专利名称：用于酶活性确定的磁性生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测或诊断领域，具体而言，涉及用于体内和体外应用中 的生物分子诊断。更具体而言，本发明涉及一种使用磁性粒子来执行酶法 测定的磁感测设备。
背景技术：
在诊断领域中，例如医学诊断领域中，将传感器用于执行所有种类的 测定。在这些测定中，可以确定特定目标材料的浓度。测定还用于监测酶 转化。
公知的目标的实例是DNA、 RNA、肽、蛋白质、药物、病原体、激素、 糖和细胞物质。在测定中通常使用标记来进行目标浓度的确定。当前所用 的标记是光学标记和荧光标记。
在特定疾病的检测中，希望确定在复杂生物样品中的酶活性。不是所 有测定设备都适合于此，针对以下内容可能出现问题测定的灵敏度、非 特异性结合、过慢的结合，其导致对所测量的酶活性得到不准确的结果、 或者复杂的预纯化步骤，其不是用户友好性的。
而且，许多用于确定酶活性的已知的测定使用人造底物，其在与酶发 生反应吋提供颜色效果。该颜色效果用于确定酶活性。对于指定的酶，会 难以找到这种人造底物，因此希望提供一种测定，其不完全依赖于获得这 种人造底物。
本发明的目的是提供一种感测设备，其克服了这些缺陷中的一个或多个。
发明内容
我们意外发现，磁性传感器非常适用于酶法测定。
因此，本发明的一个方面涉及一种方法，用于使用磁性传感器来确定酶活性。本发明的另一方面涉及一种适用于该方法的设备。由以下的详述，并结合附图，其借助于实例来说明本发明，本发明的 这些及其它方面会变得显而易见。引用的参考标记涉及附图。
图1示出了酶(1)修饰底物(2)来形成产物(3)的实施例。图2示出了酶(1)降解底物(2)来形成产物(3)的实施例。图3示出了结合组分(4)偶联于传感器表面(6)的实施例。图4示出了底物(2)到产物(3)的转化导致底物切割并且该底物随后不再结合到固定结合组分(4)的实施例。图5示出了底物固定在固体表面，并且结合组分(4)固定在传感器表面的实施例。图6示出了进行了磁标记的结合组分(9)结合酶的实施例。图7—10示出了捕获机制的一个具体实施例，在此，酶被进行了磁标记的结合组分(9)捕获，并施加磁场来将捕获的酶吸引到表面，该表面包含固定在其上的底物。
具体实施方式
在当指代单数名词时使用了不定冠词或定冠词时，例如"一"、"这个"， 这就包括多个该名词，除非明确表述了是另一种情况。应注意，在本说明书和权利要求书中所用的术语"包括"不应被诠释 为限于之后所列出的装置；其不排除其它元件或步骤。本发明涉及磁性传感器的使用，磁性传感器用于分析酶活性。该方法 尤其适用于分析在复杂生物样品中存在的酶的活性。使用本发明的优点在 于，其省去了对于样品的多种预纯化方法的需求。磁性传感器用于酶活性确定的另一有利特征在于，可以在反应期间， 直接确定酶促反应的动力学，因此，当前的使用和方法也适于酶一底物亲 合力确定。在本发明中，磁性传感器被定义为传感器设备，其使用磁性标记来确认特定组分的存在。
Zhao等人(Angew Chew Intl Ed 2003， 42， No 12, 1375-1378页)公开了磁 性粒子在酶法测定中的使用。检测是基于磁性粒子簇的形成，用1.5T超导 磁体以MR成像来对磁性粒子簇进行成像。这个MR成像设备没有包含在 根据本发明的磁性传感器设备的定义中。根据本发明的设备检测结合到传 感器表面的磁性标记的存在。
我们将在本发明的具体实施例的范围内论述本发明。 根据一个方面，本发明涉及一种使用磁性传感器设备分析酶活性的方 法，其中，通过使用结合组分(4)和磁性标记(5)来确定酶(1)修饰底物(2)来形 成产物(3)的活性，该方法包括以下步骤
(a) 在传感器表面上固定底物(2)或结合组分(4)，
(b) 使所述底物(2)与所述酶(l)接触，
(c) 向所述结合组分或所述底物提供磁性标记，
(d) 使所述结合组分与底物(2)或产物(3)相接触，以允许将所述结合组分 (4)直接或间接连接到所述底物(2)或所述产物(3)，
(e) 用磁性传感器检测所述磁性标记。
