为小淋巴细胞的克隆性增生， 大部分显明与B-淋巴细胞亚型一致的表面标志物CD5和CD19。在大多数病例中，疾病呈现 一种惰性状态，患者在不接受确切治疗的情况下仍能存活较长时间。此外，性别与CLL相关， 因为患者中男女比例约为2:1。在少数病例中，尽管接受攻击性治疗，但疾病仍呈现迅速发展 的情况频繁发生在年轻患者身上。在大多数情况下，疾病呈现缓慢发展的状态，并且在若干 年内都不会引起患者不舒适或者疼痛的感觉。
CLL表现为大量的癌性成熟淋巴细胞和变大的淋巴结。癌细胞淹没了骨髓和淋巴结中的 正常细胞。患者发生贫血，而且血液中正常白细胞和血小板的数目减少，但是由于异常白细 胞的增殖导致血液总白细胞数增加。抗体的水平和活性也会下降。因此，患者的免疫系统受 损。CLL患者经常死于受损免疫系统带来的后果如感染等，而不是CLL本身。
CLL的临床阶段的特征有Rai分期系统(O-IV期)和Binet分期系统(A-C期)，其仍然 是CLL患者强大的预测者。这两个系统都是基于相关淋巴组织的数量和贫血和/或血小板减
少的表现。总而言之，晚期患者具有明显的不良预后和短期存活。Rai分期中IV期患者或者 Binet分期中C期患者平均存活时间为1.5到2年。
目前，仍没有一个已知的针对B-CLL的治疗，其能明显延长患者的存活期望。因此，只 对归为B-CLL高级阶段的患者考虑进行攻击性治疗，包括化疗、放疗、手术、免疫治疗或移 植。这些治疗措施可能会让患者产生生理和情绪上的严重代价，但是却不能取得必要的好转 结果；在某些病例中，B-CLL患者甚至死于这些治疗的严酷性，而不是死于B-CLL的影响。 B-CLL早期的患者，因为具有较好的生理状态，所以能接受攻击性或者实验性治疗，只要状 态维持稳定，他们通常不接受治疗，原因有两个第一，目前可用的治疗并不能延长存活期； 第二，目前还不能为早期患者是否会好转或者恶化提供可靠的指示。进一步说，疾病不可预 知的进程可以为临床治疗困难的结果提供解释，因为一些早期病人甚至在不接受治疗的情况 下将进入惰性期。
考虑到白血病患者临床进程的多样性以及缓解期的巨大可变性，用于预测个体疾病进程 的可靠的指示体系的需求变得重要，它可以帮助临床工作者鉴定出将进入发展状态的患者， 并让他们能够选择在疾病的更早期接受攻击性或实验性治疗。此外，临床治疗中，可以根据 患者预后情况，针对患者使用新药或者实验性治疗手段，从而发现临床治疗中的更多相关结 果。
本发明满足了这种需求并且带来了相关的优点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种为来自疑有肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分 布的方法。本发明的复合标志物分布可以用于鉴别个体的肿瘤性转化状态相关亚群的预后和 治疗、以及预测个体的疾病进程，本发明的方法为罹患肿瘤性转化状态的个体提供用于选择 治疗方式的工具，包括用于确定危险人群的方法、预测复发风险增加的方法、预测发生继发 性并发症风险增加的方法、为个体选择治疗方案的方法、预测个体对治疗的反应的方法、确 定对个体治疗效果的方法、确定个体的预后的方法。特别地，本发明的方法公开了一种建立 复合标志物分布的方法，其可用作预后指示来预测个体的肿瘤性转化状态的进程是攻击性还 是惰性，从而帮助临床工作者处理病人和评估将要使用的治疗形式。
在特别公开的实施方式中，本发明的目的在于建立用于白血病的复合标志物分布，该白 血病选自由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病 (CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)所构成的组。公开的本方法所建立的复合标志物
分布可以用在罹患白血病的个体临床处理所有方面，包括例如，确定罹患白血病的个体为 白血病危险群体、预测罹患白血病的个体是否有复发的高风险、预测罹患白血病的个体是否 有发生继发性并发症的高风险；这些本方法为罹患白血病的个体确定预后提供帮助、为罹患 白血病的个体选择治疗方案、为接受一项或多项白血病治疗的个体监测疾病状态。


图1为用于显示建立复合标志物分布的样品制备方法的示意图。
图2为由用于一例CLL样品中ZAP-70分析的门控策略方案所获得的流式细胞仪面板。
图3为由用于CLL样品中ZAP-70分析的门控策略所获得的流式细胞仪面板。
图4为描述一例CLL样品中存在的细胞空间中ZAP-70表达情况的示意图。(红色B
细胞；绿色正常T细胞；紫色NK细胞)
图5为描述一例AML样品中mTOR激活S6情况的流式细胞仪面板。 图6为外周血中动员干细胞(CD34+)的复合分布示意图。直方图提供了与未处理样品 (红)相比，在用PMA (蓝)、干细胞因子(绿)、或IGF-1 (橙)激活后每个动员干细胞、
正常粒细胞、正常单核细胞和正常淋巴细胞中三种信号转导蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT
的反应情况比较。
图7为单个AML患者的复合分布示意图。等分血样用PMA刺激，用或者不用特异性信
号转导通路抑制剂(图例见右下角)刺激，或用干细胞因子刺激。反应结果用P-ERK对P-S6
的双边量散点图检测(右侧面板)，红色群表示AML胚细胞，蓝色表示内在淋巴细胞，绿色
表示内在粒细胞。AML胚细胞(红)、淋巴细胞(蓝)和粒细胞(绿)通过使用左边两个框
中描述的CD34侧向散射来鉴定。
图8为CLL中ZAP-70表达的复合分布示意图。绿色CD5阴性B细胞；蓝色CD5+B
细胞；粉色T细胞(CD5+/CD3+);紫色NK细胞(CD5阴性/CD56+)。每一个独立地被
换算成亚型产生次数的柱状图显示出了重叠柱状图。
具体实施例方式
本发明的目的在于提供用于为从疑有肿瘤性转化状态的个体得到的样品建立复合标志物 分布的方法。本发明中的复合标志物分布可用来鉴别个体的肿瘤性转化状态预后和治疗相关 亚群、以及用来预测个体的临床进程。本发明的方法为罹患肿瘤性转化状态的个体提供用于 临床处理的工具，包括用于确定危险人群的方法、预测复发风险增加的方法、预测发生继发 性并发症风险增加的方法、为个体选择治疗方案的方法、确定对个体治疗效果的方法、确定
个体预后的方法。
某种意义上，本发明基于这样一个发现明显的细胞群相关标志物的出现与一种或更多 选出的靶蛋白质相关联，这样就有可能制备一种复合标志物分布，该分布根据不同样品间的 内在细胞群的阳性和阴性比较而表现为一种定量检测。
特别地，本发明的方法公开了一种建立复合标志物分布的方法，该复合标志物分布可作 为一种预后指示物，用来预测个体的肿瘤性转化状态的临床进程是将具有攻击性还是惰性， 从而帮助临床工作人员处理患者并评估将要使用的治疗形式。
在这里公开的实施方式中，本发明的方法目的在于建立用于白血病的复合标志物分布，
该白血病选自由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白 血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)所构成的组。通过公开的方法而建立的复合标 志物分布可以用在罹患白血病的个体临床处理的所有方面，包括比如，确定罹患白血病的 个体为白血病危险群体、预测罹患白血病的个体是否具有复发的高风险、预测罹患白血病的 个体是否具有发生继发性并发症的高风险；这些方法为罹患白血病的个体确定预后提供帮助、 为罹患白血病的个体选择治疗方案、为接受一项或多项白血病治疗的个体监测疾病状态。
通过本发明的方法而建立的复合标志物分布包括将生物样品与一结合分子集发生反应， 其中该结合分子集包括两组或两组以上对明显的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子。 标志物的水平和标志物的结合可以鉴别出样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群，并且 可以用于通过检测鉴别标志物水平和标志物结合情况来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性 转化细胞群的存在，所述结合情况可鉴别样品内部正常细胞群和肿瘤性转化细胞群。最终， 通过将每个正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与靶蛋白的存在相关联，本发明的 方法可以为从疑有肿瘤性转化状态的个体所得到的样品建立复合标志物分布。
本发明的方法建立的复合分布具有预料不到的优点，并且基于生物样品中细胞标志物的 存在，解决了疾病进程预测中遇到的各种困难。如此所说，本发明的靶蛋白可以通过参照样 品中含有的、并且已知对所研究的细胞靶呈阴性和阳性的多种细胞群，来确定所研究的细胞 靶的半定量水平。如本方法所述，所研究的细胞靶的存在和水平分别与样品中的多个阳性细 胞群相关联，所述阳性细胞群为包含样品中的细胞群、以及特征为所研究的细胞靶水平可变 的细胞群。此外，本方法将所研究的细胞靶分子的存在和水平与样品中一种或更多的已知呈 靶蛋白阴性的内在细胞群相关联。因此，本发明的方法不是使用不相关的抗原来提供定量的 内参，而是把多个对所研究的细胞耙呈阳性的内在细胞群联系起来，并可用于根据个体的复 合分布来生成靶向治疗策略。本发明的方法可以用来对样品内具有阴性或阳性细胞群参照的
任何细胞耙进行定量。
在一个具体实施方式
中，本发明提供了一种为从疑有肿瘤性转化状态的个体身上获得的 样品建立复合标志物分布的方法，其包括如下步骤使生物样品与结合分子集进行反应的步 骤，其中所述结合分子集包括两组或两组以上的对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结 合分子，并且其中标志物水平和标志物结合情况可鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化 细胞群；通过检测标志物水平和标志物结合情况来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化 细胞群的存在，其中所述标志物水平和结合可鉴别样品内部正常细胞群和肿瘤性转化细胞群； 以及然后将每个正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与靶蛋白的存在关联起来，从 而建立复合标志物分布。
