专利名称：：一种检测土壤硝酸还原酶活性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中硝酸还原酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中硝酸还原酶活性的分析方法。技术背景土壤中的硝酸还原酶能将土壤氮代谢过程中形成的硝态氮还原生成亚硝态氮，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。硝酸还原酶N03—-N-N0「-N+2H因此，土壤中硝酸还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的气态损失，间接影响氮肥的利用效率和大气的氮污染。土壤中硝酸还原酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同种植作物的影响。因此，对土壤中硝酸还原酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关硝酸还原酶活性的测定基本都是参照①.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》和Kandeler(1995)的《Methodsinsoilbiology》等书中的方法。该种方法步骤比较繁瑣，需用专用的试剂瓶和抽滤装置进行抽真空培养，且培养批次的不同具有差异性和不确定性，使其难以适应土壤中硝酸还原酶活性的定性比较和定量研究；同时，该种方法样品的前期处理比较麻烦，降低了实验的效率，增加了实验结果的不准确性。
发明内容本发明的目的在于提供一种检验土壤中硝酸还原酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对硝酸还原酶活性的测定步骤和显色方法进行了部分改进(对其样品的处理方法和测定方法进行改进)，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为一种检测土壤中硝酸还原酶活性的分析方法，1)称取0.5-lg过0.5-1.5mm筛的土壤风干样品n份分别装入n支试管中，n>2，向试管中分别加入1-3mL0.5-lmM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勾；然后向其中n-l支试管中加入1-1.5mL重量浓度0.05-0.15%的底物KN0r溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；再向试管中分别加入l-2mL重量浓度0.5%-1%的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10mL，摇匀，塞上不透气的橡胶塞后29-3rC恒温培养24h;同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；2)培养结束后，用10-40mL蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100mL的三角瓶中，再用蒸馏水补充至50-100mL;3)加入铝钾矾饱和溶液l-2mL,振荡，过滤；4)取滤液lmL于50mL容量瓶中，加入1-3mL蒸馏水和4-8mL显色剂(相对于亚硝酸根离子过量)，然后用蒸馏水定容至刻度。15分钟后，在520nm下用分光光度计比色测定吸光值A;5)标准工作曲线的制备吸取亚硝酸根标准储备液].mL,定容至100mL,此为2.5mgN0广N/L的溶液。再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于50mL容量瓶中，加少量蒸馏水和4mL显色剂，并用蒸馏水定容。此标准系列含亚硝态氮的量分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgN(V-N/L。在520nm下比色测定一系列已知浓度的NO广N标准溶液的吸光值A'，以N02--N溶液的浓度和吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b;6)根据吸光值A和斜率b,计算所测定溶液中亚硝酸根的浓度S，S=A*b;7)计算样品中亚硝酸根含量；8)计算硝酸还原酶活性计算公式为[(S「S2)承50承V/1000承V2]/W.T=mgNO厂N/g土.24h式中S,为样品中的N02-N的含量(mg/L);S2为样品对照中的N02-N的含量(mg/L);50为定容的溶液体积(mL);V,为提取液总体积(mL);V2为吸取滤液的体积(mL);W为称土样重(g);T为培养土样的时间(h);IOOO为单位转化系数。对于酸性土样品，分析前应调解其PH为7-8.5，可采用加入碳酸钙的方法调解，每支试管中分别加入15-25mgCaC03,混匀后再向试管中分别加入1-3mL0.5-lmM/L的2,4-二硝基酚溶液，混匀。(对于石灰性土壤而言，碳酸钙无需加入，因为土壤本身的PH值即可以满足微生物的最适pH)。厌氧培养所使用的蒸馏水，使用前，需将其加热至沸腾驱除水中的02,然后封闭冷却至室温。所述显色剂为重量浓度35%的醋酸配制的重量浓度0.154的a-萘胺溶液和重量浓度0.5%的对氨基苯磺酸溶液等体积的混合液，而它们的加入相对于亚硝酸根为过量的。本发明方法改进的依据土壤硝酸还原酶与亚硝酸还原酶、土壤羟胺还原酶一样都是参与土壤中氮素代谢的还原酶类。它们在测定过程中均需要厌氧培养条件。亚硝酸还原酶活性的测定方法则是以亚硝酸钠(NaN02)为底物，经过24小时厌氧培养，通过单位时间内N021的减少量来表征；羟胺还原酶活性的测定则是以羟胺(NH力H)为底物，经过5小时厌氧培养，通过单位时间内羟胺的减少量来衡量羟胺还原酶的活性。与此相同，本方法中硝酸还原酶活性测定则是以硝酸钾UN03)为底物，通过加入2，4-二硝基酚抑制亚硝酸还原酶的活性，经过24小时的厌氧培养，通过检测单位时间内N02—-N的生成量来表征硝酸还原酶的活性。