阳离子交换排代色谱分离方法和在阳离子交换排代色谱分离方法中用作排代剂的阳离子...的制作方法

专利名称：阳离子交换排代色谱分离方法和在阳离子交换排代色谱分离方法中用作排代剂的阳离子 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有多个季铵盐(multiplequats)的组合物，以及在色谱 法纯化中使用所述组合物作为排代剂的方法。
背景技术：
在1906年Tswett首先认识到了色谱法的排代模式，其指出在过载的 洗脱色谱的条件下出现样本排代。在1943年，Tiselius建议将众多的色 谱法主题分为三个不同的"模式，，迎头模式、洗脱模式和排代模式。从 那时起，大多数进展和应用，特别是在分析色谱中都发生在洗脱色谱法 的领域中。实际上，目前在缺少进一步的限定时，术语"色谱法"通常是 指洗脱模式的色谱法。
洗脱模式和排代模式在理论上和实践中都易于区别。在洗脱色谱法 中，要被纯化的样品溶液被施加于固定相，通常位于色谱柱中。选择流 动相以使样品既不是被不可逆地纟皮吸收也不是在整体上不被吸收，而是 可逆地结合。由于流动相流过固定相，在流动相和固定相之间建立了平 衡，由此，依赖对固定相的亲和性，样品以一定的速度，沿柱通过，所 述速度反应了相对于存在于原始样品中其他组分的亲和性。在标准洗脱 色谱法中需要特别指出的事实是洗脱展开剂前沿，或者等度洗脱的零柱 容积经常先于样品脱离色谱柱。
对等度洗脱色谱法的调整和扩展见于台阶梯度色谱法，其中 一系列 不同组合物的洗脱剂通过固定相。在离子交换色谱法中，例如，应用流 动相盐浓度和/或pH的阶梯变化洗脱或释放接受分离的分析物。
排代色谱法使用了排代剂化合物以从柱中去除混合物的组分。排代 剂化合物对固定相的亲和力通常远高于要被分离的混合物中的任意成分
对固定相的亲和力。这与洗脱色谱法形成对照，在洗脱色i普法中，洗脱 剂对固定相的亲和力低于要被分离的组分对固定相的亲和力。区别排代 色镨法和洗脱或解吸附色谱法的关键操作特征是使用排代化合物。在排 代色谱法中，在要被分离的组分都对固定相有较高的亲和力的条件下， 首先用载体溶剂平衡色谱柱。进料混合物的体积，其可以为大体积和非 常稀释的，被加载到柱上，并且进料混合物中的单个组分被吸附到固定 相。即，进料混合物的组分被分配或吸收到固定相上，并被保持在其中。 如果所有的组分通过排代被溶解，则载体溶剂从不含样品的柱中出现。 这时进料混合物的组分停留于固定相，并且每一组分在柱中的位置都与 其在初始条件下对固定相的相对亲和力相关。原则上，在固定相的既定 位点，任何组分的分子都将取代具有较低亲和力的任何其他组分的分子。 结果，单个组分最终将按亲和力从最高到最低的顺序在柱上排列。
允许进料混合物的一些组分，例如对固定相不具有显著亲和力的组
分，与载体溶剂一起通过色谱柱，这有时是具有优势的；在这种情况下， 只有保留的进料组分通过排代色谱法被溶解。
一旦样品被加载于色谙柱上，含有溶解于适合溶剂中的排代剂化合 物的溶液被加入柱中以通过固定相。选择排代剂化合物以使其对固定相 的亲和性比进料混合物中任意组分对固定相的亲和性都高。假设适当地 选择了排代剂和流动相，单个组分以高度浓缩的、相对纯的物质的相毗 邻的区带，以增高的吸收亲和力的顺序流出色谱柱。在纯化的单组分区 带之后，排代剂从柱中出现。根据排代化合物在样品之后，并且进料组 分以高度浓缩的、相对纯的物质的相毗邻的区带排出色谱柱的事实，易 于区别排代色谱与洗脱色谱。
对于工业色语，排代色镨法具有一些特别的优势特征。首先，排代 色谱可以一步完成产品分离和浓缩。作为对照，等度洗脱色谱导致分离 过程中显著的产品稀释。再者，由于排代过程在平^"等温线的非线性区 进行，因此可以进行高的柱装载。这可以比洗脱色谱具有非常好的柱利 用度。第三，色谱柱的研发和组分分离比相对照的洗脱方法需要更少的 溶剂。第四，排代色谱法可以从具有低分离因素的混合物中浓缩和纯化
组分，而在典型的洗脱色谱法中要获得满意的分离需要更大的分离因素。 由于所有这些优势，可以认为排代色谱法将得到广泛的应用。但是， 排代色谱却持续存在着一些问题。 一个问题是色语柱需要再生，因为每 次使用后就丟弃固定相是不经济的。另 一个问题是获得适合的排代化合 物，所述化合物为相对简单的化合物，易于合成和/或可以合理(经济) 的成本商业获得。这两个问题给排代色谱带来了相对于洗脱色谱而言的 缺点。
考虑到再生，由于排代工艺使用对固定相具有非常高的亲和力的排 代化合物，再生和重平衡色谱柱所需要的时间可以比洗脱色谱长。另夕卜， 在再生过程中经常需要相对大量的溶剂。这些问题有效地减少了排代色 谱比洗脱色谱所具有的优势。
第二个问题，即获得能够较易于合成和/或可以合理(经济)的成本 商业获得的有益的排代化合物，是由于需要既对固定相具有高亲和力又 可以在再生过程中从色谱柱相对容易除去的排代化合物。由现有技术提 供的化合物不能满足这两个重要标准中的一个或两个。各种所提供的化 合物为低分子量的排代剂，但是，它们相当难以合成和纯化，以及不能 以合理的成本商业获得，或者完全不能商业获得。
为了使排代色i普法成为主流的色谱技术， 一直都有对高效排代剂的 未满足的需要，所述排代剂合成和纯化非常简单，并经得起大规模生产， 和/或可商业获得，并且其使得固定相可以高效再生以使固定相在随后的 排代色镨工艺中可以重新使用。

发明内容
目前发现一类低分子量的带正电的化合物在排代色谱工艺中可以高 效行使排代剂的功能。因此，本发明既涉及排代色谱方法也涉及一组排
剂化合物使用之后可以有效地从固定相除去，使得固定相在随后的排代 色镨工艺中再生和重新使用。另外，这些排代剂化合物可以通过相对简 单和经济的合成方法以高收率和高纯度生产。因此，本发明解决了前述
的存在于现有技术排代色谱工艺中的问题。
根据本发明实施方案的排代剂化合物属于一类已知的有机季铵盐
(quat salts)化合物。季铵盐是带有正电荷氮原子的化合物。这些化合物 含有脂肪链，在多数情况下是水溶的。当溶于水中时，这些化合物显示 出带有正电荷的有益特性，其不受pH变化的影响。即，氮中心的电荷不 是胺单一质子化的结果，所以可以在宽范围调整这些盐的水溶液的pH, 而不引起氮中心的正电荷的丟失。普通的多胺和相关化合物通常不能用 作阳离子交换排代色语法中的排代化合物。这是因为它们没有完全质子 化，以及因此在pH范围内不能发展与排代色镨树脂相适应的足够的正电 荷。不同的是，本发明的排代剂化合物可以在任意的pH范围内使用，在 所述范围内色谱树脂都是稳定的。
在一个实施方案中，本发明涉及排代色谱方法，其包括， 将含有至少一种待分离的组分的混合物加载到适合的固定相之上； 通过将含具有通式(I)的排代剂化合物的混合物加入固定相，以从固 定相中排代所述的至少 一种组分
<formula>complex formula see original document page 11</formula>
其中，每个Rp R2、 R3、 R、、 R'2和R'3基团各自独立地选自烷基、 芳基和芳烷基，并且在其中，可以通过任意一个或多个的&和R2、 R
和RV R4和R4、 R4和R'4、或R4和R5形成含有一个或多个季氮原子的 环；
每个R4、 R'4、Rs和R'5基团各自独立地选自烷基、芳基、芳烷基和