在一个特别的具体实施方式
中，本发明的方法应用于一种进一步被定义为"血癌"的癌 症，该术语是指造血组织的恶性瘤，包括白血病、淋巴瘤和多种骨髓瘤。白血病包括急性骨 髓性白血病或急性髓细胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓细胞白血病(CML)、 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、胚 芽型骨髓增生异常综合征(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)、和通过形态学、组织学 以及免疫学技术等本领域技术人员所定义的这些白血病的所有亚型。在本发明的一个特别具 体实施方式中，血癌选自由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢 性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)所构成的组。
最初白血病根据预期存活时间分为急性或慢性，但是现在根据细胞成熟度区分。急性白 血病主要由未成熟细胞(通常为胚细胞形式)组成，而慢性白血病含有更多的成熟细胞。急 性白血病表现为未成熟血细胞的快速生长。这种大量未成熟细胞的生长使骨髓不能产生健康 的血细胞。急性白血病进一步分为成淋巴细胞性(ALL)和髓细胞性(AML)类型，其可根 据法-美-英(FAB)分类法或免疫显型法的形态学和细胞化学表现而进一步细分。将特异的T 细胞、B细胞和骨髓性抗原的单克隆抗体与流式细胞术结合起来，对于区分ALL和AML非 常有帮助，这种区分对治疗至关重要。
急性白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。白血病 细胞在骨髓中聚集，取代正常的血液细胞，并且扩散至肝脏、脾脏、淋巴结、中枢神经系统、 肾脏以及性腺。因为这些细胞来自血液，因此它们可以渗透到任何一个器官和部位。ALL通 常浸染中枢神经系统，而急性单核细胞白血病会浸染齿龈，而AML可以包括在任何部位形 成的聚集体(粒细胞肉瘤或绿色瘤)。
慢性白血病分为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)。 CLL包
括涉及淋巴结和其余淋巴组织的外观成熟淋巴细胞的克隆性扩张，与对骨髓的进展性渗透有 关并出现在外周血中。对CLL的传统描述已经成为最常见的亚型，特别是B细胞的形式几乎 在所有病例中可见。在2%到3%的病例中，类型表现为T细胞的克隆性扩张，而且此类型依 然具有亚型，特别是随血球减少的大颗粒淋巴细胞。另外，其他慢性白血病的形式也被归类 到CLL名下前淋巴细胞白血病，皮肤T细胞淋巴瘤的白血病样阶段(Sezary综合症)，毛 细胞白血病，淋巴瘤白血病(恶性淋巴瘤发展阶段的白血病样改变)。这些典型CLL亚型的 分化通常很容易辨别。
在一个具体实施方式
中，本发明提供了一种方法，包括通过使生物样品与结合分子集 反应，从而为来自疑似B细胞慢性淋巴细胞性白血病个体的样本建立复合标志物分布，其中 所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子；接 着通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存 在，其中标志物结合情况可识别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；并且使正常和肿瘤性 转化细胞群的标志物水平与ZAP-70的存在相关联，从而为来自疑似B细胞慢性淋巴细胞性 白血病(B-CLL)个体的样本建立复合标志物分布。
B-CLL的特征表现为CD5+细胞的克隆积累(Caligaris-Cappio， et al， J Exp Med 155: 623-8, 1982)。特异性细胞表面标志物的表达可以区别出人类B细胞的亚型，该亚型在不同分化和 激活阶段是不同的，并且具有生物学特性(Clark and Lane, Ann Rev Immunol 9:97-127,1991 )。 特别地，CD38和IgD表达的分析在辨别B细胞处于从幼稚到成熟细胞的各个分化阶段中尤 其有用(Pascual, et al., J Exp Med 180:329-339， 1994; Zupo, et al.， Blood, 88:1365-1374, 1996)。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种方法，包括通过使生物样品与结合分子
集反应，从而为来自疑似CML个体的样本建立复合标志物分布，其中所述结合分子集含有
两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物水平和标志
物结合情况可识别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；接下来通过检测标志物水平和标志 物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在，其中标志物水平和结合情 况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；并且使正常细胞群和肿瘤性转化细胞群标志 物水平与至少一种靶蛋白的存在关联起来，从而为来自疑似CML个体的样本建立复合标志 物分布。在该实施方式中，该耙蛋白可选自由活化磷酸化信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡 标志物所构成的组。
慢性骨髓性白血病(CML)是一种具有明显不同于其他种类白血病的临床和病理特征的 白血病。普遍认为CML的病因是由于人9号染色体和22号染色体之间的特异性染色质易位。 易位后产生的异常染色体常常被叫做费城染色体(Darnell, J. et al., Molecular Cell Biology, 2nd Ed., W. H. Freeman and Co., New York(l990), p. 992)。 C-abl (ABL)基因， 一个据认为有关生 长调控的酪氨酸激酶，定位于人9号染色体的末梢臂上，而c-bcr(BCR)基因定位于22号 染色体。易位将ABL启动子末梢包括编码酪氨酸激酶结构域的元件的三个外显子置于BCR 的第一或者第二外显子的下游(Chung, S. and Wong， P. M. C.， Oncogene, 10:1261-1268 (1995))。 人类9号和22号染色体间的易位产物是一个嵌合基因，BCR-ABL，其编码一个融合蛋白， 取决于是否包含BCR的第二个外显子，通常写作pl85bCT-abl或者p210beMbl(Bartarm, C. R., et al., Nature, 306:277-280(1983))。 pl85bc>abl会导致急性白血病，典型的是成淋巴细胞性白血病； p210bCT—31)|通常导致CML，但是偶尔也能导致急性白血病。
CML涉及恶性多能干细胞转化导致的克隆性骨髓增生，临床特征为粒细胞的过度产生， 主要在骨髓，也可见于髓外组织，(比如脾脏、肝脏)。尽管粒细胞增殖占主要地位，但肿瘤 性转化克隆还涉及RBC、巨核细胞、单核细胞、甚至一些T和B细胞。正常干细胞仍然存在， 而且可以在药物抑制CML克隆后仍然会出现。骨髓富含细胞，但是20-30%的病人会发生骨 髓纤维变性，通常是在几年后。对大多数病人而言，CML复制会进入一个加速阶段，最终导 致胚细胞危机。在这时，胚细胞瘤会发展至髓外组织，包括骨、中枢神经系统CNS、淋巴结 和皮肤。
慢性髓性白血病(CML)表现出一个特别的病程，最初为慢性粒细胞增生症，然后总是 由于某个低分化显型(即，疾病的胚细胞危象阶段)的细胞克隆性扩增而进化为急性白血病。 CML是一个不稳定的疾病，最终进行到终末阶段，表现为急性白血病。2004年，在美国， 这个致命的疾病影响了大约9730位患者。化疗药物例如羟基脲和白消安可以降低淋巴细胞载 量，但是不影响患者的生存期(例如大概4年)。所以，CML患者是骨髓移植(BMT)疗法 的候选人。但是对于BMT生存患者而言，疾病复发仍然是一个主要的障碍(Apperley et al., 1988 Br. J. Haematol. 69, 239)。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种方法，包括通过使生物样品与结合分子 集反应，从而为来自疑似AML个体的样本建立复合标志物分布，其中所述结合分子集含有 两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物水平和标志 物结合情况可识别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群接下来通过检测标志物水平和标志 物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在，其中标志物水平和结合情 况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；并且使正常和肿瘤性转化细胞群标志物水平 与至少一种耙蛋白的存在联系起来，从而为来自疑似急性髓性白血病(AML)个体的样本建
立复合标志物分布。在该实施方式中，该靶蛋白可选自由信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡 标志物所构成的组。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种方法，包括通过使生物样品与结合分子 集反应，从而为来自疑似急性淋巴细胞白血病(ALL)个体的样本建立复合标志物分布，其 中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子， 其中标志物水平和标志物结合情况可识别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；接下来通过 检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在，其 中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；并且使正常和肿瘤性 转化细胞群标志物水平与至少一种靶蛋白的存在联系起来，从而为来自疑似ALL个体的样本 建立复合标志物分布。在该实施方式中，该靶蛋白可选自由信号转导蛋白、增殖标志物和凋 亡标志物所构成的组。