加入5-10mL排除溶解氧的液封，目的就是为培养试验创造良好的厌养环境。本发明所使用的反应原理为利用硝酸钾为底物，土样在厌氧条件下，3(TC恒温培养24h。亚硝酸还原酶通过加入2，4-二硝基酚抑制。在硝酸还原酶的作用下将硝态氮还原为亚硝态氮，产生的亚硝酸根与rpncc试剂反应显色，520nm比色测定酶促反应后生成的亚硝态氮的量，来表征硝酸还原酶的活性。与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在直径10-15mm、长为100-150mm的普通玻璃试管中进行，不需用原来方法中提及的用来实现抽真空的带磨口塞的专用真空瓶及真空泵。2)与传统的酚二磺酸比色法相比，此种显色方法更加简单，本发明所使用的显色方法灵敏度更高，大大提高了分析的准确度。3)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要一个不加底物的溶液作为对照；同时，由于本发明所涉及到的培养方法减少了厌氧培养过程的复杂性和不确定性，故分析结果重现性非常良好。4)简化了操作步骤。土面位于液面以下就是为了创造培养所需要的厌氧环境，减少对抽气设备及真空环境的依赖性。具体实施方式1.0.05%-0.15°/。的KN03溶液:称取0.05-0.15gKN03用蒸馏水定容至100mL。2.0.5%-1%的葡萄糖溶液准确称取0.50-1.OOg葡萄糖，用蒸馏水定容至100mL。3.碳酸钙分析纯试剂。4.铝钾巩饱和溶液将硫酸钼钾溶于蒸馏水中，直至过饱和。5.显色剂1(rpiicc试剂)用比重为1.04的醋酸分别配制0.ly。的oc-萘胺溶液和O.5%的对氨基苯磺酸溶液(b),用前将等体积a、b混合即成。比重1.04的醋酸(相当于重量百分数35%的醋酸)配置取175mll00y。的醋酸，定容至500ml，即为35%，比重1.04的醋酸。称取0.2goc-萘胺用重量百分数35%，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此为(a)液。称取1，Og对氨基苯磺酸用重量百分数35%,比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml,此为(b)液。6.2,4-二硝基酸溶液(2,4-DNP,0.8mM):称取0.1481g2，4-DNP于蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000mL。加热使之全部溶解。在5-300|ig2,4-DNP范围内测定每个土类的最适抑制剂用量。7.标准贮备液(250mgN02—-N/L):溶解1.2314gNaN02并用蒸馏水定容至1000ml，放于4'C冰箱中保存，保存时间不宜过久，以不超过数周为宜。8.作标准曲线的制备吸取上述标准贮备液lml,定容至100ml,此为2.5mgN02—-N/L的溶液。再分别吸取该液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加少量蒸馏水和4ml显色剂，并用蒸馏水定容。此标准系列含亚硝态氮的量分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgN02—-N/L。在520nm下比色测定一系列已知浓度的NaN(V溶液的吸光值A'，以NaN02溶液的浓度和测定的吸光值A'制备标准曲线，得到斜率b;搡作步骤-.1)称取lg过l隱筛的土壤风干样品4份于4支试管中，分别加入20mgCaCO3,混匀后向试管中分别加入lmL0.8mM/L的2,4_二硝基酚溶液，混匀；然后向其中3支试管中加入l-1.5mL0.05%-0.15%的底物KNOr溶液，另l支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；再向试管中分别加入l-2mL0.5%-ly。的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10mL,摇匀，塞上不透气的橡胶塞后3(TC(士rC)恒温培养24h;同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；2)培养结束后，用30mL蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100mL的三角瓶中，再用蒸馏水补充至50mL;73)加入钼钾矾饱和溶液lmL，振荡，用致密滤纸过滤；4)取滤液lmL于50mL容量瓶中，加入少量蒸馏水和4mL的显色剂(相对于亚硝酸根过量)，然后用蒸馏水定容至刻度。15分钟后，在520nm下用分光光度计比色测定吸光值A;5)根据吸光值A和斜率b,计算所测定溶液中亚硝酸根的浓度S，S=A*b;6)计算样品中亚硝酸根含量；7)计算硝酸还原酶活性计算公式为[(S「S2)承50来vyi000承V2]/W.T=mgN02_N/g土.24h式中S,为样品中的N02-N的含量(mg/L);S2为样品对照中的NO厂N的含量(mg/L);50为定容的溶液体积(mL);V!为浸体液总体积(mL);V2为吸取滤液的体积(mL);W为称土样重(g);IOOO为单位转化系数；T为土壤培养的时间(h)。实施例1本实施例所使用的黑土釆自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理l号位对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在25。C培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂DCD且在25。C培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂DMPP且在25。C培养24h以上的土壤。土壤含水量均为20%(风干土重)。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是50卯m，用上述方法检测三种硝酸还原酶的活性。