专利名称：量子点电致化学发光的巯基化合物的分析方法
技术领域：
本发明属于分析化学中的量子点电致化学发光技术，它是利用含巯基的化合物对电致化学发光过程的淬灭提出了测定该类化合物的分析方法。
背景技术：
一些含有巯基的具有生物活性的小肽和氨基酸是人体重要的组成部分，如谷胱甘肽，它是由L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，在生命体系中扮演着相当重要的角色。作为组织和细胞内的主要自由基清除剂，还原态谷胱甘肽是维持生理环境的重要抗氧化剂，其作用主要依靠半胱氨酸上的巯基的还原性。它可以保护体内蛋白质或酶分子中巯基免被氧化而处于活性状态。一些临床研究表明，谷胱甘肽的浓度水平也是判断一些疾病，如白血病、糖尿病和部分癌症发生的有效标志之一。谷胱甘肽及其复方型制剂已用于临床注射。同样，作为和谷胱甘肽类似的化合物，L-半胱氨酸在蛋白质合成和代谢方面也有独特的作用。
由于这些含巯基的小肽和氨基酸的重要生理价值，实现对这些生物小分子的迅速准确定量是非常有必要的，对生命的代谢研究也有很大意义。巯基化合物的检测方法已有很多报道，目前采用的主要包括光度法、质谱法、荧光法、电化学法和化学发光法。最常用的Ellman法属于光度法[G.L.Ellman Arch.Biochem.Biophys.1959，82，70.]，利用巯基化合物和二硫二硝基苯甲酸之间的交换反应产生的有色产物来定量，该方法简单迅速，但也有一个无法克服的缺点，即对于没有预处理的样品(如血样)可能有很大背景吸收的干扰。质谱法[P.Capitan et al.JChromatogr.B 1999，732，127.]和荧光法[P.J.Hissin et al.Anal.Biochem.1976，74，214.]对仪器要求较高，检测成本随之提高。电化学法[P.R.Harvey etal.Clin.Chim.Acta 1989，180，203.]设备简单，但在裸电极上氧化巯基化合物需要较高氧化电位，干扰因素很多，无法准确定量。利用化学修饰电极方法来降低氧化过电位，减少干扰，可部分缓解这些问题，但检测限偏高。化学发光法[F.J.Romero，W.Mueller-Klieser J.Biolumin.Chemilumin.1998，13，263-6.]是一种分析应用的优秀方法，它与荧光相比没有背景干扰，检测限大幅下降，特别适合痕量物质的检测。而且它只测量总的光子数而不作波长上的分辨，因而仪器便宜，操作简便，近年来得到快速的发展。但由于它是由化学反应激发的发光，对发光的控制存在一定困难。为改善这种局面，电致化学发光分析法应运而生。该法是利用电化学手段来驱动化学发光的分析方法，在这里，将电化学技术引入化学发光体系可以大大提高体系的选择性和可控性。它集中了电化学和化学发光的优势，具有快速，精确控制发光的时间和空间等因素，高选择性和高灵敏度等多种优点。目前它在临床诊断、环境监测、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。
量子点是尺寸可调的零维纳米粒子，具有优秀的光电性能。自从量子点的电致化学发光现象在2002年被发现以来，受到了日益广泛的重视。基于这一方法，对生命过程中的重要中间体-过氧化氢的检测已经实现(Zou G.Z.et al.Anal.Chem.2004，76，6871.)。本发明也旨在扩大量子点电致发光技术的检测范围，使这项技术能更好的应用到实际检测工作中去。
发明内容
本发明的目的是基于巯基化合物淬灭量子点的电致化学发光的性质，而提供一种量子点电致化学发光的巯基化合物的分析方法。该方法操作简单，成本低廉，重复性好，可应用于临床诊断、环境监测、食品安全等领域。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现1.一种量子点电致化学发光的巯基化合物的分析方法，其分析步骤如下(1)将打磨好的石墨电极做表面氧化的亲水处理，然后取5～20μL的0.21μM 1～3nm的巯基乙酸稳定的CdSe量子点溶液，均匀的涂布在电极表面，静置于干燥器中过夜，获得量子点修饰的工作电极(2)；(2)向反应池(7)中注入2mL反应缓冲液(8)，将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)一起浸入反应缓冲液(8)中，分别连接到电化学工作站(1)的对应接线位置；(3)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)、Pt丝对电极(4)和反应池(7)置于光电倍增管(9)的密封暗箱中，从氮气通路(6)通入99.5～99.9％的氮气，电化学采用循环伏安法，选择0～-1.8V的电位扫描区间，扫描速度100～400mV