专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器以及一种用于测定样品中目的靶分子的方法。
背景技术：
生物传感器本质上必须非常敏感，即其必须能检测靶的非常低的表面 覆盖度，优选检测到低于每平方微米一个分子。当目的样品与具有含能结 合目的耙分子的探针的生物识别表面的生物传感器接触时，在适当的温育 条件下靶分子将结合所述探针。如在生物传感器中使用的大部分现有的生物识别表面是不可移动的。这些静态传感器是平的(R. Ekins, J. Clin. Lig Assay, 1996, 19(2)， 146-156， US5432099)、包含突出物(W02005022151, US2005100947)或者是多孔的(Benoit等，—Anal.Chem—73， 2412-2420 (2001); Kessler等，J, Clin. Microbiol, 2004， 42(5)， 2173-2185)。在后一种情况下，待 分析的液体通过基质被吸入。
对于试验的最大敏感度，重要的是在给定的温育时间内将尽可能多的 靶分子结合生物识别表面的元件。基质对靶的吸附速率依赖于表面的"反 应性"或亲和力以及靶分子到表面的质量传递性质。可将结合速率描述为 r(on)-k(on)[T][S]，其中[T]等于靶浓度，[S]表面探针浓度以及k(on)等于结合常数。质量传递性质通过扩散速率确定r(diff)= D*d[T]/dx以及对流速率r(conv)=v*σ*ω* [T]，其中D为T的扩散系数，σ为耗尽层厚度，v 为流速以及ω为传感器宽度。当结合速率高于质量传递速率，即当不能足 够快速地补充耗尽层以及探针不能与待测定的样品中的靶分子达到充分的 连接时，吸附速率变得为扩散限制性。当靶的表面亲和力高(k(on)大)，或 当在目的样品中存在低的靶浓度(一般在生物学样品或临床样品情况下)时， 靶分子结合表面的速率将变得为扩散限制性。然而，当吸附动力学为反应 限制性时，生物传感器达到最大的性能和速度。
尤其是从US 4956149中已知这种器件，在US 4956149中，描述了包 含彼此连接的传感器和压电驱动器的生物传感器。所述传感器为由固定在 膜中并置于场效应晶体管的门极上的葡萄糖氧化酶形成的葡萄糖传感器。 所述传感器被浸渍在样品中以测定待检测的可能物质(在这种情况下为葡 萄糖)。通过驱动该压电元件，所述样品被激动，与非激动样品相比，信号 输出增强。然而，在这个器件中，所述传感器和驱动元件为两个不同的元 件。当操作时，压电驱动器在液体中不移动，仅包含分析物和/或检测体的 液体移动。在其中微型化高速进展的领域这是一种不同的方法和技术缺点， 因此优选例如在US 6068751描述的可以将全部组件整合到微流体性系统 中。
发明内容
本发明的一个目的是提供改进的生物传感器，其中传感器的吸附动力 学极大增强，并且优选超出扩散的限度。本发明的又一目的是提供包含能 实际上捕获待检测的靶分子的整合的生物识别元件的驱动器。本发明人己 经发现当使用包含(聚合物)驱动元件结合生物识别元件的生物传感器时可 以达到这个目的。因此所述传感器的驱动元件包含可以结合来自目的样品 的靶分子的生物识别元件(的阵列)。
一方面，本发明涉及一种具有包含能结合来自目的样品的靶分子的生 物识别元件的驱动元件的生物传感器，其中所述包含聚合物材料的驱动元 件可通过驱动装置在第一和第二位置之间被驱动。
又一方面，本发明涉及一种检测目的样品中的靶分子的方法，所述方
法包括使用本发明的生物传感器。
由下文描述的实施方式，本发明的这些和其他方面将显而易见，并参 照所述实施方式进行描述。
在附图中，图1为本发明的生物传感器的侧面示意图。图l(a)为静止位 置，在正常操作下，可能为开始位置以及其中发生捕获靶分子检测的位置 的传感器的模式图。图l(b)为处于垂直于样品液体流动的驱动位置并积极捕获靶分子的传感器的模式图。观察到在这种情况下仍可进行检测。例如当 装置的焦点深度大于驱动元件的净位移时的光学检测。
具体实施例方式
图1示出了本发明的生物传感器的侧面示意图。图l(a)公开了在第一(非 驱动)位置具有生物识别表面元件(3)的具有驱动(聚合物)传感器元件(2)的 生物传感器(l)的实施方式。当与包含多种靶分子(4)的样品流(5)接触时，所 述驱动元件2可从第一位置(a)移动到第二(驱动)位置(b)，从而通过改善的 吸附动力学，g卩，反应限制性而不是扩散限制性获得改善的传感器敏感性 以及获得更好的洗液效率。