在这里，术语"肿瘤性转化状态"指的是一种与细胞增殖有关的状态，其特征为正常控 制的缺失，该缺失会导致一种或者多种症状，包括不可调节的生长，分化缺失，所在组织 侵袭，和转移。像在这里描述的那样，当为来自疑有肿瘤性转化状态个体的样本建立复合标 志物分布时，生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特 的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中相关标志物可鉴别样品内部的正常和肿瘤 性转化细胞群。
生物样品最好直接采集于个体，特别是被怀疑有癌症的个体，并且接下去以合适的方式 为该样品建立复合分布。在一个具体实施方式
中，生物液体可以是，例如，全血、外周血单 个核细胞(PBMCs)、骨髓穿刺物或者淋巴组织。合适的生物液体包括任何身体组织或体液。 在优选的实施方式中，身体组织可以是骨髓抽吸物、骨髓活检切片、淋巴结穿刺物、淋巴结 切片、脾脏组织、细针穿刺物、皮肤活检切片或者器官组织活检切片，组织部分和脱落细胞。 其他实施方式包括的体液样品是外周血、淋巴液、腹水、血浆和脑脊髓液。就急性白血病而 言，全血和骨髓穿刺物是特别合适的生物样品。在一个生物样品包含全血的实施方式中，提 供的样品可以包括固定和渗透的白细胞和红细胞的裂解液。可以理解的是，提供的包含很高 水平红细胞的生物样品可以通过处理来去除红细胞，例如，通过低渗透压裂解、去垢剂处理 和密度-梯度离心。
如同这里描述的那样，在本发明的方法中，生物样品与结合分子集相接触，其中所述结 合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中相关 标志物可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群。这里使用的术语"结合分子"指的是任
何可以通过足够的亲和力与抗原结合从而现示出选择性结合活性的分子。结合分子的例子包 括抗体、抗体片段和抗体样分子。抗体可以通过B细胞、杂交瘤产生，并且可以是嵌合抗体 或人源化抗体或其任何片段，例如，F(ab')2和Fab片段、以及单链或单一结构域抗体。
在实践本发明方法中的有用结合分子可以是单链抗体，它由抗体的重链和轻链可变区通 过一个通常含有10至30个氨基酸、优选为15-25个氨基酸的连接肽进行共价结合。所以， 这样一个结构不包括重、轻链的恒定区，而且据认为这个小肽间隔区相比完整恒定区具有较 弱的抗原性。在实践本发明方法中的有用结合分子也可以是嵌合抗体，它是这样一种抗体 重链或者轻链或两者的恒定区皆来源于人，而重、轻链的可变区都不是人源性的，比如是鼠 源性的。在实践本发明方法中的有用结合分子还可以是人源化抗体，它的高变区(CDRs)不 是人源性的，比如，是鼠源性的，而它的所有或者几乎所有其他免疫球蛋白部分、特别是恒 定区和可变区的高度保守区域(特别是架构区域)，是人源性的。人源化抗体可以在挨着高变 区的架构区域保留一点来源于小鼠序列的氨基酸。高变区可以与任何架构区域相联，最好是 鼠源性或者人源性的架构区域。合适的架构区域是众所周知的，在现有技术中也有描述。所 有前面提到的结合分子都适于实践本发明的方法。
本发明方法中使用的结合分子集合包含两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有 特异性的结合分子，所述标志物可以辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群。这里使用的 术语"细胞群相关标志物"指的是这样一种抗原，其单独或者与一个或者几个不同的抗原组 合在一起用于依靠被选择性地结合于结合分子而辨别在生物样品内部的一个或更多细胞群。 如本领域的技术人员理解的那样，细胞群可以基于与独特的标志物，例如，展示在细胞表面 的细胞表面标志物进行结合而被识别。对于急性白血病而言，细胞群相关标志物包括，例如， CD45、 CD2,CD3、 CD7、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD33、 CD34、 CD56、 CD71、 CD117、 HLA-DR。取决于使用者，可以加入补充标志物，例如，CDla、 cCD3、 CD4、 CD5、 CD8、 cCD22、 CD61、血型糖蛋白A和TdT。如同这里描述的，对于来自于疑 似AML个体的生物样品，对于建立复合分布有用的细胞群相关标志物可以包括，例如，CD45、 CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓过氧化物酶)、CD64、 CD117
(c-kit受体)。另夕卜，对于M6-M7型白血病，取决于使用者，可以加入标志物例如CD41、 CD42、 CD61、 CD62P、 CD71、血型糖蛋白A、血红素。应当理解，当样品细胞性有限时， 几乎没有标志物可以被分析。对于通过流式细胞术来鉴别和定量细胞群而言，CD分子是方便 的诊断标准物。流式细胞术是用于计数、检査和分类悬浮在液流中的显微微粒的技术。流式 细胞术程序开始于细胞或者组织的获得，经过染色和洗涤，接下来通过在流式细胞仪上获得
流体数据，并且以数据分析和报告结果而告终。
在实施这里所说的方法时，所研究的细胞群包括不同种类的白细胞，特别是粒细胞，淋 巴细胞和单核细胞。有三种粒细胞中性粒细胞，嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞。白细胞还包括 淋巴细胞，其包括B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。自然杀伤细胞或"NK细胞"是健康个 体内包含2-15%外周血单核细胞的大颗粒淋巴细胞。虽然大多数NK细胞是CD3:TCR'、 CD16+、 CD56+，在这个群体中仍然有相当的表型和功能异质性(Trinchieri, Adv. Immunol., 47:187 (1989))。例如，人们发现CD56的表面密度限定了功能独特的NK细胞群。CD56b喊tNK 细胞大部分是CD16+，其为无颗粒淋巴细胞，在细胞溶解效应功能方面有缺陷，其在对外源 性IL-2的反应上会剧烈增殖。CD56dim NK细胞是具有潜在的细胞溶解效应功能的CD16+ LGLs,其在对IL-2的反应上不增殖。因为一些T细胞同时表达CD16和CD56，这些分子本 身不能限定NK细胞群(Trinchieri，1989)。另外，因为在功能分化的NK细胞群上CD56的表 达较低，单克隆抗体与CD56的反应性不能可靠地用于将样品中NK细胞的亚群与其他细胞 区分开来。除了能够区分正常细胞群外，在本发明的方法中可以使用结合分子，以便鉴定样 品内部的肿瘤性转化细胞群。对于通过流式细胞术鉴别和定量细胞群而言，CD分子是方便的 诊断标准物。在本发明优选的实施方式中，细胞群相关标志物表达水平，例如CD38+对于 B-CLL的表达，是通过使用流式细胞术决定的，该过程中，细胞被标记了连接有荧光染料或 者酶的单克隆抗体，虽然可见免疫荧光法或者其他方法也可以使用。在具体的实施方式中， 分析了生物样品，用于分析细胞群相关性标志物结合性的表面表达，例如，通过多色免疫荧 光，使用对某个特定细胞型相关群体具有特异性的结合分子集合进行分析。应当理解，结合 分子的任何结合性都可以进行选择，所述结合性对于在生物样品中鉴别特定细胞性相关群体 具有特异性。
如同这里描述的那样，对于来自于疑似CLL的个体的生物样品，对于建立其复合分布， 有用的细胞群相关标志物可以包括例如，用于鉴别T细胞的CD3，用于鉴别正常T细胞和 恶性B细胞的CD5，用于鉴别正常B细胞和恶性B细胞的CD19，用于鉴别正常NK细胞的 CD56，用于鉴别激活的B细胞或者滤泡外套层B细胞的CD23，用于鉴别细胞激活和分化的 CD38，作为细胞质B细胞系标志物的CD79b，作为正常B细胞系标志物并且是特征性地在 B-CLL中呈阴性的FMC7。所以，对于鉴别B-CLL中细胞群有用的标志物结合包括CD5阳 性与CD19阳性；CD5阳性与CD20阴性;CD3阳性或者CD56阳性;以及CD3阳性。
这个方法可以通过使用任何含有B-CLL细胞的组织而实现，所述组织包括但不局限于脾 脏、淋巴结、骨髓、淋巴液、外周血、来自于个体的全血样品、或者经过处理并进行外周血单核细胞(PBMC)分离的全血样品。
作为早期造血前体细胞的肿瘤性转化结果，慢性髓性白血病(CML)的临床特点表现为 外周血循环中未成熟和成熟的髓样细胞积累，细胞遗传学特点为费城染色体的出现。在CML 中可表达髓系抗原CD33、 CD13、 CDll、 CD45和它的同种型CD45RO，但不表达有助于分 辨CML与急性髓性白血病(AML)的CD45RA。因为CML细胞表达HLA-DR，它们可以与 正常骨髓前体相区别。在本发明涉及疑似CML个体的实施方式中，细胞群相关标志物选自 下组用于鉴别未成熟或者"胚"细胞群的CD45、 CD34，用于鉴别正常和肿瘤性转化髓样 细胞的CDllb，用于鉴别正常和肿瘤性转化髓样细胞的CD13、 CD15，用于鉴别正常和肿瘤 性转化B细胞的CD14、 CD33、 CD79a和b，用于鉴别恶性细胞CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl， 和用于鉴别正常和肿瘤性转化细胞群分化状态的末端脱氧核苷酸酶转移酶(TdT)。
如同这里描述的，细胞群可以基于独特的细胞群相关标志物的结合而被辨别，所述标志 物例如是表达展示在细胞表面的细胞表面标志物。在本发明的方法中，正常和肿瘤性转化的 内部细胞群的鉴别是基于细胞群相关性标志物的表达和水平，之前进行使每个细胞群与至少 一种耙蛋白的存在相关联的步骤。因此，最初的内部细胞群相关性标志物结合情况用来鉴别 正常和肿瘤性转化细胞群，随后与至少一种靶蛋白的存在相联系。应当理解，基于生物样品 内部的特定细胞群，可以选择细胞群相关性标志物的出现和表达水平的结合方式，这些结合 方式预期用于进一步与所研究的靶蛋白相关联。应当进一步理解，当通过在样品中外源性加 入或者掺入合适的参照细胞群而在样品中不存在参照群体时，基于与内部细胞对照群体的比 较进行的染色定量的方法可以推广至应用方面。
