专利名称：无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无 机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态 平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反 之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升 血浆钙磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐 形式沉积在骨组织，〉70时，可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将 妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软 骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素 的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析 磷酸盐阴离子(H2P04"， HP04"。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原 法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动 注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验 室测定无机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加 入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，4性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚 化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有 光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下 的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测 定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷诊 断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动 生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。本发明无机磷浓度测定方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶这种方法应用丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)酶(偶) 联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)酶促反应连续测法/速率比色法。丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产生丙酮酸,再通过(偶)联合丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nrn 处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还 原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度 下降的程度/速度，可以测算无机磷的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试 剂盒较为理想缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25讓ol/L腺苷二磷酸5 mmol/L草酰乙酸30 mmol/L氨离子30 mmol/L丙酮酸羧化酶幽00U/L丙氨酸脱氢酶12000U/L本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离 子。试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶。 还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、丙氨 酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离 子。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、丙氨 酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L腺苷二磷酸 5 mmol/L草酰乙酸 30mmol/L 氨离子 30 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L丙氨酸脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例二本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷二磷酸草酰乙酸100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸羧化酶100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8土0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测无机磷样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。实施例三本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷二磷酸草酰乙酸氨离子试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L100 mmol/L500 mmol/L12000 U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L500 mmol/L10000 U/L丙酮酸羧化酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm， 被测无机磷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟 左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出无机磷 的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类 同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+ 水+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出无机磷的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——50Ommol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷二磷酸 1——50mmol/L草酰乙酸 1——50mmol/L氨离子 1- 50mmol/L丙酮酸羧化酶 1000——80000 U/L丙氨酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳 定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶在试 剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳 定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、 丙酮酸羧化酶组成。还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6. 根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨离子、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101324616SQ20071002337
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司