专利名称：乙酸测定试剂盒及乙酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的 方法，属于食品/环境检验测定技术领域。
技术背景随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋G B 10337—2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合G B 1903—1996的 规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒"食品添加剂醋 酸"，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不够时加入 盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为这类醋酸不 仅含有添加的有毒、有害无机物,还含些很难说清的有害有机物。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定乙酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙酸测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实 的推广应用。本发明乙酸浓度测定方法原理如下乙酸+腺苷三磷酸+辅酶A 乙酰辅酶A合成酶腺苷单磷酸+ 二磷酸+乙酰辅酶A乙酰辅酶八+ 二氧化碳+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶八+辅酶这种方法应用乙酰辅酶A合成酶(Acyl-coenzyme-A synthetase ; EC 6.2丄1; EC 6.2.1.3)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2丄51)酶促反应连续监测法/速率比色法。乙酰辅酶A合成酶酶解 乙酸反应产生乙酰辅酶A，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶的作用，最终 将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有 吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度/速度， 通过测量340nrn处吸光度下降的程度/速度，可以测算乙酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙酸测定试剂盒较为 理想缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷三磷酸 辅酶A二氧化碳 乙酰辅酶A合成 100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L丙酮酸脱氢酶 12000 U/L本发明的乙酸测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、 乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化 碳。 试剂2缓冲液、稳定剂、乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶。 还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、乙酰辅酶A合成酶、 丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化 碳。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、乙酰辅酶A合成酶。 还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、乙酰辅酶A合成酶、 丙酮酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使 用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙酸浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的乙酸测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷三磷酸 辅酶A 二氧化碳乙酰辅酶A合成酶 丙酮酸脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约 O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。 实施例二本实施例的乙酸测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂还原型辅酶 腺苷三磷酸 辅酶A二氧化碳画mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂乙酰辅酶A合成酶 丙酮酸脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可p直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37-C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与 试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。 实施例三本实施例的乙酸测定试剂为三试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷三磷酸辅酶A二氧化碳函mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L丙酮酸脱氢酶12000 U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂500 mmol/L乙酰辅酶A合成酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定乙酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37T:，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测乙酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左 右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分 析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的 浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸浓度测定方法，其方法原理如下乙酸+腺苷三磷酸+辅酶A乙酰辅酶A合成酶 腺苷单磷酸+二磷酸+乙酰辅酶A乙酰辅酶A+二氧化碳+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+辅酶A+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小测定结果。
2. —种乙酸测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L还原型辅酶0.1—~0.35 mmol/L腺苷三磷酸1-50 mmol/L辅酶A1-50 mmol/L二氧化碳1-50 mmol/L乙酰辅酶A合成酶1000——-騰00 U/L丙酮酸脱氢酶1000——-80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。二氧化碳以碳酸氢盐取代，例如碳 酸氢钠或碳酸氢钾。
3. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、 乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、 乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶组成。还原型 辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸 脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、 乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二氧化碳、组成；试剂 2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定 剂、乙酰辅酶A合成酶组成。还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、 二 氧化碳、乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷三磷酸、辅酶A、二氧化碳、乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101324512SQ20071002337
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司