每种土壤得具体分析步骤如下1)称取lg过l醒筛的土壤风干样品4份于4支试管中，分别加入20mgCaCO3,混匀后向试管中分别加入lraL0.8mM/L的2,4-二硝基酴溶液，混匀；然后向其中3支试管中加入lmL0.05%的003溶液，另l支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；再向试管中分别加入lmL1%的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至10mL,摇匀，塞上不透气的橡胶塞后3(TC"rC)恒温培养24h;同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；2)培养结東后，用30mL蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100mL的三角瓶中，再用蒸馏水补充至50mL;3)加入铝钾矾饱和溶液lmL,振荡，用致密滤纸过滤；4)取滤液lmL于50mL容量瓶中，加入少量蒸馏水和4mL的显色剂(相对于亚硝酸根过量)，然后用蒸馏水定容至刻度。15分钟后，在520nm下用分光光度计比色测定吸光值A;5)根据吸光值A和斜率b,计算所测定溶液中亚硝酸根的浓度S,S=A*b;6)计算样品中亚硝酸根含量;7)计算硝酸还原酶活性。试验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。实施例2本实施例所使用的三种不同种植作物的棕壤均釆于中国科学院沈阳生态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20%(风干土重)，温度在25。C条件下培养24h以上，测定其硝酸还原酶活性，具体步骤如下底物硝酸钾浓度为0.1%,加入0.50mL,葡萄糖浓度为1%,加入lmL,其余步骤同实例1。试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。权利要求1.一种检测土壤中硝酸还原酶活性的分析方法，其特征在于1)称取0.5-1g过0.5-1.5mm筛的土壤风干样品n份分别装入n支试管中，n≥2，向试管中分别加入1-3mL0.5-1mM/L的2，4-二硝基酚溶液，混匀；然后向其中n-1支试管中加入1-1.5mL重量浓度0.05-0.15％的底物KNO3溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；再向试管中分别加入1-2mL重量浓度0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，再用蒸馏水补充至5-10mL，摇匀，塞上不透气的橡胶塞后29-31℃恒温培养24h；同时作试剂空白对照；2)培养结束后，用10-40mL蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100mL的三角瓶中，再用蒸馏水补充至50-100mL；3)加入铝钾矾饱和溶液1-2mL，振荡，过滤；4)取滤液1mL于50mL容量瓶中，加入1-3mL蒸馏水和4-8mL显色剂(相对于亚硝酸根离子过量)，然后用蒸馏水定容至刻度。15分钟后，在520nm下用分光光度计比色测定吸光值A；5)在520nm下比色测定一系列已知浓度的亚硝酸根标准溶液的吸收值A’，以亚硝酸根的浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中亚硝酸根的浓度S，S＝A*b；7)计算样品中亚硝酸根含量；8)计算硝酸还原酶活性计算公式为[(S1-S2)*50*V1/1000*V2]/W.T＝mgNO2-N/g土.24h式中S1为样品中的NO2-N的含量(mg/L)；S2为样品对照中的NO2-N的含量(mg/L)；50为定容的溶液体积(mL)；V1为提取液总体积(mL)；V2为吸取滤液的体积(mL)；W为称土样重(g)；T为培养土样的时间(h)；1000为单位转化系数。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于对于酸性土样品，分析前应调解其PH为7-8.5,可釆用加入碳酸钙的方法调解，每支试管中分别加入15-25mgCaC03,混匀后再向试管中分别加入l-3mL0.5-lmM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勾。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于厌氧培养所使用的蒸馏水，使用前，需将其加热至沸腾驱除水中的02，然后封闭冷却至室温。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述显色剂为重量浓度35%的醋酸配制的重量浓度0."/。的a-萘胺溶液和重量浓度0.5%的对氨基苯磺酸溶液等体积的混合液，而它们的加入相对于亚硝酸根为过量的。全文摘要本发明涉及一种检测土壤中硝酸还原酶活性的分析方法1)称取过筛的土壤风干样品n份于试管中，向试管中分别加入2，4-二硝基酚溶液，混匀；然后向其中n-1支试管中加入底物硝酸钾溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；再向试管中分别加入葡萄糖溶液，用蒸馏水补充至5-10ml，恒温培养；2)用蒸馏水补充至50-100ml；3)加入铝钾矾饱和溶液，振荡，过滤；4)取滤液加蒸馏水、显色剂，在520nm下测定吸光值A；5)计算样品中亚硝酸根含量。本发明优点为1)简化了操作步骤，减少了厌养培养过程的复杂性和不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。文档编号G01N1/28GK101271060SQ200710010680公开日2008年9月24日申请日期2007年3月21日优先权日2007年3月21日发明者史云峰,武志杰,陈利军,隽英华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所