专利名称：D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有 在食品、词料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等 多领域应用前景。L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、 明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微 生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微 生物造成了污染。乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关 系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1_5%。血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作 为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个 重要数据，供安排训练时参考。酶法分析是国际上公认的分析方法，己被多个国际权威组织或机构采 纳如IFU (国际果汁生产者协会),AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟), 及MEBAK， OICC, VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用具有D-乳酸特异牲的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺 辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定D-乳酸浓度 的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒， 采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行 D-乳酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广 应用。本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下D-乳酸+辅酶D-乳酸脱氢酶丙酮酸+还原型辅酶这种方法应用D-乳酸脱氢酶(D-lactic acid dehydrogenase; EC 1.1.1.28) 酶促反应速率比色法/终点法。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸，并将辅酶(在 340nrn处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从 而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量 340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算D-乳酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理 想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/LD-乳酸脱氢酶 12000 U/L本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、D-乳酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。 辅酶、D-乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。无论是单剂、双剂，本发明测定D-乳酸浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂，包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 100 mmol/L稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/LD-乳酸脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的 浓度大小。 实施例二本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 稳定剂綱mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L试剂2甘氨酸_氢氧化钠缓冲液 稳定剂D-乳酸脱氢酶100mmol/L 500醒ol/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟 时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nrn吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的 浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种具有D-乳酸特异性的酶比色法D-乳酸浓度测定方法，其方法原理如下D-乳酸+辅酶D-乳酸脱氢酶丙酮酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出D-乳酸的浓度大小测定结果。
2. —种D-乳酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L辅酶 1- 6 mmol/LD-乳酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、D-乳酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、D-乳酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓 冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶 组成。辅酶、D-乳酸脱氢酶在试剂l或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙:醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种,
全文摘要
本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法技术的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、D-乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。
文档编号G01N33/50GK101324555SQ20071002322
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司