可以以任何适当的顺序来执行这些步骤。在该方法的优选实施例中， 在使底物与酶相接触之前，固定底物或结合组分(步骤a)。
优选地，在单独的制备步骤中，向结合组分或底物提供磁性标记。 在优选的事件顺序中，在步骤(a)、 (b)之后执行步骤(d)、 (e)。 在本发明的步骤中，向结合组分和/或底物提供磁性标记。优选地，在 标记与结合组分或底物之间的键是共价键，但其它类型的键，例如氢键， 也是可以的。
磁性标记也被称为磁珠或磁性粒子。磁性标记优选是球形的，但这不 是对全部实施例的要求。其它适合的形状例如是圆柱形、棒形、立方体和 椭圆形。
借助于术语"磁性标记"，可以理解该标记包括一种或多种磁性粒子的 任何适当的形式，例如磁性的、反磁性的、顺磁性的、超顺磁性的、铁磁 性的，其是永久地或暂时地在磁场中产生磁偶极子的磁性的任何形式。适 合的磁性标记材料的实例是Fe304珠。磁性标记的尺寸在大多数实施例中都不是重要的，但对于许多生物传 感器应用来说，非常优选的标记是小尺寸的。优选的磁性标记具有从1到
3000nm的尺寸(通常以最长的直径来表示)，更优选的是从5到500nm，再 更优选的从10到300nm，最优选的从30到250nm。
磁性标记的检测通常借助于电场、磁场或电磁场的施加来进行。 本发明涉及酶活性的确定。可以用该方法来确定其活性的适合的酶例 如是从包含以下的组中选出的caspase类、蛋白酶类、激酶类。该方法及 使用尤其适于确定需要辅因子的酶的活性，辅因子存在于包含该酶的生物 样品中，但其可能不会幸免于大量的预纯化过程，与磁检测相比，该过程
对于其它检测方法而言是常用的。
酶会存在于专门为此准备的样品(7)中，或者可以是待分析的"原料" 的一部分，以确定其相对于特异性底物的酶活性。所要求权利的方法的一 个优点在于，"原料"，例如包括血液和尿液在内的体液的预纯化无需获得 可靠的数据。
酶的活性通常以单位来表示。单位通常定义为在特定时帧(分钟或小时) 中转化特定量(摩尔或克)的底物所需要的酶的量。比活性也可以表示为单位 /样品体积。
在本发明中，"降解酶"被定义为辅助将底物(2)切割为产物(3)的酶(例 如，肽链内切酶或核酸内切酶)或将底物(2)分解为产物(3)的酶(例如链肽端 解酶(exopeptidase)或核酸外切酶(exonuclease))为产物(3)的酶，其中产物(3) 是降解产物。通常切割导致至少两个产物部分的释放。
在该方法中，本发明的使用和设备，使用了结合组分。"结合组分"是 以可测量的强度结合另一组分的组分，该强度大于非特异性结合的强度。
结合组分可以是肽或蛋白质，具有对底物或产物的结合亲和性。结合 组分的实例是抗体或其功能片段及衍生物，例如Fab片段、单链Fv、 VHH、 重链抗体。抗体可以指非蛋白质化合物，以及蛋白质或肽。结合组分优选 以高特异性、高亲和力结合，优选与底物或产物的键合能够经受测定条件。 结合组分的其它实例是受体蛋白质、配体、适体、寡核苷酸、或这些中任 一种的功能片段或衍生物。
在本发明的优选实施例中，底物是蛋白质或肽，因为它们易于通过酶促反应转化为产物。可选的底物是其它生物或化学物质，例如核酸、脂类、 碳水化合物和螯合剂。图1示出了本发明的第一种优选实施例。在该实施例中，确定了酶(l)修饰底物(2沐形成产物(3)的活性。在该具体实施例中，将底物(2)固定在传 感器表面(6)上。包含底物修饰酶(1)的样品(7)与传感器表面相接触。根据反 应条件，但假定这些是正确的，底物(2)会在某种程度上被转化为产物(3)， 除非该酶是完全无活性的。在该实施例中，产物(3)保持附着到传感器表面。 采用磁性标记对结合组分(4)进行标记。结合组分(4)特异性结合产物(3)，该 产物保持固定在传感器表面上。磁性传感器，例如嵌入在传感器表面中的 磁阻传感器，可以检测磁性粒子与标记的结合。产物(3)的量以及由此的酶 的活性与检测到的标记的量成比例。样品(7)优选的是流体样品。水性组合物非常适用于该方法。在可替换实施例中，结合组分(4)不直接结合产物(3)，而是结合初级结 合组分(8)，该初级结合组分(8)直接结合产物(3)。