所述驱动元件可以由具有其上粘附生物识别表面的柔性材料的薄片 (flap)或柱(beam)组成。所述材料优选为柔性聚合物。在静止状态下，所述 薄片为水平位置。可通过如温度、光、电场或(电)磁场的特定刺激物将所述 薄片设定为移动。优选使用磁场，最优选使用电磁场。当所述传感器被驱 动时，所述薄片被移动到第二位置以与液体样品改善接触，并且所述表面 可探入所述液体探测靶分子。通过将薄片移动到第二位置，随着到达表面 的扩散距离的降低，与液体样品活性接触的面积大大增加，以及吸附动力 学通过驱动移动而增加。在一次测定中可重复移动以进一步改善与样品液 体的接触。
因此在本发明的一方面，提供了一种具有包含能结合来自目的样品的 耙分子的生物识别元件的驱动元件的生物传感器，其中所述驱动元件可以 通过驱动装置在第一和第二位置之间被驱动。所述活化元件可以优选为可 逆连接。在特定实施方式中，所述驱动元件包含和优选由聚合物驱动元件 组成。所述材料是本领域已知的，如橡胶和弹性体(例如聚硅氧烷)、热塑性 弹性体(如聚酯和聚醚酯或聚醚聚氨酯)、交联聚合物和(水)凝胶、光聚合物， 如有或无介观有序元件的聚(甲基)丙烯酸酯。其他实例为由堆叠导电 (stacked conductive)和聚合物膜结合组合物具有分散磁性(纳米)颗粒的聚合 物材料(如Fe304纳米颗粒)组成的复合材料结构。(参见例如D丄Broer 等，Smart Materials. Chapter 4 in True Visions: Tales on the Realization of Ambient Intelligence, Emile Aarts禾口 Jose Encamacao编著,Springer Verlag,2005，或G.N.Mol等，Adv,Funct.Mat—15, 1155-1159(2005))。申请人共同 未决的专禾U申请"Microfluidic system based on actuator elements"中也描述 了聚合物驱动微元件。这些材料已知能在特定刺激物下显著变形，因此可 以作为优选的驱动聚合物材料。通过使用聚合物驱动元件，可以得到很大 的形状变化，其允许更柔性的设计。在驱动元件中生物识别元件的整合消 除了如压电元件的外部驱动器的需要。
所述生物识别元件的表面层可以为具有其上设置有结合剂(也称为探 针)的单层或多层。所述生物识别元件也可以例如通过将珠移植到驱动元 件，包含粘附在驱动元件的微珠。所述珠优选为聚合物珠。可选择地，所述生物识别元件可以粘附在驱动元件的片或板的形式，其用结合剂(或探针)点的阵列进行点样。可以将探针设计成可逆或不可逆地结合靶分子。
在一个优选的实施方式中，所述生物识别元件为多孔的。在某些实施 方式中，所述探针位于多孔元件的孔中。根据其分子大小，多孔生物识别 元件的使用可以将探针带到支持物的孔中，在所述孔中其暴露于待确定其 浓度的靶分子，可以同样受到孔的几何形状的影响。当所述驱动元件被驱 动到第二位置时，通常其基本上与样品流的方向垂直，液体将流过多孔元 件。在多孔元件的孔中可以容易地捕获到待检测的靶分子。
所述表面或孔可以装有用于特异性捕获靶分子的探针。可以通过已知 的方法尤其是来自生物技术微阵列(DNA-芯片)的例如来自Affymetrix、 Agilent、 GE healthcare、 Metrigenix、 Pamgene、 Dow Corning等的方法在所 述表面或孔中提供所述探针。通常这种探针可以选自包括抗原、半抗原、 抗体、抗体片段、DNA、 PNA、 LNA或RNA序列或其组合、可以与细胞 受体反应的化学品、酶、蛋白质、(寡或多)肽、螯合物、适体、纳米体 (nanobody)。可选择地，根据驱动元件的材料，人们可以选择或合成对探针 具有高结合能力的材料。例如，人们可以使用能结合DNA探针的正电荷材 料。可选择地，人们可以使用可以用于将探针分子化学锚定到基质的具有 特异反应性基团(如羧酸、环氧化物、胺、巯氢等)的材料。还可选择地，人 们可以在驱动材料上涂敷对探针具有高结合能力的涂层，从而使例如驱动 性质(整批材料)与特异性表面性质(涂层)组合。这些材料、其化学性质和其 合成方法用于此目的对本领域技术人员是广泛己知的，并且本领域技术人员可以在其中毫不困难地选择。