國(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-:^R4R2R3An—,其中，！^、 R2和R3如上所定义； 每个Y独立地选自-H、 -OH、 -OR6、卣素、烷基、芳基和芳烷基， 其中-R6可以是烷基或-(CH2)a-(CHOHV(CH2)c-N+R4R2R3An—，其中，R丄、 R2和R3如上所定义，并且一个或多个的Y是通过一种或多种电f兹方法可
检测到的基团；
每个q和z ,各自独立地可以是从0到大约6中的任意整数，条件 是q + z等于或小于大约6;
每个a、 b和c各自独立地可以是从O到2中的任意整数，条件是任 何片段中的a+b+c的总和至少为1;以及
每个An一各自独立地可以是为获得中性化合物所需要的一个或多个 有机或无机的、单价或多价阴离子。
在一个实施方案中，本发明涉及由上述通式(I)所定义的组合物。在 一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构并被称为TBTQ-A的组合物
<formula>complex formula see original document page 12</formula>
在一个实施方案中，根据通式(I)的组合物不同于DBQ、 DMTQ、 DBTQ、 BTA和DBD,每一个都具有如下文所定义的结构。
在一个实施方案中，本发明涉及在排代色谱法中有用的排代剂组合 物。在一个实施方案中，排代剂组合物包括由上述通式(I)所定义的位于 适合水溶液中的化合物。在一个实施方案中，本发明涉及在排代色谱法 中有用的排代剂组合物，其具有上述的以及如TBTQ-A—样的结构。在 一个实施方案中，所述排代剂组合物不同于DBQ、 DMTQ、 DBTQ、 BTA 和DBD。
在一个实施方案中，本发明提供了接受了排代色谱分析的样品的痕 量组分的一种或多种检测、收集和定量的方法。
因此本发明提供了排代剂化合物、组合物和排代色.谱的方法，解决 了对有效排代化合物的需求，所述化合物的合成和纯化都很简单，可以 进行大规模生产，其可以使固定相有效再生以使固定相可以有效重新使 用。另外，本发明提供了检测、收集和/或定量样品或混合物中的痕量组分的方法。


图l是描述了根据本发明的一个实施方案，在不同波长下对牛细胞色
素C和马细胞色素C的混合物进行排代色谱分析过程中，UV/Vis HPLC 检测器的结果输出曲线图。
图2是描述了根据本发明的一个实施方案，对牛细胞色素C和马细胞 色素C的混合物进行排代色谱分析过程中所收集的馏分浓度的曲线图。
图3是描述了根据本发明的一个实施方案，在不同波长下对牛细胞色 素C和牛a-胰凝乳蛋白酶原A C的混合物进行排代色谱分析过程中， UV/Vis HPLC检测器的结果输出曲线图。
图4是描述了根据本发明的一个实施方案，对牛细胞色素C和牛a-胰凝乳蛋白酶原A C的混合物进行排代色谱分析过程中所收集的馏分浓 度的曲线图。
具体实施例方式
本文所使用的"卣素"是指包括卣素的集合，例如，氯、溴、氟或碘。 本文所使用的"烷基"和"亚烃基"是指通过适当地从烷烃分子中移去 一个或两个氢原子而衍生出的碳和氢原子的集合。"烷基"和"亚烃基"可以 包括具有直链、环链或支链部分的饱合单价或二价烃基。"烷基"和"亚烃 基"集合可以包括可选的碳-碳双键或三键，其中所述烷基含有至少两个碳 原子。可以理解的是，对于环链部分而言在所述烷基中至少需要三个碳 原子。在本发明中，烷基和亚烃基可以包括任何数量的碳原子。在本发 明的一个实施方案中，可以使用约20个或更少的碳原子。例如，在一个 实施方案中，在本发明中可以使用2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、或20个石友原子的烷基。当然，在本 发明中可以使用更长的或分支的烷基。可以使用亚烃基，例如在一个实 施方案中，由另外的两个烷基基团形成环链。
在本文使用的"芳基"是指不饱合的或取代的芳香结构，例如苯基、 萘基、芴基、菲基等。如本文所定义的，芳基在被取代时，可以被卤素 基团、烷基基团、另一个芳基基团或芳烷基基团所取代。
在本文使用的"芳烷基"是指在基团中，芳基基团的氢原子被烷基基 团取代。"芳基"同上文所定义。在本发明中，芳烷基可以包括任意数量
的碳原子。在本发明的一个实施方案中，芳烷基基团含有约20个或更少 的碳原子。例如，在一个实施方案中，在本发明中可以使用7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个碳原子的芳烷基基团。当 然，在本发明中可以使用更多碳原子的芳烷基基团。
在本文使用的"An一"代表与本发明排代剂化合物连接的一个或多个 有机或无机的单价或多价阴离子。与本发明季铵离子相连的带负电的阴 离子的数量和电荷总数将根据混合物的pH和用于中和的一种或多种酸 的阴离子而变化。本发明的阴离子An一可以是本领域技术人员知道的任 何的有机或无机的单价或多价阴离子，包括单价、双价和多价阴离子， 例如磺酸根、三氟甲基磺酸根、三氟甲磺酰胺、羧酸根、F、 Cr、 Br\ r、 CIO" HS04 、 SO,、 P043-、 HP042 、 H2P(V、 P032-、 HPO" BF4、 PF厂等。总之，可以根据获得中性化合物的需要适当地选择An一的价和数 量。
本文所引用的任何数值包括以一个单位从低值到高值递增的所有数 值，只要在任何低值和任何高值之间存在至少2个单位的间隔。例如， 如果显示出，组分的量，或者工艺参数值，例如温度、压力、时间等， 例如为从1到90,优选从20到80，更优选从30到70,其意指在说明书 中清楚地列举出诸如15到85, 22到68, 43到51, 30到32等的数值。 对于小于1的数值， 一个单位被适当地认为是0.0001、 0.001、 0.01或0.1。 这些仅是对具体指定的例举，可认为在本说明书中以近似的方式清楚地 表示了在最高值和最低值之间所列举的数值的所有可能的结合。
阳离子排代剂化合物
本发明的阳离子排代剂化合物包括具有公式(I)的化合物 <formula>complex formula see original document page 15</formula>(1)
其中，每个R。 R2、 R3、 R'i、 R'2和R'3基团各自独立地选自烷基、 芳基和芳烷基，并且在其中，可以通过任意一个或多个的Ri和R2、 R4 和RV R4和R4、 R4和RV或R4和R5形成含有季氮原子的环；
每个R4、和R5基团各自独立地选自烷基、芳基、芳烷基和 -(CH^a-CCHYVCCH^c-N+K^I^RsAn—,其中，R1、 R2和R3如上所定义；
每个Y独立地选自-H、 -OH、 -OR6、卣素、烷基、芳基和芳烷基， 其中-R6可以是烷基或-(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+I^R2R3An-,其中，R1、 R2和Rs如上所定义，并且一个或多个的Y是通过一种或多种电》兹方法可 -险测到的基团；
每个q和z ,各自独立地可以是从0到大约6中的任意整数，条件 是q + z等于或小于大约6;
每个a、 b和c各自独立地可以是从0到2中的任意整数，条件是任 何片段中的a+b+c的总和至少为1;以及
每个An—可以是为获得中性化合物所需要的一个或多个有机或无机 的、单价或多价阴离子。