基于与B-CLL相关的实施方式的细胞群相关性标志物表达和水平而鉴定的特定正常和肿 瘤性转化内部细胞，可以包含这样一个群体CD5阳性和CD19阳性；CD5阳性和CD20阴 性;CD3阳性和CD56阳性;CD3阳性。作为本发明原则的例子，正常的或者活性T细胞(CD3+) 和NK细胞(CD56+)对于ZAP-70蛋白表达呈阳性，而正常B细胞(CD19+/CD5-)和正常 粒细胞(通过单独或者与CD45交联后光散射特性而鉴定)对于ZAP-70蛋白表达呈阴性。这 些样品内部的细胞群被用于确定B-CLL (肿瘤性转化)群体中ZAP-70表达水平，还一起被 用来建立复合体系，该ZAP-70蛋白是通过相对于内部阳性和阴性细胞群呈CD19+/CD5+ (有 潜力与其他标志物例如FCM7-偶联)而鉴定的。
在针对CML的实施方式中，细胞群相关性标志物可以鉴别细胞群，所述细胞群除了任 何正常淋巴细胞、单核细胞、或者粒细胞外，还包含淋巴颗粒细胞和另一种包含淋巴单核细 胞的细胞群。所以，本发明提供了一种方法，包括通过使生物样品与结合分子集反应，从
而为来自疑似CML个体的样本建立复合标志物分布，其中所述结合分子集含有两组或者更 多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物水平和标志物结合情况 可识别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；接下来通过检测标志物水平和标志物结合情况， 来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在，其中标志物水平和结合情况可辨别样品 内部的正常和肿瘤性转化细胞群；并且使正常和肿瘤性转化细胞群标志物水平与至少一种靶 蛋白的存在关联起来，从而为来自疑似慢性髓性白血病(CML)个体的样本建立复合标志物 分布。在该实施方式中，该靶蛋白可选自由信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡标志物所构成 的组。
生物样品经处理可以用于复合标志物分布的建立，该建立方法使用本领域技术人员可选 的任何细胞准备方法和适合于样品的染色处理。应当理解，准备和染色步骤一般包括RBC裂 解、染色、固定、渗透，这些步骤的次序可以有某些变化，只要所研究的细胞群相关性标志 物仍然存在，允许进行这里描述的细胞群鉴别，就可以采用上述准备和染色步骤。合适的准 备步骤已本领域技术人员所熟知，本文描述了，例如，使用低渗裂解对全血、骨髓、腹水等 进行红细胞裂解(以获得纯化的WBC群)，或者使用密度梯度离心技术(例如Hyp叫ue/Fico11) 以获得富含单核细胞的样品。
所以，在本发明为来自于疑似肿瘤性转化状态个体的样品建立复合标志物分布的方法中， 使样品首先与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相 关标志物具有特异性的结合分子，以辨别正常和肿瘤性转化细胞群。如同上文所述，结合分 子集可以被使用者选择，以便鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群。 一旦正常和肿瘤性 转化细胞群得到鉴别，还可以将该细胞群与靶蛋白的存在相关联，从而建立复合标志物分布。
这里使用的术语"靶蛋白"指的是这样一种蛋白，作为其在调节正常和肿瘤性转化细胞 群的细胞反应、表现、功能中的作用，可以用于建立复合标志物分布。在建立本发明的复合 标志物分布中，通常会测量一种或者更多种靶蛋白对调节性刺激物的功能反应，比较样品内 部的正常和肿瘤性转化细胞群。本发明方法中有用的靶蛋白可以是，比如，信号分子，其介 导细胞代谢的相关效应、细胞生长、分化、凋亡，或者实现其他任何生理作用。相应地，靶 蛋白的调节状态可以当其作为一个特异性或者合适的底物、分子转接蛋白、或者信号途径的 组分而提高一个生物反应时得到测量。为了建立本发明的复合标志物分布，靶蛋白的调节状 态例如磷酸化状态，可以通过样品内部的肿瘤性转化和正常细胞群来测定。
这里使用的术语"复合标志物分布"，指的是比较生物样品内部独特的细胞群靶蛋白表 达水平矩阵，复合标志物分布代表了生物样品内量化的靶蛋白，该量化是基于肿瘤性转化细
胞内的靶蛋白表达相对于对靶蛋白呈阳性的正常细胞群中靶蛋白染色水平的标准化。对靶蛋 白呈阳性的正常细胞群用作不同靶蛋白表达水平的阳性对照。 一种或者多种内部不表达靶蛋 白的正常细胞群可以作为阴性对照。在组织样品中，外周血污染可以导致足够的用作内部阴 性对照的粒细胞。
在为来自于疑似AML或者CML的个体的样品建立复合标志物分布的方法中，靶蛋白可 以是信号转导蛋白，例如，Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Flt3、 Akt/PKB、 ERK、 mTOR或S6。图5显示了描述在AML样品中被mTOR激活的S6激活情况的流式细 胞术仪面板。另外，在为来自于疑似CML个体的样品建立复合标志物分布的方法中，靶蛋 白可以是增殖标志物，例如周期蛋白Dl或者周期蛋白A2，以及是一个凋亡标志，例如 cleaved-Caspase-3或者Bcl-XI。图6显示了一个通过比较在CD34+干细胞至内参照群体(淋 巴细胞，粒细胞和单核细胞)内三种不同信号转导蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT对三种 刺激的反应而建立外周血干细胞中动员干细胞的复合分布。图7描述了根据AML患者样本， 通过测定血液样品中信号转导靶蛋白P-ERK和P-S6的表达情况，并将在AML (红色)胚细 胞中的表达与在内参照群淋巴细胞(蓝色)和粒细胞(绿色)中的表达相比较，从而建立的 复合分布。
在本发明的特定实施方式中，B-CLL中ZAP-70的量化检测可以通过相对于正常T和自 然杀伤细胞中的ZAP-70染色水平进行标准化而实现，这两种细胞都是ZAP-70阳性。在本实 施方式中，其目的在于为罹患特定复合标志物分布的个体建立复合标志物分布，所述特定复 合标志物分布是为来自疑似B-CLL个体的样品建立的。本实施方式中，由于自然杀伤细胞相 比T细胞有更明亮的染色，正常T细胞和自然杀伤细胞提供了两种不同亮度的阳性对照。在 本实施方式中，外周血和骨髓生物样品中的粒细胞和正常B细胞是ZAP-70阴性的，可以作 为阴性对照。
在此公开的特定实施方式中，检测靶蛋白用于可以和某个状况相联系的修饰，比如磷酸 化状态。细胞很大程度上依靠细胞外分子，该分子作为一种手段以便从其所处外界环境接受 刺激。这些细胞外信号对于正确调节不同的细胞过程比如分化、收縮、分泌、细胞分裂、接 触抑制和代谢是必需的，还可以与异常的或者潜在有害的过程比如病毒-受体反应、炎症和细 胞转化癌变相关联。该过程的中心特点即信号转导是某些蛋白的可逆磷酸化。磷酸化是一个 包括竞争性磷酸化和去磷酸化的动态过程，任意给定瞬间的磷酸化水平反映了此时催化这些 反应的蛋白酶和磷酸酶的相对活性。
所以，本发明的复合标志物分布可以将靶蛋白的磷酸化或去磷酸化相关联，而不仅仅是
它的表达，因为被调节的蛋白的构象变化改变它们的生物学特性。当蛋白磷酸化主要发生在 丝氨酸和苏氨酸的氨基酸残基时，酪氨酸残基的磷酸化也会发生，很多人对此感兴趣，因为 发现很多致癌基因产物和生长因子受体具有内源性蛋白酪氨酸酶活性。生长因子信号转导、 细胞周期过程和肿瘤性转化中的蛋白酪氨酸磷酸化的重要性现在己经全面确认了 (Cantley et al.， 1991, Cell 64:281-302; Hunter T.， 1991, Cell 64:249-270; Nurse, 1990, Nature 344:503-508; Schlessinger et al., 1992， Neuron 9:383-391; Ullrich et al., 1990， Cell 61:203-212)。正常生长控制 途径的破坏导致癌发生，表明是由于组成一大组主要致癌蛋白的蛋白酪氨酸酶的激活或者过 度表达造成的。(Hunter, T.综述，1991 ，Cell 64:249-270)。如同这里揭示的，本发明中的复合标 志物分布可以将正常和肿瘤性转化细胞群的靶蛋白磷酸化水平与靶蛋白的存在相关联，从而 为来源于疑似肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分布。
在优选的实施方式中，所有构成复合标志物分布的细胞群都在生物样品内。当针对生物 样品时，这里使用的术语"内部"是指所有的细胞群最初存在于样品中，而不是在建立复合 标志物分布之前加入或者"掺入"的方式。在没有可以作为阴性对照的细胞群的情况下，通 过比较对靶蛋白呈阳性的正常细胞和肿瘤性转化细胞的内部群体而建立对比矩阵，可以半定 量地确定足够的靶蛋白水平，从而根据上面公开的方法建立复合标志物分布。可更进一步想 到，可以将阳性或者阴性内部细胞参照群加入生物样品，假如在样品中不存在这些参照群的 话。
如上所述，本发明提供了一种方法，其包括通过使生物样品与结合分子集反应，从而 为来自于疑似B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)个体的样本建立复合标志物分布，其 中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子； 并且通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的 存在，其中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；同时使正常 细胞群和肿瘤性转化细胞群标志物水平与ZAP-70的存在关联起来，从而为来自于疑似B细 胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)个体的样品建立复合标志物分布。