s-1，利用计算机(11)同步启动电化学工作站(1)和化学发光检测仪(10)工作；(4)用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入浓度2～60μM的巯基化合物，混合均匀后再次扫描，获得与浓度相对应的发光强度，绘出一条工作曲线；(5)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)从反应缓冲液(8)中取出，弃去该反应缓冲液(8)，重复步骤(2)和(3)，用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入待测浓度的巯基化合物，根据其发光强度峰值，利用步骤(4)的工作曲线来确定待测疏基化合物的浓度；(6)测定完成后，用二次蒸馏水充分浸洗量子点修饰的工作电极(2)，4℃时置于0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液中保存，以备再次使用。
上述步骤(1)中所述的石墨电极表面氧化的亲水处理是指将打磨好的石墨电极在+1.75V电位下氧化5分钟后超声处理，再用二次蒸馏水多次浸洗获得亲水表面。
上述步骤(2)所述的反应缓冲液(8)为溶解0.3mM H2O2的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0～9.3，该反应缓冲液(8)处在99.5～99.9％的N2保护气氛中。
上述步骤(3)所述的量子点修饰工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)、Pt丝对电极(4)和反应池(7)处在光电倍增管(9)的密封暗箱中，反应池(7)具有良好的透光性能。
上述分析方法的步骤(4)所述的加入浓度2-60μM的巯基化合物，是采用分别先后加入浓度2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM、20μM、22μM、24μM、26μM、28μM、30μM，直至60μM的30种不同浓度的巯基化合物，混合均匀后再次扫描，获得与30种不同浓度相对应的发光强度，根据30个发光强度的点即可绘出一条工作曲线。
上述步骤(4)所述的巯基化合物包括谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等。
上述疏基化合物的分析方法，其分析过程中工作电极(2)、参比电极(3)、对电极(4)、注射器(5)、氮气通路(6)、反应池(7)、缓冲液(8)和光电倍增管(9)均置于完全避光区域(12)中进行分析的。
本分析方法依托的检测系统的构成及其工作原理本检测系统的结构如图1所示，共包括四个部分第一部分是三电极体系和电化学工作站，三电极体系包括由CdSe量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)，电化学工作站(1)用于向体系施加电位，控制发光过程；第二部分是反应池(7)，反应池是容积约10mL的玻璃烧杯，内盛反应缓冲液(8)，并配有氮气通路(6)和进样注射器(5)，放置在光电倍增管(9)之上；第三部分是光电倍增管(9)和化学发光检测仪(10)，用于采集和处理发光信号；第四个部分是计算机(11)，控制电化学工作站(1)和化学发光检测仪(10)的工作。
整个分析过程中，电化学扫描和化学发光检测过程均由计算机进行程序化自动控制。电化学工作站(1)利用控制三电极体系的施加电位来控制发光过程，反应产生的光子被反应池(7)下的光电倍增管(9)接收，后者以电信号形式转移到化学发光检测仪(10)中，再传输至计算机(11)。计算机可以将电化学工作站(1)和化学发光检测仪(10)的数据综合起来，绘制出施加电位和发光强度的关系。实验表明，-1.1V(vsAg/AgCl)电位对应于最强的光信号，下述的测量均基于这一电位的光强。