公式(I)的排代剂化合物可以包括另外的使其易于被UV/可见光(Vis ) 光谙学、荧光或本领域技术人员已知的任何其他方法检测的取代基。这 样的取代基也可以影响化合物的阳离子交换色谱法的亲和性，使其低强 度结合或高强度结合。在一些情况下。没有取代基更有优势，所述取代 基将干扰通过排代色镨法纯化的化合物的正常检测手段。后者情形下的 例子是在280 nm不吸收UV光的公式(I)的排代剂化合物，在该波长下某 些生物高聚物(蛋白、寡肽、抗体等)发生特征性地吸收。促进可检测 性的适当的诱导剂对于本领域技术人员是已知的并且可以适当地选择。
在一个实施方案中，根据本发明的排代剂化合物中一个或多个Y可
以是通过一种或多种电磁方法可检测的基团。这样的电磁方法包括，例 如UV/可见光分光光度法、荧光分光光度法和放射活性检测方法。适合
的Y基团和检测这样的Y基团的适当方法对于使用这种方法的领域中的
技术人员是已知的。
适当的、示范性的阳离子排代剂化合物包括，例如，以下特定的示
例，在每一情况下，An一可以是一个或多个有机或无机的、单价或多价阴 离子，选择每一 An一的适当数量和价数以提供中性化合物(即，每一分 子应该具有零的净电荷，在各自离子上正电荷和负电荷是平衡的)。提供 下列特定的化合物作为根据上文通式(I)定义的，其中含有取代基的排代 剂化合物的示例。下文的示例并不意在限定，而是意在提供说明根据本 发明不同实施方案的排代剂化合物的特定例子。 DBQ，具有结构式<formula>complex formula see original document page 16</formula>,DMTQ具有结构式:
<formula>complex formula see original document page 16</formula>,DBTQ具有结构式:
16<formula>complex formula see original document page 17</formula>BTA,具有结构式:
DBD,具有结构式:
其中，在每个这样的结构(即，DBQ、 DMTQ、 DBTQ、 TBTQ-A、 BTA和DBD)中，An一可以是一个或多个有机或无机的单价阴离子，或 者An一可以是多价阴离子，在该情形下提供适当数量的该部分以获得中 性分子。An一的定义和使用在说明书全文适用。
一个示例性的排代剂化合物具有如下结构式，其含有季氮原子的环,
<formula>complex formula see original document page 17</formula>
在其中R4通过次乙基结合R'4，在其中所有的R。 R2、 R3、 RV R'2、 R'3-R5和R'5为甲基，An一如上文所定义，并且在其中Y= -OH:
<formula>complex formula see original document page 18</formula>
在一个实施方案中，本发明的排代剂化合物在分子中没有醚基。在 一个实施方案中，本发明的排代剂化合物没有与毗邻的季氮原子相连的 醚基。在一个实施方案中，本发明的排代剂化合物含有聚季基 (polyquatemary group ),在其中毗邻的聚季基不通过含醚基的部分连接。 在一个实施方案中，本发明的排代剂化合物没有分支状的聚醚。在一个 实施方案中，本发明的排代剂化合物含有季氮原子，其不通过由醚或聚 醚获得的基团连接在一起。
根据本发明的一个实施方案，合适的固定相为阳离子交换树脂。合 适的阳离子交换树脂在本领域是已知的，通常包括诸如曱基丙烯酸酯、 硅石、聚苯乙烯或聚苯乙烯-二乙烯基苯的树脂，其被阴离子部分，例如 羧甲基、磺丙基、磺酸、碳酸等衍生化，以吸引阳离子。本领域技术人 员可以根据要被分离的材料类型选择适合的阳离子交换树脂。在一个实 施方案中，用于本发明的适合的阳离子交换树脂包括，例如，Tosoh SP-5PW、 Tosoh CM-650、 SP-650和SP-550、 TOYOPEARL Super-Q 650S、 TOYOPEARL CM 650S,和TSK Gel SP-5PW阳离子交换树脂， 可从日本东京的Tosoh Corp.和宾夕法尼亚的Montgomeryville获得。另外 适合的阳离子交换树脂包括，例如，UnoSphere S和MacroPrep S / MacroPrep High画S,可从Bio画Rad Laboratories (Hercules,力口里弗尼亚)获 得；CHIROBIOTIC ,可乂人Advanced Separation Technology (Whippany, 新泽西)获得；SP-8HR和SP-15 HR,可从Waters Corporation (Milford,马 萨诸塞)获得；Mini S， Source 15S, Mono S, SP SEPHAROSE HP,和SP SEPHAROSE FF，可从GE-Amersham Biosciences (Piscataway,新泽西)
获得；SHOWDEX IEC SP-825和SHOWDEX IEC SP-2025,可从 Showa Denko (New York,纽约)获得；PL-SCX,可从Polymer Laboratories (Amherst, MA) 获得；Macrosphere300 , 可从 Alltech Laboratories (Deerfield, IL)获得；PolySulfoEthylA,可从PolyLC, Inc. (Columbia, MD) 获得；FRACTOGEL EMD SE Hicap 和 FRACTOGEL EMD S03，可从EMD Chemicals Inc. (Gibbstown， NJ)获 得。也可以使用其他合适的阳离子交换树脂。
根据本发明的一个实施方案，排代色谱法可以用于分离和纯化蛋白 和多肽。在本文中使用的蛋白质被广泛地定义为分子量大于5 kDa(千道 尔顿)的多聚氨基酸，并且多肽是分子量小于5 kDa的多聚氨基酸。如本 领域技术人员所理解的，蛋白质和多肽之间的差别不止一点。总之，蛋 白表现出四级结构，而多肽通常则没有。
在一个实施方案中，本发明特别用于从含有诸如蛋白质和多肽的混 合物中分离出所述组分。在一个实施方案中，混合物中的一种或多种组 分包括一种或多种多肽， 一种或多种蛋白或者任意两种或多种这样的蛋 白和/或多肽的混合物。也就是说，本发明方法可以应用于蛋白质混合物、 多肽混合物，以及蛋白质和多肽两者的混合物的分离。在一个实施方案 中，所述一种或多种蛋白质具有5kD或更高的分子量。在一个实施方案 中，所述混合物包括两种或多种蛋白质、两种或多种多肽或者它们的混 合物。
在一个实施方案中，混合物中的蛋白质和/或多肽以馏分从固定相被 排代出，其中蛋白质和/或多肽被充分富集和/或从其他的蛋白质和/或多肽 组分中充分分离出蛋白质和/或多肽。即，在一个实施方案中，当将含有 相关的蛋白质或多肽的混合物加至固定相，当将蛋白质或多肽从固定相 中被排代出，并以一种或多种馏分被收集，以其中之一或两者都被富集， 即更为浓缩的形式中的馏分获得所述蛋白质和/或多肽，或者从原始混合 物中的其他不同的蛋白质和/或多肽组分中充分分离获得所述蛋白质和/ 或多肽。因此，所述混合物无疑包括两种或多种要被分离的组分。如下 文所讨论的，在一些实施方案中，进行了根据本发明的排代色语分析的
混合物可以包括来自各种不同来源的许多不同物质的结合，并且可以将 本发明方法应用于这样的复杂混合物，以分离其中各种组分。