在此情况下，在初级结合 部分(8)被暴露并偶联于连接到另一结合组分(4)的磁体之后，可以进行检测。 该实施例的实例包括以下方法其中，经由配体/结合物(binder)相互作用， 例如生物素-链亲和素、半抗原/抗半抗原、或地高辛/抗地高辛相互作用，初 级结合部分与携带磁性标记的结合部分相互作用。在图2中示出了另一实施例。在该实施例中，底物(2)被酶(1)降解。在 该实施例中，会难以测量由在与酶接触后由降解产生的产物。因此，在该 实施例中，结合组分直接或间接地结合底物。在此情况下，底物就是所谓 的未修饰的底物。在与含酶的样品(7)进行温育之后发现的结合组分的量与 存在于样品中的酶活性逆相关。在该实施例中，优选的是，磁性标记连接 到结合组分。在更优选的实施例中，结合组分直接结合底物。在可替换实施例中，本发明涉及一种使用磁性传感器设备分析酶活性 方法，其中，确定了酶(1)修饰底物(2)以形成产物(3)的活性，该方法包括以 下步骤(a) 固定能够结合底物(2)或产物(3)的结合组分，(b) 提供具有磁性标记的底物(2)，(c) 使底物(2)与所述酶接触，(d) 使结合组分与底物(2)或产物(3滩接触，以允许将结合组分(4)直接或 间接地连接到底物(2)或产物(3)，
(e) 用传感器优选的是磁性传感器来检测磁性标记。 该实施例的一个方面在图3中示出。在该实施例中，底物直接或间接
偶联于磁性标记，结合组分(4)偶联于传感器表面(6)。结合组分特异性结合 仍包含磁性标记的产物(3)。结合组分(4)不结合或以低得多的程度结合底物 (2)。该方法尤其适用于小底物。在不希望受任何理论的限制的情况下，认 为该方法减小了传感器表面的酶一底物相互作用的位阻。
在图4中说明了另一实施例。在该实施例中，能够结合带有磁性标记(5) 的底物(2)的结合组分(4)被固定在传感器表面。底物与包含酶(l)的样品相接 触。底物(2)转化为产物(3)导致底物的切割，其不再结合所述结合组分。在 反应后检测到的磁性标记的量与存在于样品中的酶活性逆相关。该实施例 尤其适用于降解酶的活性的分析。
因此，在优选实施例中，本发明涉及一种如上确定的方法，其中
(a) 酶是降解酶，并且
(b) 结合组分结合底物(2)
(c) 酶促降解反应导致组分(3b)的形成，其包含磁性标记，且不结合所述 结合组分。
在另一实施例中，为了提供对反应条件和底物、产物及酶的浓度的更 好的控制，底物与结合组分(4)都固定在表面上。优选地，它们每一个都固 定在彼此接近的不同表面上，更优选地，所述表面基本上是彼此平行并彼 此相对的。
该实施例的特征在于
a) 底物(2)与结合组分(4)固定在表面上，
b) 所述底物包括磁性标记，
c) 酶活性导致底物的降解，从而使得产物(3)包含磁性标记，
d) 产物(3)结合所述结合组分(4)，结合组分(4)优选地位于朝向固定有底 物的传感器表面的一个表面上。
在该实施例中，优选的是，底物固定在固体表面上，结合组分(4)固定 在传感器表面上，以便能够检测结合到产物(3)的磁性标记，产物(3)结合所述结合组分(4)。在图5中示出了该实施例。任选地在该实施例中，具有磁性标记的第二结合组分(9)结合酶。这允 许人们通过施加磁场以捕获酶或者将其带入到传感器的特定空间中，来掌 控该反应。这在图6且更具体地在与图7 — 10中示出。在图6中，结合酶(1)的结合组分(9)偶联于磁性粒子，并捕获酶。其优 点在于，可以在传感器系统中进行完整的分离，这就允许在可获得各酶的 亚型的特异性结合组分的情况下，区分各种亚型的酶的活性。图7_10示出了捕获机制的一个具体实施例。该方法允许辨别具有同 种酶活性的不同酶(例如唾液淀粉酶和胰淀粉酶)的活性。在图7中，磁性标 记的结合组分捕获目的酶。随后施加磁场，来将捕获的酶吸引到包含固定 的底物的表面。没有被捕获到的酶未被吸引到该表面，并在该步骤被洗掉。 通过刺激，可以将捕获的酶带向包含固定底物的表面(图8)。随后在降解反 应中将底物酶促转化为产物(3)。在该降解中，释放了半抗原化磁性标记。 再次借助于刺激，将标记带到包含固定的结合组分的传感器表面，该结合 组分结合存在于产物(3)中的半抗原，其在酶促反应中被释放。