所用的探针可以为不同特异性的探针，也就是说对不同靶分子特异性 探针，或者其两种或更多种可以为具有相同特异性但具有不同亲和力的探 针，也就是说对相同靶分子为特异性但是对于其反应具有不同的平衡常数
K。后者的选择特别用于在未知样品中待分析的分析物浓度可以在相当大的 范围内变化，例如2或3个数量级的情况，如在怀孕妇女的尿中HCG测定 可以在0.1 100或更高IU/ml变化的情况。
所用的探针优选为抗体或其功能部分，更优选为单克隆抗体或其功能 部分。生物学液体的多种成分的单克隆抗体是市售可得的或可以通过已知 的技术制备。所用的抗体可以表现常规亲和常数，例如108或109升/摩尔 上升，例如以l(T或l()U升/摩尔的级数上升，但是也可以使用具有亲和常 数为1012 1013升/摩尔的高亲和力抗体。本发明可以使用本身未标记的这 样的探针，但是不限于此。
所述探针可以以用于将探针涂敷到如试管的支持物的已知或常规使用 的任何方式涂敷到生物识别元件，例如通过使支持物上各间隔分离位置接 触例如在1自2的点上0.5微升的小滴形式的结合剂溶液，并将小滴洗去 之前使其保持接触一段时间。也可以使用其它生物印刷或压纹技术。当使 用例如喷墨印刷时可以涂敷较小的小滴体积。几皮升至几纳升的小滴体积 是本领域的状态并导致点直径一般在10 500Min的范围，从而允许在小(驱 动)基质上存在大量(不同)捕获点。
所述靶分子优选选自包括DNA、 RNA、蛋白质、肽、抗体、细胞、电
解质、酶、药学活性化合物、有机分子或其代谢物的组。基于待检测的目 的靶分子的选择，可以设计其检测探针。例如对于检测例如体液中的抗体 的化合物存在、不存在或数量，探针的设计基于结合所述抗体的抗原或其 片段。在检测特异性DNA序列的情况，例如遗传性障碍的情况下，可以以 探针的形式设计互补核苷酸序列并用于本发明的器件中。
本发明可以用于测定生物学液体中存在的靶分子，所述生物学液体例 如如血液、血清、唾液或尿液的人体液。其也可来自动物、植物或食物来 源或来自污物、生物学废弃物、洗涤液等。它们可以用于测定液体样品中 天然存在或可以人工存在的许多激素、蛋白质、酶或其它分析物，如药物、
毒药、重金属等，所述样品可以在与生物传感器接触前进行预处理，即在接触生物传感器之前，可以在样品上进行如免疫学测定或PCR测定的某些测定，或者可以对样品进行分离或纯化。在这个实施方式中，所述生物传感器作为给定测定的检测平台。
例如，本发明可以用于提供一种器件，所述器件用于定量测定与妊娠和生殖相关的许多激素，如FSH、 LH、 HCG、催乳素和类固醇激素(例如孕酮、雌二醇、睾酮和雄烯二酮)，或与肾上腺垂体轴相关的激素，如皮质醇、ACTH和醛固酮，或甲状腺相关激素，如T4、 T3和TSH以及其结合蛋白TBG，或者病毒，如肝炎、AIDS或疱疹病毒，或者细菌，如葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、月市炎球菌(pneumococci)、淋球菌(gonococci)和肠球菌(enterococci)，或者真菌，如念珠菌(Candida)或者肿瘤相关肽如AFP或CEA，或者药物，如作为不法运动员性能改进剂禁用的药物，或者食物污染物。在各情况下，所用的探针对待测定的靶分子是特异 的(与样品中的其他物质比较)并且可以为单克隆抗体或其单链DNA探针。
在某些实施方式中，所述液体可以为洗液，例如来自缓冲液或离液测 试用剂(reagentia)，并且可以包含去污剂。当可活化(actuable)表面用于与检 测上文描述的靶分子的相同原因时，可以更有效地进行洗涤。优选包括洗 涤以除去或降低可以来自非特异性吸附分子的本底信号，或又来自包含所 述分子的液体的干扰。
所述传感器可进一步包含优选依赖于表面敏感检测技术的检测器。其 实例包括基于表面结合发光分子或反射分子(例如金属)或干涉层结构，使用 (巨)磁电阻(GMR)传感器、隐失波检测(表面细胞质基因组反响)或激发，或 隐失波激发(波导荧光)、阻抗传感器、光学传感器。