在另一个实施方案中，本发明被应用于含有至少一种组分(例如蛋 白质、多肽或其他组分，如下所定义)和至少一种杂质的混合物。在该 实施方案中，本发明方法可以用于从杂质中纯化组分。这种杂质的去除 既可以(1 )在所需要或目标组分被排代后通过固定或保持在固定相上(例 如，固定相作为过滤器)，或(2)从固定相中被清洗或洗脱，其中通过 非常类似于"传统的"洗脱色谱法的方法将杂质移去。在该实施方案中， 当杂质被固定或从色谱柱中移除，之后通过本文所描述的排代色谱法将 目标组分从柱中移除。
本发明可以应用于非常多种的组分，不仅包括上述的蛋白质、多肽 以及杂质，还可以有许多其他组分。在一个实施方案中，混合物可以包 括一种或多种天然或重组的抗体，或者这种抗体的任意两种或多种的混 合物。在一个实施方案中，混合物可以包4舌一种或多种天然或重组的酶， 或者这种酶的任意两种或多种的混合物。在一个实施方案中，混合物可 以包括一种或多种天然或重组的用于诊断的蛋白质或多肽，或者这种蛋 白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。在一个实施方案中，混合物 可以包括一种或多种天然或重组的用于人或动物治疗的蛋白质或多肽， 或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。在一个实施方案 中，混合物可以包括来自 一种或多种天然或重组的动物或人血浆的一种 或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混 合物。在一个实施方案中，混合物可以包括来自一种或多种天然或重组 的植物材料的一种或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任 意两种或多种的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括来自一种 或多种动物乳或人乳或来自重组动物乳的一种或多种蛋白质或多肽，或 者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。在一个实施方案中， 混合物可以包括来自一种或多种天然或重组的禽蛋的一种或多种蛋白质 或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。在一个 实施方案中，混合物可以包括来自一种或多种天然或重组的细菌、酵母
菌、真菌、病毒或昆虫的一种或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/ 或多肽的任意两种或多种的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包 括来自一种或多种天然或重组的哺乳动物细胞培养物或动物组织的一种 或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混 合物。在一个实施方案中，混合物可以包4舌一种或多种有才几化合物、药 物或药物中间体，或者其中任意两种或多种的混合物。在一个实施方案 中，所述一种或多种有机化合物、药物或药物中间体的一种或多种为手 性化合物。在一个实施方案中，混合物可以包括任意前述物质的混合物 或结合物，例如抗体和酶的混合物，或来自植物材料和禽蛋的蛋白质和/ 或多肽的混合物，或者前述的可以用于本发明方法的任意示范性组分的 寸壬意混合物。
在一个实施方案中，本发明方法进一步包括当排代剂化合物从固定 相出现的时候对其进行检测的步骤，其中通过一种或多种UV/可见光吸
收光谱学、荧光发射光谱学、质谱学、pH、传导率、 一种或多种电化学 方法进行检测。前述方法是检测排代剂化合物最常规使用的方法；本领 域技术人员可以使用其他合适的方法。这样的检测可以是针对如上所述 的 一种或多种"Y"取代基。
在一个实施方案中，可以根据所针对的特定组分合适地确定用于枱二 测从固定相中被排代的一种或多种组分的方法。因此，例如，可以根据
蛋白质或多肽的UV/可见光吸收光谱或特征吸收的波长，或者通过可S见 因子将其衍生化对所述蛋白质或多肽进行测定。
在一个实施方案中，本发明方法进一步包括一种或多种再生固定相 的步骤。在一个实施方案中，再生可以包括，例如用一种或多种碱金属 氢氧化物、碱金属盐、碱土金属氢氧化物、碱土金属盐、有机酸、烷基 磺酸、季铵碱、季铵盐、烷基胺的溶液处理固定相，其中所述溶液进一 步包括适合的pH緩冲液。还可以增加其他适合的再生步骤，包括，如果 需要，适当地用纯水沖洗样品。在一个实施方案中，再生包括与水一起 使用有机助溶剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测、收集或定量接受排代 色谱分析的样品中一种或多种痕量组分的方法。尽管本发明方法通常可 以作为如前述实施方案之描述的预备纯化方法使用，排代色谱法还是强 有力的样品制备技术，其可以容易地检测、收集和定量样品中的痕量组 分。在任何点上浓度不足以饱和色谱树脂容积的样品组分不能参与到排 代系列中，但是其改为在样品中主要组分之间和最后主要组分和排代剂
之间狭窄的过渡带中移动。这在图2中得到清楚地显示，过渡带被标以A、 B和C。尽管不受理论束绰，但这些痕量组分似乎不能完全参与到排代色 谱法中。在任何情况下，痕量组分从柱中解离，因此可以被检测、收集 和/或定量。
对应于这些过渡带的馏分的分离使得样品的痕量组分得到显著富集 (10-400X)，并且主要的一种或多种组分被显著地去除。这些结合使得 比原始样品更容易地鉴定和定量微量组分和杂质。可以通过任何适当的 方法进行这些富集样品的分析，包括对用于排代色谱法的同样树脂进行 洗脱色谱法。可选择地，如果收集足量的痕量组分，这些组分可以进行 排代色谱。该实施方案可以用于终产物分析、生物标记物的发现、方法 控制和方法优化。本文所使用的"痕量组分"是指在要进行排代色谱分析 的混合物中存在的相对微量的组分，每一种该痕量组分可以组成最初进 行本发明排代色谱法的混合物的约0.01 wt. %到约10 wt.%。
在下文的实施例中，提供了示范性的合成步骤，通过这些步骤可以 合成这些示范性的阳离子排代剂化合物。通过前述已知方法和/或本领域 技术人员可以理解的根据前述方法适当改变的方法可以合成本发明范围 内的其他适合的阳离子排代剂化合物。
下文的实施例都用于说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员 应该理解，接下来的实施例所公开的技术代表了发明人所发现的，在本 发明的实践中表现良好的技术，因此可以认为其组成了优选的实践模式。 但是，根据本发明的公开内容，本领域技术人员可以理解，对所公开的 特定实施方案可以进行许多变化，不脱离本发明精神和范围，仍然可以 获得相同或近似的结果，本发明仅由所附的权利要求的范围所限制。
实施例1: 1,1'-四亚甲基-2,2'- 二吡啶二溴化物(Tetraquat )、 DBQ的合成