这在图9中 示出。由此，标记结合到固定的结合组分。在任选的进一步的步骤中，通 过改变磁场的方向以使得仅有连接到固定结合组分(4)的强结合磁性标记保 留在适当位置，可以除去非半抗原化磁性标记。这在图10中示出。使用所 结合半抗原化磁性标记的量来计算存在于样品中的酶活性。根据另一个实施例，在根据本发明的方法中，用以下方式来确定酶活 性。为底物(2)提供磁性标记。该底物还连接到初级结合组分(8)的第一部分。 初级结合组分(8)优选地结合到结合组分(4)，结合组分(4)附着于传感器表 面。活性酶切割该底物，以便得到分离的初级结合组分(8)和分离的磁性标 记。由于以下两种机制，使得磁性标记结合到传感器表面的速率减小a)初 级结合组分(8)不再偶联于磁性标记；以及b)初级结合组分(8)的被切割的 单元结合到结合组分(4)。结果，磁性标记与传感器表面上结合部分的结合 速率是酶活性的量度。较高的结合速率表示较低的酶活性。任选地，如上 所述的方法包括如下所述的其它步骤。任选地，包括清洗步骤。该清洗步骤可以用于除去非特异性结合的磁 性标记、酶及其它组分。在另一个方面，本发明涉及一种适于酶活性的确定的磁性传感器设备。 该设备优选包括
(i) 至少一个电场或磁场产生装置(IO)，用于将电场或磁场施加到包含 磁性标记的样品流体，
(ii) 至少一个磁性传感器元件(ll)，
(iii) 至少一个传感器表面，
(iv) 至少一个用于流体组分的入口，
(V)至少一个用于流体组分的出口 。
优选地，该设备还包括反应室，用于执行酶促反应。
通常，磁性感测设备对于特异性附着于传感器表面的磁性标记是敏感 的，并在一定程度上还对没有特异性附着于传感器表面但在其附近的标记 是敏感的。为了使该设备高度特异于结合到传感器表面的磁性标记，该设 备优选包括传感器表面，其包括固定在其上的底物或结合组分。
底物和结合组分还可以分别以干或湿的形式来提供。
在优选实施例中，尤其对于执行图5—10所示出的方法的，该设备包 括传感器表面，其包括结合产物(3)的固定结合组分，优选的是结合产物 (3)的抗体；以及固体表面，其包括固定的底物(2)。优选的是，包含固定的 底物(2)的固体表面在传感器表面附近。
任选地，该设备包括用于控制温度的装置和/或用于清洁的装置。 本发明还涉及一种芯片，其包括如上所述的设备中的至少一个，更优 选的是如上所述的多个设备。
磁性传感器元件可以是任何适宜的元件，但优选的是从AMR(各向异性 磁阻)，GMR(巨磁阻)或TMR(隧道效应磁阻)传感器元件中选择的。基于其 它原理的传感器元件，例如霍尔传感器元件或SQUIDS，也可以用于所要求 权利的设备。
反应室可以是设备中的分离实体，或者可以是一个线形的反应空间。 反应室是在设备中样品(7)与酶(1)发生接触的空间。
该设备或芯片优选地包括底座，所述所述组分放置在底座上。该底座 可以由任何适宜的材料制造，例如玻璃、塑料或其组合。
在另一方面中，本发明涉及一种试剂盒，且包括结合了至少一个结合组分和底物的、如以上所指明的设备。这种设备适用于可以转化底物的酶
的酶活性分析。适合的底物和结合组分可以作为所述试剂盒的分开的部分
来提供，或可以集成到该设备中。
优选地，底物和结合组分中的至少一个被固定在设备的表面上(更优选
的是传感器表面)。
任选地，该试剂盒还包括其它组分，例如反应介质、辅因子。 本发明的设备、方法和系统适用于传感器多路复用(即，不同传感器和
传感器表面的并行使用)，标记多路复用(即，不同类型标记的并行使用)，
和室多路复用(B卩，不同反应室的并行使用)。
本发明中所述的设备、方法和系统可以用作用于小体积样品的快速、 稳固及易于现场使用的生物传感器。该设备优选包括反应室，其可以是与 紧凑型读取器一起使用的一次性用品，包含一个或多个磁场发生装置，以
及一个或多个检测装置。此外，本发明的设备、方法和系统可以用于自动 化高通量测试。在此情况下，反应室例如是装配在自动化工具中的孔板或 小池。
权利要求
