专利名称：钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓度的 方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
技术背景血清钾三个决定性水平的临床意义低于参考值下限，表现低钾血症， 其原因有肾小管疾病，高醛固酮症，胰岛素过多症，代谢性碱中毒，利尿 剂治疗、胰岛素治疗糖尿病酮症时钾离子转移至细胞内等。高于参考值上 限，可能由肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当血钾高达7.5腿ol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确 定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏 停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度 计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、 尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为 内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主 要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂 或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li 的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠 醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有 未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径 的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普 通冠醚阴离子染料进行比色定量。离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取 代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测标本溶液中，进行检测。目前己有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜的有PH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由 难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有Cl—电极 和r电极；(D液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的"2+电 极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极 使用一段时间就会自动老化，有效期长短不一。原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂， 误差较大，不及火焰光度法简便。钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂虫 贝°酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干 扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分析项目。发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色、 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾浓度的方法，同时，本发明还将 给出用以实现该方法的钾诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/ 可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾浓度测定，而且测定速度 快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明钾浓度测定方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶^+ 腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvate kinase ; EC 2.7丄40)酶联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4.1.1)、甘氨酸 氧化酶(glycine oxidase; EC 1.4.3.19)酶促反应连续监测法。丙酮酸激酶 作为作用酶，功能为将磷酸烯醇式丙酮酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶 的酶促作用使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶，甘氨酸氧化酶再将丙氨酸再次变回丙酮酸，使丙酮酸不断地被重复循环利用。丙氨酸脱氢酶作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化 型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处 吸光度下降的速度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算 钾的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾诊断/测定试剂盒较 为理想缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 丙酮酸激酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 8 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L本发明的钾诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨 酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氨离子。试剂2缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。 还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾浓度的方法，其还原型辅〖可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的钾诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂还原型辅酶丙酮酸激酶丙氨酸脱氢酶甘氨酸氧化酶腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸500 mmol/L0.25 mmol/L6000 U/L8000 U/L10000U/L8 mmol/L3 mmol/L20 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟 左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出钾的浓度大 小。实施例二本实施例的钾诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 还原型辅酶 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸试剂250 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L20 mmol/L(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 丙酮酸激酶甘氨酸氧化f500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大 约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出钾的浓度大实施1本实施例的钾诊断/测定试剂为三试剂，包括:试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L500 mmol/L甘氨酸氧化酶8000 U/L 10000U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 丙酮酸激酶500 mmol/L6000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用,测定钾浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测钾样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负 反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出钾的浓度大 小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酶+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K+ 腺苷三磷酸 +丙酮酸丙酮酸+氨离子+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+ 水+辅酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出钾的浓度大小测定结果。
2. —种钾诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 稳定剂20-500 mmol/L1-4000 mmol/L还原型辅酶 丙酮酸激酶 -0.35mmol/L1000——80000 U/L1000——騰00U/L甘氨酸氧化酶腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸1000——80000 U/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。氨离子可以使用任何氨盐。
3. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸 氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸 氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、 甘氨酸氧化酶组成。还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸 氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸 氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷二辯酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 氨离子组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化 酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。还原型辅酶、 丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、廿氨酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式 丙酮酸、氨离子在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1-4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、氨离子、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出钾的浓度大小。
文档编号G01N33/84GK101329356SQ200710024728
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司