通过相对于皆为ZAP-70阳性的正常T细胞和自然杀伤细胞的ZAP-70染色水平进行标准 化，可以实现B-CLL中ZAP-70的量化。这就提供了两种不同亮度的阳性对照，其中自然杀 伤细胞相比T细胞有更深的染色。在本实施方式中，外周血和骨髓生物样品中的粒细胞或正 常B细胞是ZAP-70阴性的，可以作为阴性对照。
在组织样品中，外周血污染可以提供足够的粒细胞来作为内部阴性对照。当没有粒细胞 时，其相对于正常T细胞的比例应足以进行半定量检测。在CLL中可以实现该半定量检测的
抗原的特异性组合体除了 ZAP-7之外是CD19、 CD5和CD56。其他抗体组合可以用于选择相 关恶性细胞和正常细胞群体。除了上面提到的以外，还可以包括，而不限于CD3、 CD20、 CD23、 CD79a、 MCF7和免疫球蛋白轻链。这里提出的方法可以通过借助针对给定的表面或 者细胞内靶蛋白进行特异性染色的样品来实施，其中正常细胞群对于相同靶蛋白既呈阳性又 呈阴性，或者有可进行细胞染色的特性，该正常细胞群可以存在并可以作为生物参照用于决 定所研究的细胞群对于相同的抗原或者标志物是否是呈阳性。内部生物细胞群还可以用作对 照以确定所研究的细胞中抗体或者标志物的半定量目水平。内部细胞群可以基于其他细胞性 质而进行挑选，包括但不局限于抗原检测和散射光特征。所需的特异性标志物取决于本发明 方法的具体应用，本领域的技术人员可据此选择。
根据以上描述的用于为特定血癌制备复合标志物分布的实施方式可以延伸至诊断方法。 根据本发明的方法而建立的复合标志物分布，通过与一个或者更多复合标志物分布进行比较， 可以用于诊断罹患疑似肿瘤性转化状态的个体的肿瘤性转化状态，其中该比较可以用于预测 肿瘤性转化状态的临床进程。
这里使用的术语"预测临床原因"意味着包含任何与状况或者治疗有关的因素的诊断和 预后，包括生存期，病程预后和治疗反应的预后。
当用于复合标志物分布内容中时，这里使用的术语"参照"指的是一个已知与某个特定 参数相关的复合标志物分布，该参数与来自于待测生物样品的复合标志物分布进行比较。一 个参照复合标志物分布可以代表一种特定的肿瘤性转化状态、肿瘤性转化状态的一个阶段， 或者可以代表一个已知的疾病过程，例如是攻击性还是惰性病程。例如，用于本发明的诊断 方法的参照复合标志物可以代表疑似患病个体的特定状态。参照复合标志物分布可以代表肿 瘤性转化状态的一个特定阶段，或者可以代表已知的疾病过程，例如攻击性进程。
在本发明诊断和预后方法的优选实施方式中，将一个个体的复合标志物分布与一个以上 参照复合标志物分布相比较。例如，在诊断应用中，可以将一个个体的复合标志物分布与代 表临床阶段图谱的两个或者更多参照复合标志物分布的集合相比较，以便能够通过比较将个 体疾病阶段进行细微分类。类似地，在预后应用中，可以将个体的复合标志物分布与两个或 更多代表图谱的参照复合标志物分布的集合相比较，该图谱系列从非攻击性至攻击性、或者 从治疗应答至不应答。
通过将用上述方法获得的复合标志物分布与一种或者多种参照复合标志物分布进行比 较，根据本发明方法的复合标志物分布可以用于诊断疑似患有血癌个体的血癌，其中该对照 分布可以用于预测血癌的临床病程，所述血癌选自由慢淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性
白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)所构成的组。
在一个实施方式中，通过将复合分布与和一种或多种参照复合分布相比较，根据本发明 方法的复合标志物分布可以用于诊断疑似患病个体的Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血 病(CLL)，其中该比较可以预测Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床病 程(Hamblinetal.， Blood 94: 1848-1854(1999))。本发明可以提供一种用于预测个体Ig-未突变 B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床病程的方法，包括提供来源于个体的生物样 品；使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞 群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物水平和标志物结合可以鉴别样品内部的正 常和肿瘤性转化细胞群；通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和 肿瘤性转化细胞群的存在，其中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化 细胞群；使正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与ZAP-70的存在关联起来，从而 为来源于疑似患有B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体的样品建立复合标志物分 布，其中该复合分布代表ZAP-70的相对量化水平；将该复合分布与一种或多种参照复合分 布相比较，其中该比较可以用于预测Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床 病程。
在另一个实施方式中，本发明可以提供一种预测个体Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白 血病(CLL)临床过程的方法，包括提供来源于个体的生物样品；使生物样品与结合分子 集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的 结合分子，其中标志物水平和标志物结合可以鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；通 过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在， 其中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；使正常细胞群和肿 瘤性转化细胞群的标志物水平与一靶蛋白的存在关联起来，从而为来源于疑似患有B细胞慢 性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体的样品建立复合标志物分布，其中该靶蛋白选自由 ZAP-70、激活诱导的C型凝集素(AICL)和脂蛋白脂肪酶所构成的组，其中该复合分布代 表ZAP-70的相对量化水平；将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较 可以用于预测Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床进程。
在一个实施方式中，通过将根据本发明方法的复合标志物分布与一种或多种参照复合分 布相比较，可以提供一种用于诊断疑似患病个体的Ig-突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)的方法，其中该比较可以用于预测Ig-突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的 临床过程。在另一个实施方式中，本发明可以提供一种预测个体Ig-突变B细胞慢性淋巴细胞
性白血病(CLL)临床过程的方法，包括提供来源于个体的生物样品；使生物样品与结合 分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异 性的结合分子，其中标志物水平和标志物结合可以鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群； 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在， 其中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；使正常细胞群和肿 瘤性转化细胞群的标志物水平与一靶蛋白的存在关联起来，从而为来源于疑似患有B细胞慢 性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体的样品建立复合标志物分布，其中该靶蛋白选自由 IM68532、 IM1286077和LCI15506所构成的组，其中该复合分布代表耙蛋白的相对量化水平； 将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较可以用于预测Ig-突变B细胞慢 性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床进程。
在另一个实施方式中，通过将根据本发明方法的复合标志物分布与一种或多种参照复合 分布相比较，可以提供一种用于诊断疑似罹患CML个体的CML的方法，其中该比较可以用 于预测CML的临床进程。通过将根据上述方法获得的复合标志物分布与一种或多种参照复 合分布相比较，可以提供一种用于诊断疑似罹患AML个体的AML的方法，其中该比较可以 用于预测AML的临床进程。在再一个实施方式中，通过将根据上述方法获得的复合标志物 分布与一种或多种参照复合分布相比较，可以提供一种用于诊断疑似罹患ALL个体的ALL 的方法，其中该比较可以用于预测ALL的临床进程。
在本发明的另一个实施方式中，制备用于特定血癌的复合标志物分布的方法可以延伸至 预后方法。特别是，根据上述方法获得的复合分布可以被用于为患有肿瘤性转化状态的个体 选择合适的临床处理和治疗形式。
根据本发明方法的复合标志物分布可以用于从无论治疗与否都永远不会发展至疾病较高 阶段的个体中鉴别出预期对特定治疗产生有效应答的个体。因此，本发明的复合体系可以用 于预测个体的临床进展，尽管还是在疾病的常规阶段，并且还可以帮助临床医生更好地评估 治疗方法的选择，而且通过较好地区分特定治疗的效果，还会大大增强临床研究价值。