本分析方法的测定原理本检测系统利用了修饰在工作电极上的CdSe量子点的电致化学发光行为。在N2饱和的含H2O2的pH 7.0～9.3的磷酸盐缓冲液中施加一定的电位，CdSe量子点可以通过一系列的空穴和电子注入过程产生量子点的激发态，该激发态随后返回基态，其间的能量以光的形式释放，此即量子点的电致化学发光过程。H2O2是发光过程中的共反应剂，直接导致了发光中间体自由基OH·的产生。EPR研究表明，利用自由基捕捉剂DMPO(5，5’-二甲基-吡啰啉氮氧化物)可以捕捉到电致化学发光过程产生的OH·。对量子点电致化学发光行为机理可用图2来阐明。在一定条件下，电致化学发光的强度和H2O2浓度，亦即产生OH·自由基的浓度成正比。巯基化合物是有效的自由基淬灭剂，是维持人体细胞和组织抗氧化能力的主要来源。它可以迅速淬灭机体中的OH·自由基，理论和实验研究均证明这一过程的淬灭速率常数在109～3×1010mol dm3s-1数量级。因此向这一电致化学发光体系中加入一定浓度的巯基化合物，可以有效的形成一条自由基的淬灭路径(见图2)，导致电致化学发光强度的下降，其下降的幅度和加入的巯基化合物浓度在一定范围内有线性关系。而同样条件下加入这些化合物的氧化二聚体(即巯基二聚成二硫键形式)，则未发现其对电致化学发光有任何抑制作用，说明抑制发光强度的因素仅仅来自巯基。这一简单的对应关系即是本检测的基本依据。
本发明与现有技术相比，具有以下的特点本发明利用巯基化合物对量子点的电致化学发光的定量淬灭现象，提出了检测巯基化合物的新方法。相对于其他巯基化合物的分析方法，具有以下特点(1)操作简单，量子点材料的制备和修饰电极的准备工作均属于简单成熟的技术，检测操作均以计算机进行程序化控制，无需熟练操作人员。
(2)分析时间短，量子点的阴极电致发光属于快速发光，采用电化学快速扫描下，获得单个数据时间低于10秒。可以较快的获得所需工作曲线，迅速完成样品检测。
(3)仪器设备简单，成本低廉，避免使用价格昂贵的光学检测系统，整个分析系统由低值的电化学工作站(只需要循环伏安等最基本的功能)、光电倍增管和化学发光检测仪组成。
(4)抗干扰能力较强，大多数物质对自由基过程的干扰不大，而测定作为生物体系中主要自由基清除剂的巯基化合物，具有较显著的专一性。
四
图1 量子点电致化学发光的巯基化合物分析检测系统的结构示意图
1-电化学工作站；2-量子点修饰的工作电极；3-Ag/AgCl参比电极；4-Pt丝对电极；5-进样注射器；6-氮气通路；7-反应池；8-反应缓冲液；9-光电倍增管；10-化学发光检测仪；11-计算机；12-完全避光区域。
图2 量子点电致化学发光的巯基化合物分析的检测原理示意图五具体实施方式
实施例1 巯基乙酸稳定的量子点的制备将20mL 5mM CdCl2和20μl巯基乙酸混合，用1M NaOH调节pH至11.2后稀释至50mL，所得无色澄清溶液通入99.5～99.9％N230分钟，缓慢加入0.5mL0.1M Na2SeSO3，得淡黄色量子点溶液，加热回流，量子点尺寸会随时间延长而增加，回流5小时后冷却，所得橘黄色溶液在二次水中透析48小时除去杂质小分子，离心除去少量沉淀，在4℃冰箱中保存，这时量子点粒径约2.5nm，其具有最佳电致化学发光响应。
实施例2 巯基化合物谷胱甘肽浓度的测定(1)将打磨好的石墨电极在+1.75V电位下氧化5分钟后超声处理，再用二次蒸馏水多次浸洗获得亲水表面，然后取15μl的0.21μM 2.5nm的巯基乙酸稳定的CdSe量子点溶液，均匀的涂布在电极表面，静置于干燥器中过夜，获得量子点修饰的工作电极(2)；(2)向反应池(7)中注入2mL 0.3mM H2O2的0.1M pH9.3磷酸盐溶液[反应缓冲液(8)]，将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)一起浸入反应缓冲液(8)中，分别连接到电化学工作站(1)的对应接线位置；(3)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)、Pt丝对电极(4)和反应池(7)置于光电倍增管(9)的密封暗箱中，从氮气通路(6)通入99.9％的氮气，电化学采用循环伏安法，选择0~-1.8V的电位扫描区间，扫描速度400mV s-1，利用计算机(11)同步启动电化学工作站(1)和化学发光检测仪(10)工作；(4)用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入浓度2～60μM的谷胱甘肽，混合均匀后再次扫描，获得与浓度相对应的发光强度，绘出一条工作曲线；(5)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)从反应缓冲液(8)中取出，弃去该反应缓冲液(8)，重复步骤(2)和(3)，用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入待测浓度的谷胱甘肽，根据其发光强度峰值，利用步骤(4)的工作曲线来确定谷胱甘肽的浓度。