1、 一种用磁性传感器设备分析酶活性的方法，其中，借助于使用结合组分(4)和磁性标记来确定酶(1)修饰底物(2)以形成产物(3)的活性，所述方法包括以下步骤(a) 在传感器表面上固定所述底物(2)或所述结合组分(4)，(b) 使所述底物接触所述酶，(c) 为所述结合组分或所述底物提供磁性标记，(d) 将所述结合组分(4)与底物(2)或产物(3)相接触，以允许将所述结合组 分(4)直接或间接地连接到所述底物(2)或所述产物(3)，(e) 用磁性传感器检测所述磁性标记。
2、 如权利要求l所述的方法，其中，确定了酶(1)将底物(2)修饰为产物 (3)的所述活性，其中，所述底物固定在传感器表面上。
3、 如权利要求2所述的方法，其中，所述结合组分(4)直接结合所述产 物(3)。
4、 如权利要求2所述的方法，其中，所述结合组分(4)结合初级结合组 分(8)，该初级结合组分(8)直接结合所述产物(3)。
5、 如权利要求l所述的方法，其中，确定了酶(1)降解底物(2)的所述活 性，其中，所述结合组分直接或间接地结合所述底物。
6、 如权利要求5所述的方法，其中，所述结合组分(4)结合初级结合组 分(8)，该初级结合组分(8)直接结合所述底物(2)。
7、 一种用磁性传感器设备分析酶活性的方法，其中，确定了酶(l)修饰 底物(2)以形成产物(3)的活性，所述方法包括以下步骤(a) 固定能够结合底物(2)或产物(3)的结合组分(4)，(b) 为底物(2)提供磁性标记，(c) 使所述底物(2)接触所述酶，(d) 将所述结合组分(4)与底物(2)或产物(3)相接触，以允许将所述结合组 分(4)分别直接或间接地连接到所述底物(2)或所述产物(3)，(e) 用磁性传感器检测所述磁性标记。
8、 如权利要求7所述的方法，其中(a) 所述酶是降解酶，并且(b) 所述结合组分结合底物(2)，(c) 酶促降解反应导致形成组分(3b)，所述组分(3b)包括所述磁性标记， 且不结合所述结合组分。
9、 如权利要求1所述的方法，用于确定降解酶的活性，其中a) 所述底物(2)和所述结合组分(4)固定在表面上，b) 所述底物包括磁性标记，c) 所述酶活性导致所述底物的降解，以致于产物(3)包括所述标记，以及d) 产物(3)结合到所述结合组分(4)。
10、 如权利要求9所述的方法，其中，具有磁性标记的第二结合组分 结合所述酶，并且可以施加磁场来捕获所述酶或者将其带入到所述传感器 的特定空间中。
11、 如权利要求10所述的方法，其中，所述底物固定在固体表面，并 且所述结合组分(4)固定在磁性生物传感器的传感器表面。
12、 一种用于分析酶(1)在将底物(2)修饰为产物(3)时的酶活性的设备，包括i) 至少一个电场或磁场产生装置，用于将电场或磁场施加到包含磁性 标记的样品流体，ii) 至少一个磁性传感器元件，iii) 至少一个传感器表面，iv) 至少一个用于流体组分的入口，v) 至少一个用于流体组分的出口。
13、 如权利要求12所述的设备，其中，底物和/或结合组分固定在所述 传感器表面(iii)。
14、 如权利要求13所述的设备，其包括传感器表面，其包含结合产 物(3)的固定结合组分，优选的是结合所述产物(3)的抗体；以及固体表面， 其包括固定在其上的底物(2)。
15、 一种芯片，其包含至少一个如权利要求12 — 14中任意一项所述的设备，更优选的是包含多个如权利要求12—14中任意一项所述的设备。
16、 一种用于酶分析的试剂盒，包括如权利要求12所述的设备以及适合的酶底物和/或结合组分。
全文摘要
磁性传感器非常适用于确定酶活性。在优选实施例中，本发明涉及一种用于确定在将底物(2)修饰为产物(3)时的酶的活性的方法，该方法包括结合底物或结合组分，其可以将例如底物或产物结合到传感器表面。这使得能够易于检测连接到底物、产物或结合组分上的磁性标记。
文档编号G01N33/543GK101313218SQ200680043963
公开日2008年11月26日 申请日期2006年11月21日 优先权日2005年11月25日
发明者E·R·福森纳尔, M·W·J·普林斯 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司