基本上根据Perrine (J. Organic Chemistry, vol. 18, pp. 1137-1141 (1953))所描述，通过与两当量的二甲胺反应，将l， 3二氯-2-丙醇(DCP) 转变为1, 3-二 (N,N-二曱胺)-2-丙醇("BDAP")。之后立即蒸馏BDAP (146克，1摩尔)，并且将170ml的水加到与回流冷凝器匹配的圆底烧 瓶中。将N-(2-羟基-3-氯丙基)-N-苯曱基-N，N-二甲铵氯化物的水溶液(905 克@59.8%固体=541克=2摩尔)在3小时的时间内逐滴加入。在室温中 搅拌所生成的溶液11个小时。之后将溶液加热至5(TC,并保持该温度l 小时伴以持续搅拌，之后使其冷却至室温。生成的DBQ水溶液适宜于作 为固定相，例如阳离子交换介质上的排代剂化合物使用。可以通过旋转 蒸发去除水，然后从2-丙醇中重复沉淀，并最后在高度真空下去除溶剂， 回收也适宜用作排代剂化合物的固体DBQ 。
实施例2: 1,1'-三亚曱基-2，2'- 二吡啶二溴化物(Triquat )、 DMTQ的合成
使用通过滴定分析(四丁基碘化铵/高氯酸方法)含有72.9wt。/。活性 环氧物的缩水甘油基三甲基氯化铵(GMAC) (Aldrich, CAS # 3033-77-0)的 水溶液。在与回流冷凝器匹配的圆底烧瓶中强力搅拌约400 ml水中的二 甲胺盐酸盐(408克，5摩尔，Aldrich)溶液。在1小时内逐滴加入1040 克的GMAC溶液—758克活性=5摩尔)，没有外源的加热或冷却。该 加入不引起明显的放热。完成加入后，在室温中搅拌生成的溶液l小时。 在该点上开始另一个等量GMAC溶液(5摩尔)的加入。该加入引起强 烈的放热，继续加入GMAC溶液最后将使溶液回流。调整第二次GMAC 的加入率以控制放热。当完成加入时，搅拌溶液，并使其冷却。当温度 达到约7(TC时(约3小时后)，用由电子控制器(J-KemElectronics)控制的 加热套在70。C的调定点上进行外源加热。保持溶液在70。C约24小时。 等冷却至室温时，DMTQ溶液适合在合适的固定相，例如阳离子交换介 质上用作排代剂化合物。
实施例3: 1,1'-三亚甲基-2,2'- 二吡啶二溴化物(Triquat)、 TBTQ-A的合
成
在二丙醇中制备三胺N-[3-(二曱胺)丙基]-N,N',N'-三甲基-l,3-丙基二 胺，也被称为POLYCAT 77的储备液，通过在干燥N2下与CaHz—起 搅拌数天而干燥所述溶液。在与特氟隆涂覆的热电偶和橡胶隔板匹配的 250 ml、 3颈圓底烧瓶中注入107ml的这种滤液，其含有12.5克的 POLYCAT 77(0.06摩尔)，以及磁力搅拌棒。烧瓶充满氮气，并且在氮 气的正压下密封。在约3小时内通过注射泵经特氟隆针以恒定速率将千 基溴(35克，0.2摩尔，Aldrich)加入到被搅拌的烧瓶中。可发现温和的放 热，将内在温度升高至30。C。当完成苄基溴的加入时，将溶液以40-45。C 加热14小时，冷却至室温，在旋转蒸发器上蒸发成粘性油状物，在甲醇 中溶解，并用三份60ml的环己胺萃取，用碳脱色，过滤、蒸发以干燥生 成TBTQ-A白色固体。该物质适合在合适的固定相，例如阳离子交换介 质上用作排代剂化合物。
实施例4:敌草快(Diquat)、 BTA的合成
将DCP(80克，0.6摩尔)和40%三甲胺水溶液(188g⑥40wt。/。二75 克=1.27摩尔)注入与回流冷凝器匹配的500ml圆底烧瓶中。将混合物加 热至75。C,并保持该温度伴以强力磁力搅拌48小时。在时间结束时，使 清澈无色的溶液冷却到室温。BTA的收率> 98%。等冷却到室温，BTA 溶液适合在合适的固定相，例如阳离子交换介质上用作排代剂化合物。
实施例5:敌草快(Diquat) ,DBD的合成
在与热电偶匹配的500 ml、 3颈圓底烧瓶中注入千基溴(87克、0.5 摩尔、Aldrich)， 100 ml乙腈(HPLC级，Fisher),以及磁力搅拌棒，之后 在N2下将其密封。将经蒸馏的BDAP(35克，0.24摩尔)称重，并放入刻度 量筒，之后加入至60ml的另外的漏斗，用20ml的干燥乙腈冲洗。在80 分钟内逐滴加入生成的BDAP溶液。立即产生强烈的放热；继续加入緩 慢升高溶液温度至约45°C。在临近终点时，可以加快加入的速度以将温
度维持在约45。C。当完成BDAP溶液的加入时，在适当的位置加上加热 套并在55。C加热溶液3小时，之后70。C15小时。将溶液冷却到室温，转 移至回收烧瓶，并旋转蒸发至粘性液体。在丙酮/水中溶解所述液体，并 再次在旋转蒸发器上脱溶剂，获得122.7克(100%收率)的棕褐色固体 的DBD,基本上分析级的HPLC100o/()的纯度。该物质适合在合适的固定 相，例如阳离子交换介质上用作排代剂化合物。
实施例6:蛋白质混合物的排代色镨法
材料和设备.牛细胞色素C(Sigma，弁C3131 ，分子量12,327)和马细 胞色素C(Sigma, #C7752,分子量12，384)作为标准使用。通过HPLC分析， 它们各自大约为87%和约86%的纯度，并伴以剩余物是在280和430nm 吸收的被损害的细胞色素分子或异形体。所有其他的化学药品为ACS试 剂级，或者更好，都被作为标准使用，除非另有声明。緩冲溶剂为HPLC 级别的蒸馏水。装载/平衡緩沖液包括25 mM MOPSO (2-羟基-3-(N-吗啉 代)丙基磺酸)，用NaOH调整pH-7.0。用装载緩冲液稀释浓缩的储备液 至目标浓度制备排代剂溶液。所有緩冲液用氦气冲洗，使用前通过0.2 pm 滤器过滤。使用KnauerHPLC系统(典型K-1001泵，典型K-2600 UV 检测器，4-信道脱气装置，以及溶剂管理器)进行排代实验。使用Waters HPLC系统(典型600泵和控制器，典型996 PAD,和典型717+配有冷却 样品盘的自动取样器)进行组分分析。
柱制备.使用方法C (见下文)清洗和再生固定相，其为装载于6.0 x150 mm的柱上的Tosoh SP-5PW的阳离子交换树脂，之后在装载/平衡 緩沖液中以钠形式储存。柱输出通过在264nm监测的UV/Vis流式检测器， 传导性流槽和pH流槽。用装载緩冲液以0.17 mL/min的流速平衡色谱柱。 一旦所有的三个信号(UV吸收、传导率、pH)形成稳定的、水平的基 线(约25分钟、1 CV),立即开始排代实验。避免过长的平衡时间以不 将柱顶从钠形式转换成氬形式。
穿透实验.使用装载緩沖液中的牛细胞色素C和马细胞色素C的4 mM溶液，在0.1-0.5 mL/min之间的各种流速进行穿透实验。根据这些实
验发现，在0.17mL/min可以获得满意的、可重复性的数据。发现对于牛 细胞色素C的柱饱和量为148 mg (34.7 mg/mL基质)，对于马细胞色素C 的柱饱和量为150 mg (35.2 mg/mL基质)。
排代实验.在装载緩冲液中制备牛细胞色素C的溶液(4.12 mg/mL, Sigma #C3131 ，分子量=12,327)和马细胞色素C的溶液(4.10 mg/mL, Sigma #C7752，分子量=12,384)。使用BCA-Copper和Bradford方法进 行蛋白质浓度的测定。将等体积的两种细胞色素溶液进行混合，装填入 20.0 的样品回路，并以0.17 mL/min的恒定流速120分钟将其泵入已 经清洗和适当平衡的阳离子交换柱。将所述回路从入口流路转出，25分 钟内以0.17mL/min将装载緩冲液用泵力通过色谱柱。最后，将装载緩冲 液中的4.0 mM的DBQ排代剂溶液以0.17 mL/min泵入色谱柱上，柱输 出通过UV/Vis流式检测器(10iiL流槽，在264、 280、 430nm监测)进入 组分收集器。作为时间函数的UV/Vis检测器的输出在图1中再现。