在所述传感器中代表靶分子浓度未知的样品中探针占据的信号可以参 照由包含已知浓度的相同的靶分子的标准样品获得的剂量反应曲线而校 准。在各靶分子在一些标准样品中存在时，这种标准样品不必一起包含所 有靶分子。
根据检测技术的性质，所述检测器优选位于生物传感器(l)中或其附近。 根据检测技术，可从驱动基质的下面或上面读出信号。例如，当使用GMR 传感器时，优选在靶分子能吸附到生物识别元件的表面或孔中，驱动器返回到用于检测吸附的靶分子的第一位置后。根据使用的检测技术，实际的元件或其表面的尺寸可以变化。例如在GMR传感器的情况下，聚合驱动 器的厚度可以优选大约0.2-大约5微米。在隐失波传感器的情况下， 一般 可以使用大约0.1-1微米的驱动器，而阻抗传感器可以需要低于0.2微米的 厚度。当从上面进行读出和激发时，例如具有传播波的荧光分子的激发和 具有相同光路的发光的检测，聚合物层的厚度应当优选其覆盖装置的焦点 深度。可以设计使得由驱动移动引起的位移仍然在光学系统的焦点深度内。
本发明的装置优选用于微流体，以及现在描述的方法结合了具有流动基质的层流微流体和表面敏感检测。
在本发明优选的实施方式中，所述驱动器包含多个(也称为阵列)生物识 别元件，其中各生物识别元件能够结合、优选独立地结合不同的靶分子， 从而同时鉴别一个样品中的多种不同的靶分子。在可选择的实施方式中， 在样品流中将一组带有多种靶分子的生物识别元件的驱动器并排或顺序设 置以在一次运转中捕获多种靶分子。
本发明又一方面涉及一种检测目的样品中的靶分子的方法，所述方法包括步骤
使目的样品基本上与如上所定义的生物传感器接触；
将所述聚合物驱动元件从第一位置驱动到第二位置；
使靶分子结合所述生物识别元件；
任选地，将所述驱动元件从第二位置驱动到第一位置；以及
检测所述生物识别元件上靶分子的存在、不存在或量。
本发明的器件优选用作选自分子诊断学、环境监测和药物筛选的优选领域的生物传感器。
权利要求
1、生物传感器(1)，具有包含能结合来自目的样品中的靶分子(4)的生物识别元件(3)的驱动元件(2)，其中所述驱动元件(2)，其包含聚合物材料，可以通过驱动装置在第一和第二位置之间被驱动。
2、 根据权利要求1所述的生物传感器(l)，其中所述生物识别元件(3) 包含能结合靶分子的表面。
3、 根据权利要求1或2所述的生物传感器(l)，其中所述驱动元件(2) 由磁场和/或电场、光或温度启动。
4、 根据权利要求1-3中任一项所述的生物传感器(l)，其中所述传感器 进一步包含使用表面敏感检测或激发技术的检测器。
5、 根据权利要求1-4中任一项所述的生物传感器(l)，其中所述检测器 位于所述驱动元件(2)的对面，使得当所述驱动元件(2)位于第一位置时，可 以测定靶分子(4)的存在、不存在或量。
6、 根据权利要求1-5中任一项所述的生物传感器(l)，其中所述靶分子 (4)选自包括DNA、 RNA、蛋白质、肽、抗体、电解质、药学活性化合物、 有机分子或其代谢物的组。
7、 根据权利要求1-6中任一项所述的生物传感器(l)，其中所述驱动元 件(2)包含多个生物识别元件(3)，其中各生物识别元件(3)能结合不同的靶分 子(4)，从而同时鉴别样品中多种不同的靶分子。
8、 根据权利要求1-7中任一项所述的生物传感器(l)，其中所述目的样 品来自人，如唾液、痰、血液、粪便、尿；动物；植物；食物；污物；生 物学废物；洗液来源。
9、 用于检测目的样品中的靶分子(4)的方法，所述方法包括步骤-使目的样品与权利要求1-8中所定义的生物传感器(l)接触；-将所述驱动元件(2)从第一位置驱动到第二位置；-使靶分子(4)结合所述生物识别元件(3);-检测所述生物识别元件(3)上靶分子(4)的存在、不存在或量。
全文摘要
本发明涉及一种生物传感器，其具有包含能结合来自目的样品的靶分子的生物识别元件的驱动元件，其中，所述驱动元件包含聚合物材料，可以通过驱动装置在第一和第二位置之间被驱动。
文档编号G01N33/543GK101346627SQ200680048985
公开日2009年1月14日 申请日期2006年12月20日 优先权日2005年12月23日
发明者H·R·施塔伯特, J·M·J·登东德, R·J·M·施罗德斯 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司