(6)测定完成后，用二次蒸馏水充分浸洗量子点修饰的工作电极(2)，4℃时置于0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液中保存，以备再次使用。
权利要求
1.一种量子点电致化学发光的巯基化合物的分析方法，其分析步骤如下(1)将打磨好的石墨电极做表面氧化的亲水处理，然后取5～20μL的0.21μM 1～3nm的巯基乙酸稳定的CdSe量子点溶液，均匀的涂布在电极表面，静置于干燥器中过夜，获得量子点修饰的工作电极(2)；(2)向反应池(7)中注入2mL反应缓冲液(8)，将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)一起浸入反应缓冲液(8)中，分别连接到电化学工作站(1)的对应接线位置；(3)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)、Pt丝对电极(4)和反应池(7)置于光电倍增管(9)的密封暗箱中，从氮气通路(6)通入99.5～99.9％的氮气，电化学采用循环伏安法，选择0～-1.8V的电位扫描区间，扫描速度100～400mV s-1，利用计算机(11)同步启动电化学工作站(1)和化学发光检测仪(10)工作；(4)用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入浓度2～60μM的巯基化合物，混合均匀后再次扫描，获得与浓度相对应的发光强度，绘出一条工作曲线；(5)将量子点修饰的工作电极(2)、Ag/AgCl参比电极(3)和Pt丝对电极(4)从反应缓冲液(8)中取出，弃去该反应缓冲液(8)，重复步骤(2)和(3)，用进样注射器(5)向反应缓冲液(8)中加入待测浓度的巯基化合物，根据其发光强度峰值，利用步骤(4)的工作曲线来确定待测疏基化合物的浓度；(6)测定完成后，用二次蒸馏水充分浸洗量子点修饰的工作电极(2)，4℃时置于0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0中保存，以备再次使用。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于在步骤(1)中所述的石墨电极表面氧化的亲水处理是指将打磨好的石墨电极在+1.75V电位下氧化5分钟后超声处理，再用二次蒸馏水浸洗2-5次获得亲水表面。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(2)所述的反应缓冲液(8)为溶解0.3mM H2O2的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0～9.3，该反应缓冲液(8)处在99.5～99.9％的N2保护气氛中。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(4)所述的加入浓度2-60μM的巯基化合物，是采用分别先后加入浓度2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM、20μM、22μM、24μM、26μM、28μM、30μM，直至60μM的30种不同浓度的巯基化合物，混合均匀后再次扫描，获得与30种不同浓度相对应的发光强度，根据30个发光强度的点即可绘出一条工作曲线。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于步骤(4)所述的巯基化合物为谷胱甘肽、半胱氨酸或半胱胺。
全文摘要
一种量子点电致化学发光的巯基化合物的分析方法。其分析步骤为(a)制备量子点修饰的工作电极(2)；(b)将工作电极(2)、参比电极(3)和对电极(4)(以下简称三电极)一起浸入缓冲液(8)中，分别连接到电化学工作站(1)；(c)将三电极和反应池(7)置于光电倍增管(9)中，通入高纯氮，用计算机(11)同步启动工作站(1)和检测仪(10)工作；(d)加入浓度2－60μM的巯基化合物，混匀后扫描，获得与浓度相对应的发光强度，绘出一条工作曲线；(e)弃去缓冲液(8)，重复步骤(b)、(c)，加入待测浓度的巯基化合物，根据发光强度峰值，利用步骤(d)的工作曲线可确定待测巯基化合物的浓度。该方法具有成本低、重现性好、灵敏度高的特点。
文档编号G01N27/416GK101029896SQ20071002100
公开日2007年9月5日 申请日期2007年3月22日 优先权日2007年3月22日
发明者鞠熀先, 姜晖 申请人:南京大学