通过将根据本发明方法的复合标志物分布与一种或多种参照复合分布相比较，该复合标 志物分布可以用于预测疑似患有肿瘤性转化状态个体的任何肿瘤性转化状态的临床进展，其 中该比较可以预测肿瘤性转化状态的临床病程。通过将根据本发明方法的复合标志物分布与 一种或多种参照复合分布相比较，该复合标志物分布可以用于预测疑似患有血癌个体的血癌 的临床进展，其中该比较可以预测血癌的临床病程，所述血癌选自由慢淋巴细胞性白血病 (CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)
所构成的组。
在一个实施方式中，通过将根据本发明方法的复合标志物分布与一种或多种参照复合分 布相比较，该复合标志物分布可以用于预测疑似患病个体的Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性 白血病(CLL)的临床进展，其中该比较可以预测Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)的临床进程。因此，本发明可以提供一种预测个体Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性 白血病(CLL)临床进程的方法，其包括提供来源于个体的生物样品；使生物样品与结合 分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异 性的结合分子，其中标志物水平和标志物结合可以鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群； 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群的存在， 其中标志物水平和结合情况可辨别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；使正常细胞群和肿 瘤性转化细胞群的标志物水平与ZAP-70的存在关联起来，从而为来源于疑似患有B细胞慢 性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体的样品建立复合标志物分布，其中该复合分布代表 ZAP-70的相对量化水平；并且将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较 可以用于预测Ig-未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床进程。
通过确定治疗方案是否会带来确实有效的作用或者是否值得冒相关的风险，根据本发明 方法的复合标志物分布可用于帮助使用者为个体选择一个攻击性或试验性治疗方案。例如， 一些B-CLL病人死于治疗和B-CLL的复合效应而不单是B-CLL。通过可以鉴别已经处于 B-CLL高级阶段的B-CLL病人而不用依赖常规的Rai和Binet分级体系，根据本发明方法的 复合标志物分布可用于帮助选择更具攻击性的治疗方案，比如放疗、化疗、移植和免疫疗法。
在另一个实施方式中，通过将根据本发明方法的复合标志物分布与一种或多种参照复合 分布相比较，该复合标志物分布可以用于预测疑似患有CML个体的CML的临床进展，其中 该比较可以用于预测CML的临床过程。在另一个实施方式中，通过将根据上述方法获得的 复合标志物分布与一种或多种参照复合分布相比较，该复合标志物分布可以用于预测疑似患 有AML个体的AML的临床进展，其中该比较可以用于预测AML的临床过程。在再一个实 施方式中，通过将根据上述方法获得的复合标志物分布与一种或多种参照复合分布相比较， 该复合标志物分布可以用于预测疑似患有CLL个体的CLL的临床进展，其中该比较可以预 测CLL的临床过程。
在又一个实施方式中，本发明的方法可以建立对监测患有血癌个体正在进行的治疗有用 的复合分布。例如，对于CML病人，复合分布可以用于监测病人对格列卫(Gleevec)治疗 的反应，而对于AML病人，则用于监测病人对抑制mTOR的雷帕霉素治疗的反应。另外，
复合分布在药物研发和分子耙向治疗中也有作用。根据本文的公开，本领域技术人员应当理 解，本发明的方法对于建立的复合分布会有进一步的应用，比如包括，用于确定单个病人在 疾病的发生和/或发展阶段不同信号转导途径的相对重要性，从而运用于个性化治疗。
另一个方面，本发明还提供了一个试剂盒，其包含在本发明方法中有用的试剂，用于诊 断和检测罹患肿瘤性转化状态例如白血病的个体的疾病阶段。这里指出的用于本发明方法的 材料期望适合于试剂盒制备。这样的试剂盒可以包含携带工具，其划分为可以紧密收容一种 或多种容器的限定空间，该容器着例如是药瓶、试管和类似物，每样容器都含有一个单独的 用于本方法的组分。例如，容器之一可以包含有结合分子集，该结合分子集含有两组或者更 多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，该标志物是或者可以被适合于诊断 和预后目的的标志物所可检测地标记。另外， 一个容器包含一种检测靶蛋白的手段，它是或 者可以被适合于诊断和预后目的的标志物所可检测地标记。就诊断试剂盒而言，试剂盒还可 以有含有参照样品、比较用的参照复合标志物分布的图标、缓冲液的容器和/或包含报告方法 的容器，该报告方法，例如，是结合于报告分子的生物素结合蛋白比如抗生物素蛋白或链霉 抗生物素蛋白，该报告分子例如是酶学或者荧光标记。如果需要，试剂盒还可以包括珠子， 其提供了用于证实系统组分完整性目的的外部对照。
除了化学原料，当然使用该试剂盒的说明书也包括在内，优选用于预后和诊断应用。说 明书可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部。 说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、电脑光盘、录像等，其中标志物的水平和标志物的 结合可以鉴别样品内部的正常细胞群与肿瘤性转化细胞群。如果需要的话，该试剂盒可以包 括辅助性试剂，如酶抑制剂和/或信号发生试剂或系统。此外，其他的辅助试剂也可以包含在 该试剂盒内，比如，缓冲液、稳定剂以及类似物。
因此本发明提供了一种用于为来自疑有肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分 布的试剂盒，该试剂盒包括有结合分子集，该结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞 群相关标志物具有特异性的结合分子，该标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内部的 正常细胞群和肿瘤性转化细胞群，并且结合分子对靶蛋白具有特异性，从而为来自疑有肿瘤 性转化状态的个体的样品建立复合标志物分布。肿瘤性转化状态可以进一步是血癌如白血病， 比如急性骨髓性白血病或急性髓细胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓细胞白 血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血 病(HCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)。
更具体的说，本发明提供了一种用于为来自疑有B-CLL状态的个体的样品建立复合标志
物分布的试剂盒，该试剂盒包括有结合分子集，该结合分子集含有两组或者更多组对独特的 细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，该标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内 部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群，并且结合分子对ZAP-70或者其他靶信号转导蛋白(包 括但不限制于本文公开的靶蛋白)具有特异性，从而为从疑有B-CLL的个体所获得的样品建 立复合标志物分布。
通过使用该试剂盒，可以为多种类型临床样品建立复合分布，该样品可以包括全血(用 任一可用试剂或试剂盒处理，以固定和透化白细胞并溶解红细胞)、骨髓、外周血单核细胞 (PBMC's)、腹水等。那些含有显著水平红细胞的生物样品应该接受处理以移除红细胞(低 渗溶解、清洁剂处理、密度梯度离心，等)，然后与细胞群标志物反应，接着用适当的试剂(试 剂盒中提供)固定和透化白细胞。接着细胞群与表征(细胞内)信号转导、增殖、凋亡等的 标志物反应，并通过适当的技术(如流式细胞术、影像分析、手工显微镜检等)进行分析。
可以理解，那些不会实质性影响本发明的各种具体实施方式
的活性的修饰也包括在本发 明限定的范围内。因此，以下实施例是为了说明但不是为了限制本发明。
实施例l 制备用于建立复合分布的样品
本实施例显示了用于为疑有B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体建立复合分 布的样品的制备过程。
概括地说，将混和有细胞表面标志物CD5-FITC、 +CD3-ECD、 +CD56-PC5、 +CD19-PC7 的l(Hd试剂加入小管，并加入100nl全血。室温孵育20min，加入64pl固定液(10%甲醛) 后室温孵育10min。接着，加入lmL裂解/透化试剂(0.1% Triton X-IOO)，室温孵育30min 后离心。用缓冲液(含有2%BSA的PBS)洗涤细胞两次，用lOpl抗-ZAP-70-PE和90pl的 缓冲液重悬，室温孵育30min，然后用缓冲液洗涤一次，用含有0.1%多聚甲醛的缓冲液重悬。 然后将样品用流式细胞仪分析。图1显示了用于建立复合标志物分布方法的样品制备的示例 性模式图。
实施例2 用于建立复合分布的样品的分析
本实施例显示了用流式细胞仪分析样品以建立复合分布。
如图2所示，采用ZAP-70门控/分析算法按如下方法建立复合分布第一闸门正常全血 样品用于通过光散射鉴别淋巴细胞(蓝色加绿色)，如左上方直方图所示。如果需要的话，
CD45侧向散射(线性刻度)可以用来为外周血中CD45-亮型淋巴细胞设门以进行CD4计数， 同时CD45侧向散射(对数刻度)可以用来鉴定骨髓中胚细胞群以进行显型。图2中，CD19 相对CD5的直方图鉴别了正常B细胞(紫色，左上象限)、正常T细胞(蓝色，右下象限) 和正常外周血中的"前"B细胞(CD19+5+，右上象限)。B-CLL肿瘤性转化细胞也落入右上 象限，但是与它们的正常细胞相比，B-CLL肿瘤性转化细胞不表达ZAP-70。图2的底部展示 了叠加的散点图，综合了复合分布并且展示了B-CLL细胞落入该直方图(ZAP-70表达)，与 内源性正常B细胞(CD19+)、正常T细胞(CD5+3+)和NK细胞(CD56+)相关。图3显 示了用流式细胞仪由用于CLL样品中ZAP-70分析的门控策略而得到的面板。图4展示的图 描述了一例CLL样品中存在的细胞空间中ZAP-70的表达情况。(红色B细胞；绿色正常