在排代剂溶液开始流入柱中之后，大约70分钟内在柱流出物中没有 检测出蛋白物质，因此在该时间内没有收集组分。在排代剂开始流动后 约70分钟，收集组分l，以1分钟的间隔时间收集随后的组分。传导率 和pH流槽(见上文)通常在输出路径中位于UV/Vis检测器之后，以为 了监测排代实验的进程；但是，当收集组分时，将这两个槽转出流路， 以不加宽排代峰之间的过渡带。总共收集了 108个组分。 一旦收集到， 将组分密封冷藏用于随后的HPLC分析。排代实验在22。C的环境温度下 进行。
排代实验组分的HPLC分析.在排代实验中收集到的所有108个组 分进行HPLC分析以确定各个组分的含量。该分析的条件是
柱 不锈钢，4.6(1. D.)x200mm， PolySULFOETHYL A，基
于二氧化硅的强力阳离子交换基质，5nm粒度，300埃 孔径，由PolyLC (Columbia,马里兰州)生产。
緩冲溶剂 HPLC级蒸馏水
洗脱緩冲液 A - 25 mM NaH2P04，用NaOH使pH=6.8
B－500 mM NaCl + 25 mM NaH2P04，用NaOH使
流速
梯度方法
pH=6.8,洗脱緩沖液通过0.2 pm滤器过滤去除颗粒。
恒定在1.0mL/min。
0-2分钟 100% A,无梯度
2-62分钟 100% A至100% B,线性梯度 62-72分钟100% B,无梯度
UV检测器264nm-DBQ+总蛋白，
280nm-总蛋白， 430 nm-仅细胞色素蛋白
样品制备
将的组分样品和30 pi的新鲜制备的10 mM 1,4-二 硫苏糖醇(DTT)混合，将50 pi的混合物注射入色谱柱中。 通过分析HPLC峰的积分确定每一组分中的成分浓度。将结果编辑入图2 所显示的柱状图中。将纯化部分集中以获得表1所编辑的数据。从柱中 回收总蛋白的回收率为98%。
表1.使用排代剂DBQ进行排代色谱法的结果
纯化蛋白 牛细胞色素C 马细胞色素C
样品汇集 20-39 55-95 (早期+晚期)
HPLC纯度 >99.9% >99.9%
回收率 63.4% 78.3%
测量的DBQ: * ND(<6ppm) ND(<6 ppm)
估计的DBQ: * <0.5ppm 2.5 ppm
实施例7:蛋白质混合物的排代色镨法
材料和设备.牛细胞色素C(Sigma， #C3131 ,大约分析=89%)，以及 牛a-胰凝乳蛋白酶原A(Sigma， #C4879,大约分析=65%)作为标准-使用。 所有其他的化学药品为ACS试剂级，或者更好，都被作为标准使用，除 非另有声明。緩冲溶剂为HPLC级别的蒸馏水。装载/平衡緩沖液包括25 mM MOPSO (2-羟基-3-(N-吗啉代)丙基磺酸)，用NaOH调整pH = 7.0。 用装载緩冲液稀释浓缩的储备液至目标浓度制备排代剂溶液。所有緩冲
液用氦气冲洗,使用前通过0.2(am滤器过滤。使用KnauerHPLC系统(典 型K-1001泵，典型K-2600UV检测器，4-信道脱气装置，以及溶剂管理 器)进行排代实验。使用Waters HPLC系统(典型600泵和控制器，典型 996 PAD,和典型717+配有冷却样品盘的自动取样器)进行组分分析。
柱制备.使用方法C (见下文)清洗和再生色谱柱(Amersham Mono S, 5.0 x 200 mm)，之后在2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO,以NaOH调节4吏 pH=7.0的氯化钠緩冲液中以钠形式储存。柱输出通过在264nm监测的 UV/Vis流式检测器，传导性流槽和pH流槽。用装载緩冲液(见上文) 以0.20mL/min的流速平衡色镨柱。 一旦所有的三个信号(UV吸收、传 导率、pH)形成稳定的、水平的基线(约20分钟、1CV),立即开始排 代实验。避免过长的平衡时间以不将柱顶从钠形式转换成氢形式。
穿透实验.使用装载緩冲液中的牛细胞色素C和牛a-胰凝乳蛋白酶 原A的4.0 mg/mL溶液，在0.1-0.5 mL/min之间的各种流速进行穿透实 验。用25mMMOPSOP-羟基-3-(N-吗啉代)丙基磺酸)制备装载緩冲液， 用NaOH调节pH二7.0。在0.20 mL/min获得良好的、可重复性的数据。 对于牛细胞色素C的柱饱和量为约198mg(50.4mg/mL基质)，对于牛a-胰凝乳蛋白酶原A的柱饱和量为376mg (95.7 mg/mL基质)。在这些实验 中，未纯化的蛋白质直接从瓶中取出使用。
排代实验.在装载緩冲液(见上文)中制备牛细胞色素C的溶液(5.04 mg/mL, Sigma弁C3131)和牛a-胰凝乳蛋白酶原A的溶液(9.96mg/mL, Sigma弁C4879)。使用BCA-Copper和Bradford方法进行蛋白质浓度的测 定。将等体积的两种细胞色素溶液进行混合，装填入20.0 mL的样品回 路，并以0.40 mL/min的恒定流速60分钟将其泵入已经清洗和适当平4軒 的阳离子交换柱(见上文)。将所述回路从入口流路转出，20分钟内以 0.20mL/min将装载緩冲液用泵力通过色谱柱。最后，将装载緩冲液中的 4.0 mM的DBQ排代剂溶液以0.20 mL/min泵入色谱柱上，柱输出通过 UV/Vis流式检测器(10^L流槽，在264、 280监测)进入组分收集器。每 1.00分钟收集组分一次。传导率和pH流槽(见上文)通常在输出路径中 位于UV/Vis检测器之后，以为了监测排代实验的进程；但是，当收集组
緩冲溶剂 洗脱緩冲液:
流速 梯度方法:
分时，将这两个槽转出流路，以不加宽排代峰之间的过渡带。 一旦收集 到，将组分密封冷藏用于随后的HPLC分析。排代实验在22。C的环境温 度下进行。排代痕量显示在图3中。
蛋白质的HPLC分析.下文给出了 HPLC组分分析的详细内容。 柱 不锈钢柱，4.6x200 mm内径，由PolyLC (Columbia,马
里兰州)生产，PolySULFOETHYLA，基于二氧化硅的强 力阳离子交换基质 5pm粒度，300埃孔径 HPLC级蒸馏水 A-25mMNaH2P04,用NaOH使pH:6.8 B- 0.50M NaCl+25 mM NaH2P04，用NaOH使pH:6.8 洗脱緩冲液通过0.2 fim滤器过滤去除颗粒。 恒定在1.0 mL/min。 0-2分钟 100%A,无梯度 2-62分钟 100% A至100% B，线性梯度 62-72分钟100% B，无梯度 UV检测器波长264nm-DBQ+蛋白，
280 nm -蛋白，430 nm —细胞色素 样品制备 将50nl的样品混合物注射入色谱柱中。
通过上述方法，分析所有的125个收集样品，在图4和下表中显示 了从264 nm、 280 nm和430 nm获得的组合数据。自色谱柱的回收率几 乎是定量的(>97%)。 表2
纯化蛋白牛a-胰凝乳蛋白酶原A 样品汇集 30-50 HPLC纯度 〉99.9% 回收率 43.6 mg
主峰的66%
总蛋白的44%
牛细胞色素C 63-69， 80-93 >99.9% 23.6 mg 主峰的52% 总蛋白的47% 测量的DBQ: * ND(〈6ppm) ND(〈6ppm) 估计的DBQ: * <0.5ppm <0.5ppm
ND =未测出 *透析前
柱清洗和再生的歩骤.