T细胞；紫色NK细胞)。
图5展示了描述一例AML样品中mTOR激活S6的流式细胞仪面板。 图6为外周血中动员干细胞(CD34+)的复合分布。直方图提供了与未处理样品(红) 相比，在用PMA (蓝)、干细胞因子(绿)、或IGF-1 (橙)激活后每个动员干细胞、正常粒 细胞、正常单核细胞和正常淋巴细胞中三种不同的信号传导蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT 的反应情况比较。图中显示了体内首次处理以动员干细胞(CD34+)的(人)全血样品。左 边的两幅直方图展示了 CD34+干细胞(底部)和正常粒细胞、单核细胞和淋巴细胞(顶部) 如何被鉴别。在这些实验中，单个供体的多份样品用能刺激信号转导通路的下述因子进行了 处理(体外)PMA (蓝)、干细胞因子(绿)、或IGF-1 (橙)，并与未处理样品(红)相对 比。右边的组图展示了三种不同的信号传导蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT的反应(或缺 失)情况。这些结果将CD34+干细胞的反应与内部参照细胞(淋巴细胞、粒细胞和单核细胞) 群相比较，并证实了 CD34+细胞对这三种刺激产生了反应。
图7显示了单个AML患者的复合分布。等分血样用PMA刺激，用或者不用特异性信号 转导通路抑制剂(图例见右下角)刺激，或用干细胞因子刺激。反应结果用P-ERK对P-S6 的双边量散点图检测(右侧面板)，红色群表示AML胚细胞，蓝色表示内在淋巴细胞，绿色 表示内在粒细胞。AML胚细胞(红)、淋巴细胞(蓝)和粒细胞(绿)通过使用左边两个框 中描述的CD34侧向散射来鉴定。P-ERK和P-S6在未处理(从顶部向下排列)、PMA处理、 PMA+U0126 (P-ERK抑制剂)、PMA+Rapamysin (mT0R〉S6抑制剂)、PMA+Ly294002 (PKB/AKT抑制剂)和干细胞因子处理(底部)的全血样品中的表达水平如图所示。在所有 的P-表位直方图中，长柱揭示了P-ERK和P-S6在未刺激样品中的水平，即为"基础"表达。 直方图展示了不同的处理方式对AM1胚细胞(红)相比淋巴细胞(蓝)和粒细胞(绿)的效
果比较。
图8显示了CLL复合分布。样品中的B细胞阴性峰和阳性峰表现一致，NK细胞阳性峰 的表达比ZAP70强阳性的样品更高，与样品的一致性较低。ZAP70+CLL具有0.2。/。"正常B 细胞"，但该罕见的结果与其余样品中阴性峰的现象相当。中度表达ZAP70的CLL和正常 的B细胞-S/N2.15之间存在明显的位移。
在该申请的全文中，如括号内所示，引用了不同的著作。本申请中将所有这些出版物的
公开合并为参考，以便对本发明所属领域中的现有技术作出更全面的描述。
虽然本发明已经用公开的具体实施方式
作出了描述，本领域的技术人员很容易领悟这些
具体的实施例和以上的研究细节只是用于说明本发明。在不违背本发明的宗旨的情况下，可
以对本发明作出各种的修饰。因此，本发明要求附后的权利。
权利要求
1. 一种为来自疑有肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分布的方法，该方法包括以下步骤(a)使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(b)通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的存在，所述标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；以及(c)将每个正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与一靶蛋白的存在关联起来，从而为来自疑有肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分布。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白为活化磷酸化信号转导蛋白。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，进一步包括确定靶蛋白修饰方式。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌选自由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、 急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL) 所构成的组。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物包括选自下组的细胞 表面标志物CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD23、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓过氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b禾卩CD117 (c-kit受体)。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标志物进一步包括K-和X-免疫球蛋白轻 链以用于检测克隆性。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌为B细胞慢性淋巴细胞性白血病 (B-CUJ 。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白选自由ZAP-70、激活诱导的C-型凝集素(AICL)、脂蛋白脂肪酶以及IM68532所构成的组。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL) 是Ig-突变的B-CLL。
10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物选自由CD3、 CD5、 CD19、 CD23、 CD38、 CD56、 CD79b和ftnc7所构成的组。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物可以鉴定包括白血 病B细胞的细胞群。
12. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，所述白血病B细胞呈ZAP-70阳性。
13. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的一种或多种细胞群包括ZAP-70阴 性细胞群。
14. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的一种或多种细胞群包括正常B细胞。
15. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述ZAP-70阴性细胞群包括粒细胞。
16. —种用于预测个体Ig未突变B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)临床进程的方法， 该方法包括以下步骤(a) 提供来自于该个体的生物样品；(b) 使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更多组对独特的细 胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内 部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(c) 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转 化细胞群的存在，所述标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群；(d) 将每个正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与至少一种信号转导蛋白的存 在关联起来，从而为来自疑有B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的个体的样品建立复 合标志物分布，其中该复合分布代表了所述信号转导蛋白水平的相对量化；以及(e) 将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较可以用于预测Ig未 突变的B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的临床进程。
17. —种为从疑有慢性骨髓性白血病(CML)的个体所获得的样品建立复合标志物分布 的方法，该方法包括以下步骤(a) 使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更多组对独特的细 胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内 部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(b) 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转 化细胞群的存在，其中标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞群； 以及(c) 将每个正常细胞群的和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与至少一种靶蛋白的存在关 联起来，从而为来自疑有慢性骨髓性白血病(CML)的个体的样本建立复合标志物分布，其 中所述靶蛋白选自由活化磷酸化信号转导蛋白、增殖标志物、分化标志物和凋亡标志物所构 成的组。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物选自由CD45、CD34、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD33、 CD79a、 CD79b、 CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl禾口 TdT所构成的组。
19. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是活化磷酸化信号转导蛋白。
20. 如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述活化磷酸化信号转导蛋白选自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所构成的组。
21. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是增殖标志物或凋亡标志物。
22. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是选自由细胞周期蛋白D1和 细胞周期蛋白A2所构成的组的增殖标志物。
23. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是选自由胱天蛋白酶-3和Bcl-Xl 所构成的组的凋亡标志物。
24. —种为个体预测慢性骨髓性白血病(CML)的临床进程的方法，该方法包括以下步骤(a) 提供来自于该个体的生物样品；(b) 使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更多组对独特的细 胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内 部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(C)通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转 化细胞群的存在，其中所述标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞 群；(d) 将每个正常细胞群的和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与至少一种靶蛋白的存在关 联起来，从而为从疑有慢性骨髓性白血病(CML)的个体所获得的样品建立复合标志物分布， 其中所述靶蛋白选自由活化磷酸化信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡标志物所构成的组；以 及(e) 将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较可以用于预测慢性骨 髓性白血病(CML)的临床进程。
25. —种为从疑有急性骨髓性白血病(AML)的个体所获得的样品建立复合标志物分布 的方法，该方法包括以下步骤(a) 使生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更多组对独特的细 胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内 部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(b) 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转 化细胞群的存在，其中所述标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞 群；以及(c) 将每个正常细胞群的和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与至少一种靶蛋白的存在关 联起来，从而为来自疑有急性骨髓性白血病(AML)的个体的样品建立复合标志物分布，其 中所述靶蛋白选自由活化磷酸化信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡标志物所构成的组。
26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物选自由CD45、CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓过氧化物酶)、CD64和CD117 (c-kit受体)所构成的组。
27. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述细胞群相关标志物可以鉴别包含白血 病粒细胞或白血病单核细胞的细胞群。
28. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是活化磷酸化信号转导蛋白。
29. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述活化磷酸化信号转导蛋白选自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所构成的组。
30. 如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是增殖标志物或凋亡标志物。
31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白是选自由细胞周期蛋白D1和 细胞周期蛋白A2所构成的组的增殖标志物。
32. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的该靶蛋白是选自由胱天蛋白酶-3和 Bcl-Xl所构成的组的凋亡标志物。
33. —种为个体预测急性骨髓性白血病(AML)的临床进程的方法，该方法包括以下步骤(b) 使从该个体获得的生物样品与结合分子集反应，其中所述结合分子集含有两组或更 多组对独特的细胞群相关标志物具有特异性的结合分子，其中标志物的水平和标志物的结合 可以鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转化细胞群；(c) 通过检测标志物水平和标志物结合情况，来鉴别样品内部的正常细胞群和肿瘤性转 化细胞群的存在，其中所述标志物水平和结合情况可鉴别样品内部的正常和肿瘤性转化细胞 群；(d) 将每个正常细胞群和肿瘤性转化细胞群的标志物水平与至少一种靶蛋白的存在关联 起来，从而为从疑有急性骨髓性白血病(AML)的个体所获得的样品建立复合标志物分布， 其中所述耙蛋白选自由活化磷酸化信号转导蛋白、增殖标志物和凋亡标志物所构成的组；以 及(e) 将该复合分布与一种或多种参照复合分布相比较，其中该比较可以用于预测急性骨 髓性白血病(AML)的临床过程。
34. —种试剂盒，用于建立如权利要求l所述的复合标志物分布，该试剂盒包括(a) 结合分子集合，其中该结合分子集含有两组或者更多组对独特的细胞群相关标志物 具有特异性的结合分子，其中该标志物的水平和标志物的结合可以鉴别样品内部的正常细胞 群和肿瘤性转化细胞群，以及(b) 至少一种对靶蛋白具有特异性的结合分子，用于为来自疑有肿瘤性转化状态的个体 的样品建立复合标志物分布。
35. 如权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤性转化状态选自由白血病、淋 巴瘤和多种骨髓瘤所构成的组。
36. 如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述白血病选自由慢性淋巴细胞性白血 病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞性白 血病(ALL)所构成的组。
37. 如权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞群相关标志物包括细胞表面标 志物。
38. 如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述细胞表面标志物选自由CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓过氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b和CDU7 (c-kit受体)所构成的组。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种为来自疑有肿瘤性转化状态的个体的样品建立复合标志物分布的方法。本发明的复合标志物分布可以用于鉴别个体的肿瘤性转化状态相关亚群的预后和治疗、以及预测个体的疾病进程。本发明的方法为罹患肿瘤性转化状态的个体提供用于选择治疗方式的工具，包括确定危险人群的方法、预测复发风险增加的方法、预测发生继发性并发症风险增加的方法、为个体选择治疗方案的方法、确定对个体治疗效果的方法、确定个体的预后的方法。特别地，本发明的方法公开了一种建立复合标志物分布的方法，其可用作预后指示来预测个体肿瘤性转化状态的进程是攻击性还是惰性，从而帮助临床工作者处理病人和评估将要使用的治疗形式。在特别公开的实施方式中，本发明的目的在于建立用于白血病的复合标志物分布，该白血病选自由慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(ALL)所构成的组。
文档编号G01N33/53GK101389959SQ200680040388
公开日2009年3月18日 申请日期2006年11月2日 优先权日2005年11月4日
发明者戴维·赫德利, 文森特·T·尚奇, 斯坦利·沙克尼, 查尔斯·古尔斯比, 詹姆斯·雅克伯格 申请人:贝克曼考尔特公司;西北大学;健康网络大学;西储大学;阿勒格尼辛格研究所