可以使用以下的 一种或多种方法以清洗和/或再生在排代步骤中使用 的诸如DBQ的排代剂化合物的阳离子交换柱。"再生效率"表示为在完成 步骤后原始柱穿透容量恢复的百分比。在每一种方法中，根据列出的顺 序操作所述步骤，流速大约为0.64mL/min。
方法A:清洗+再生(再生效率98%)
2.0MKC1 + 0.1 MKOH180分钟27 CV*
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH20分钟3CV
15%冰醋酸27分钟4CV
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH20分钟3CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO， pH = 7.034分钟5CV
* cv =柱容量
方法B:只进行再生(再生效率95%)
2.0 M KC1 + 0.1 M KH2P04, pH = 6.5 200分钟 30 CV*
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH 20分钟 3 CV
2.0 M NaCl+25 mM MOPSO, pH = 7.0 34分钟 5 CV
*为获得100%的再生效率，可能需要100CV-150CV之间(过夜再生)
的柱容量。
方法C:清洗+再生(再生效率100%)
2.0 MKC1 +0.1 MKOH 80分钟 12CV
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH 20分钟 3CV
1.5MBaCl2 20分钟 3CV
0.1 MKH2P04,pH = 6.5 w/KOH 20分钟 3CV 15%醋酸+ 25 mM 18-冠-6 27分钟 4CV
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH 20分钟 3CV
2.0 M NaCl+ 25 mM MOPSO, pH = 7.034分钟 5CV
方法D:清洗+再生(再生效率100%)
2.0MKC1 + 0.1 MKOH80分钟12CV
0.1 M MOPS, pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
1.5M CaCl227分钟4CV
0.1 M MOPS， pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
0.1 M Na2H2EDTA， pH = 8.0 w/NaOH20分钟3CV
0.1 M MOPS， pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
15%冰醋酸27分钟4CV
0.1 M MOPS, pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH = 7.034分钟5CV
方法E:只进^f亍再生(再生效率100%)
2.1 MKC180分钟12CV
0.1 M MOPS， pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
1.5M CaCl227分钟4CV
0.1 M MOPS， pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
0.1 M Na2H2EDTA, pH = 8.0 w/NaOH*20分钟3CV
0.1 M MOPS, pH = 7.2 w/NaOH20分钟3CV
2.0 M NaCl+ 25 mM MOPSO， pH = 7.034分钟5CV
*可以在该步骤中使用0.1 M柠檬酸三钾(K3Citrate) ,pH = 7.0。
方法F:清洗+再生(再生效率100%)
2.0 MKC1 +0.1 MKOH 80分钟 12 CV
0.1 M KH2P04, pH = 6.5 w/KOH 20分钟 3 CV
2.0 M BDAP* + 50 mM醋酸， 34分钟 4 CV
pH = 4.6 w/ HC1
1 M KH2P04， pH = 6.5 w/KOH20分钟3CV
2.0MKC1 + 0.1 MKOH20分钟3CV
0.1 M KH2P04， pH = 6.5 w/KOH20分钟3CV
15%冰醋酸27分钟4CV
0.1 M KH2P04， pH = 6.5 w/KOH20分钟3CV
2.0 M NaCl+ 25 mM MOPSO， pH = 7.034分钟5CV
*BDAP是1,3-双(二曱胺)-2-羟基丙烷。除了 BDAP,基于成本和/或可行
性的考虑，根据需要可以取代以下的胺1 ,3-二氨基-2-羟基丙烷；1,3-双(二曱胺)丙烷；双(3-氨丙基)胺；[双(3-(二甲胺)丙基)]氨基甲烷；1 -[双 (3-(二甲胺)丙基)]氨基-2羟基丙烷；以及l,3-二氨基丙烷。
方法G:清洗+再生(再生效率100% )
2.0 M [(Me3NCH2)2CHOH]Cl2 80分钟
+ 0.1 M[Me4N]OH 0.1 M KH2P04, pH=6.5 w/KOH 20分钟
1.5MBaCl2 20分钟
0.1 M KH2P04， pH=6.5 w/KOH 20分钟
15%醋酸 27分钟
+ 25mM 18-冠-6 0.1 M KH2P04， pH=6.5 w/KOH 20分钟
2.0MNaCl 34分钟
+ 25 mM MOPSO， pH=7.0
12 CV
3CV 3CV 3CV 4CV
3CV 5CV
方法H:只进行再生(再生效率99%)
2.0 M [(Me3NCH2)2CHOH]Cl2 160分钟 24 CV
+ 0.1 M H3P04, pH=6.5 w/[Me4N]OH 0.1 M KH2P04, pH=6.5 w/KOH 20分钟 3 CV
2.0 M NaCl + 25 mM MOPSO, pH=7.0 34分钟 5 CV
方法I:只进4于再生(再生效率99%)
2.0 M KBr+0.1 M KH2P04, pH=6.5 w/ KOH 180分钟 27 CV
溶剂=80/20 v/v水/乙腈 0.1 M KH2P04, pH=6.5 w/ KOH 20分钟 3 CV
2.0 M NaCl+ 25 mM MOPSO， pH=7.0 34分钟 5 CV
本领域技术人员根据本发明，基于其知识，不需要过度的实验，可 以制备和实施本文所/>开和要求的所有组合物和方法。在#4居特定优选 实施方案对本发明的组合物和方法进行描述时，不脱离本发明的概念、 精神和范围，对组合物和/或方法以及在步骤上和步骤的顺序上进行政动 对于本领域技术人员而言是显而易见的。更具体地，可以用化学上或物 理上相关的某些因素替代本文所描述的因素，同时可以达到相同或近似 的结果。所有这些对于本领域技术人员是显而易见的近似的替代和修正 被认为是在由权利要求所限定的本发明的概念、范围和概念之内。另夕卜， 本文所描述的任意的或全部的实施方案的所有可能组合也被认为落在本 发明的范围之内。
权利要求
1.一种排代色谱方法，其包括将含有一种或多种待分离的组分的混合物加载到适合的固定相之上；通过将含具有通式(I)的排代剂化合物的混合物加入至固定相，以从固定相中排代一种或多种组分中的至少一种其中，每个R1、R2、R3、R′1、R′2和R′3基团各自独立地选自烷基、芳基和芳烷基，并且在其中，可以通过任意一个或多个的R1和R2、R1和R′1、R1和R4、R4和R′4、或R4和R5形成含有一个或多个季氮原子的环；每个R4、R′4、R5和R′5基团各自独立地选自烷基、芳基、芳烷基和-(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-，其中，R1、R2和R3如上所定义；每个Y独立地选自-H、-OH、-OR6、卤素、烷基、芳基和芳烷基，其中-R6可以是烷基或-(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R1R2R3An-，其中，R1、R2和R3如上所定义，并且一个或多个的Y是通过一种或多种电磁方法可检测到的基团；每个q和z，各自独立地可以是从0到大约6中的任意整数，条件是q+z等于或小于大约6；每个a、b和c各自独立地可以是从0到2中的任意整数，条件是任何片段中的a+b+c的总和至少为1；以及每个An-独立地可以是为获得中性化合物所需要的一个或多个有机或无机的、单价或多价阴离子。
2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述固定相为阳离子 交换材料。
3. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述一种或多 种组分包括一种或多种多肽， 一种或多种蛋白质或者其中任意两种或多 种的混合物。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白 质具有约5kD或更高的分子量。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合物中的蛋白 质和/或多肽以馏分从固定相被排代出，其中所述蛋白质和/或多肽被充分 富集和/或从其他的蛋白质和/或多肽组分中充分分离出所述蛋白质和/或 多肽。
6. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物包 括两种或多种蛋白质、两种或多种多肽或者它们的混合物。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合物中的蛋白 质和/或多肽以馏分从固定相被排代出，其中所述蛋白质和/或多肽被充分 富集和/或从其他的蛋白质和/或多肽组分中充分分离出所述蛋白质和/或 多肽。
8. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物包 括至少两种待分离的组分。
9. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物包 括至少 一种组分和至少 一种杂质。
10. 根据任一前述权利要求所述的方法，其进一步包括当排代剂化 合物从固定相出现的时候对其进行检测的步骤，其中通过UV/可见光吸 收光谱学、荧光发射光谱学、质谱学、pH、传导率和一种或多种电化学 方法中的 一种或多种方法进行;险测。
11. 根据任一前述权利要求所述的方法，其进一步包括再生所述固 定相。
12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述再生包括用碱 金属氢氧化物、碱金属盐、碱土金属氢氧化物、碱土金属盐、有机酸、 烷基磺酸、季铵碱、季铵盐和烷基胺中的一种或多种的溶液处理固定相， 其中所述溶液进一步包括适合的pH緩冲液。
13. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述再生包括用含 有水和有机助溶剂的溶液处理所述固定相。
14. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为DBQ。
15. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为DMTQ。
16. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为DBTQ。
17. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为TBTQ-A。
18. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为BTA。
19. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述排代剂 化合物为DBD。
20. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种天然或重组的抗体，或者这种抗体的任意两种或多种的 混合物。
21. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种天然或重组的酶，或者这种酶的任意两种或多种的混合 物。
22. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种天然或重组的用于诊断的蛋白质和/或多肽，或者这种蛋 白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
23. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种天然或重组的用于人或动物治疗的蛋白质或多肽，或者 这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
24. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种天然或重组的动物或人血浆的一种或多种蛋白质或 多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
25. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种天然或重组的植物材料的一种或多种蛋白质或多 肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
26. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种动物乳或人乳或来自重组动物乳的一种或多种蛋白 质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
27. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种天然或重组的禽蛋的一种或多种蛋白质或多肽，或 者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的混合物。
28. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种天然或重组的细菌、酵母菌、真菌、病毒或昆虫的 一种或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种 的混合物。
29. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括来自一种或多种天然或重组的哺乳动物细胞培养物或动物组织的一 种或多种蛋白质或多肽，或者这种蛋白质和/或多肽的任意两种或多种的 混合物。
30. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种有机化合物、药物或药物中间体，或者其中任意两种或 多种的混合物。
31. 根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述一种或多种有 机化合物、药物或药物中间体的一种或多种为手性化合物。
32. 根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述混合物 包括一种或多种痕量组分，并且所述方法进一步包括一种或多种检测、 收集或定量混合物中痕量组分的方法。
33. —种用于排代色谱法的排代剂组合物，其位于适合的水溶液中， 包括具有通式(I)的排代剂化合物<formula>see original document page 6</formula>(I)其中每个R1、 R2、 R3、 R'1, R'2、和R'3基团各自独立地选自烷基、芳基和 芳烷基，并且在其中，可以通过任意一个或多个的R1和R2、 R1和R'1R1和R4、 R4和R'4、或R4和R5形成含有一个或多个季氮原子的环；每个R4、 R'4、 R5和R'5基团各自独立地选自烷基、芳基、芳烷基和-(CH2)a-(CHY)b-(CH2)c-N^iR2R3An-,其中，R1, R2和R3如上所定义； 每个Y独立地选自-H、 -OH、 -ORe、闺素、烷基、芳基和芳烷基，其中-R6可以是烷基或-(CH2)a-(CHOH)b-(CH2)c-N+R4R2R3An—，其中，R!、R2和Rs如上所定义，并且一个或多个的Y是通过一种或多种电磁方法可检测到的基团；每个q和z,各自独立地可以是从0到大约6中的任意整数，条件 是q + z等于或小于大约6;每个a、 b和c各自独立地可以是从O到2中的任意整数，条件是任 何片段中的a+b+c的总和至少为1;以及每个An一独立地可以是为获得中性化合物所需要的一个或多个有机 或无机的、单价或多价阴离子。
34. 根据权利要求33所述的排代剂组合物，其特征在于，所述排代 剂化合物不是DBQ、 DMTQ、 DBTQ、 BTA和DBD。
35. 根据权利要求33所述的排代剂组合物，其特征在于，所述排代 剂化合物具有如下结构<formula>see original document page 7</formula>
全文摘要
一种排代色谱法，以及用于该方法的排代剂化合物，其具有通式(I)，其中，每个R₁、R₂、R₃、R′₁、R′₂和R′₃基团各自独立地选自烷基、芳基和芳烷基，并且在其中，可以通过任意一个或多个的R₁和R₂、R₁和R′₁、R₁和R₄、R₄和R′₄、或R₄和R₅形成含有一个或多个季氮原子的环；每个R₄、R′₄、R₅和R′₅基团各自独立地选自烷基、芳基、芳烷基和-(CH₂)_a-(CHY)_b-(CH₂)_c-N⁺R₁R₂R₃An^-，其中，R₁、R₂和R₃如上所定义；每个Y独立地选自-H、-OH、-OR₆、卤素、烷基、芳基和芳烷基，其中-R₆可以是烷基或-(CH₂)_a-(CHOH)_b-(CH₂)_c-N⁺R₁R₂R₃An^-，其中，R₁、R₂和R₃如上所定义；每个q和z，各自独立地可以是从0到大约6中的任意整数，条件是q+z等于或小于大约6；每个a、b和c各自独立地可以是从0到2中的任意整数，条件是任何片段中的a+b+c的总和至少为1；以及每个An^-独立地可以是为获得中性化合物所需要的一个或多个有机或无机的、单价或多价阴离子。
文档编号G01N30/96GK101346166SQ200680048699
公开日2009年1月14日 申请日期2006年10月23日 优先权日2005年11月4日
发明者巴里·海莫尔, 查尔斯·利特尔, 维克托·万德佩斯 申请人:塞克姆公司