专利名称：副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒 及方法。
背景技术：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,简称VP)是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性细 菌，海产品中常有此菌。食用了污染有副溶血弧菌的生的或者未煮熟的海产品时会导致严重急性肠 胃炎，在细菌性食物中毒的构成中，又以副溶血弧菌弓胞的急性肠胃炎占首位。因此，快速灵敏 的检测手段是预防控制副溶血弧菌传播的关键。通常传统鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化 鉴定、嗜盐性i^等，这些检测手段不6^时而且操作复杂、灵敏度低。近年来，有大量的报道 证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血弧菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵 敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的m循环装置，它的检测时间也 还是比较长(4 8小时)，并且反^31程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实 地检须啲需要。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核,列扩增法(NASBA)、 自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。 SH种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时l 小时左右就可以将目标核酸扩增至湘似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强， 使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测S^^I简便成本低廉，但 要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检领序段。所以，将生 物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。另外还有一些检测方法，比如免 疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，不能满足快速 检测的需求。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP)克服
以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速i，行核酸的扩增，具有很多 的优越性。该方法通常是按如下步，行步骤一、对被检标本进fi 页处理，快速提取被检标本 的DNA或RNA;步骤二、特异性弓嫩的制备确定待测标本的耙基因后，取f辨寺异性引物2对， 内引物和外引物各一沐步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、 弓胸、反应缓冲液与B对DNA聚合酶混合，在63 65。C保温0.5至1.5小时进fil盾环链置换反应； 步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温剝牛下高效 地扩增核酸，但是现有技术也有不粒处，主要是1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广 泛应用；2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制 其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及 方法。
为达到本发明的目的，采用以下技术方案
本发明的一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括
——引物混合液四条引物浓度均为10pmol4d,引物序列如SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQID
N0.3、 SEQIDN0.4;
——B对DNA聚合酶浓度为8U4U;
——反应液lOmMdNTP: 10xTheimoPol反应缓冲液150mMMgSO4=8: 5: 2; ——^品预处理液20mMTris-HCl (pH8.0) ， 2mMEDTA， 1.2%TritonX-100; ——显色剂荧光染料1XSYBR Green I;
——阳性对照为副溶血弧菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。 用上述试剂盒检测副溶血弧菌的方法包括以下步骤
(1) 待检副溶血弧菌DNA提取过程取过夜培养的增菌液于离心管中，1000ipm离心2分 钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10射中后立即 置于冰上冷却10射中；10000—12000rpm离心2射巾，上清即可作为待检副溶血弧菌DNA;其中
增菌液与样品预处理液的用量比为5: 8;
(2) 恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应溶液引物混合物1.5^1，反应液5.5^1， B对DNA聚合酶0.5Ml，模板DNA2W，加水至11.5pl;设置阳性对照反应时，用副溶血弧菌基因 组DNA替代(1)中得到的待检副溶血弧菌DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合 液替代(l)中得到的待检副溶血弧菌DNA;将含有配制好的反应溶液的PCR管于65。C反应1.5 小时；
(3) 分析判断反应产物结果在(2)中得到产物中加入2.5^1荧光染料1XSYBRGreenI， 混匀，静置5min;若显现绿色则为阳性，鹏则为阴性。
本发明的一种副溶血弧菌恒温基因扩增腿检测试剂M方法有以下有益效果 1 、高特异性:本发明根据副溶血弧菌鼎毒力基因设计了四雑异性弓胸，弓l物序列如SEQ ED NOl、 SEQIDN02、 SEQID则、SEQIDN04;
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断耙标物质的存在与否，阳性率可达大于99%，假
阳性率小于1%;
2、 快速、高效扩增扩增在不到1小时即可完成，且产率高；
3、 灵驗高最低检领贩限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99%;
4、 鉴定简便通过肉目歡见察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。
具体实航式
按下列配方制备副溶血弧菌等温基因扩增快速检测试剂盒
——引物混合液四条引物浓度均为10pmol4d，引物序列如SEQIDNai、 SEQK)N0.2、 SEQID
N0.3、 SEQIDN0.4;
——BrfDNA聚合酶浓度为8U4d;
——反应液80Mll0mMdNTP， 10xThermoPol反应缓冲液，20pl 150mMMgSO4; ——#品预处理液20mMTris-HCl (pH8.0) ， 2mMEDTA， 1.2%TritonX-100; ——S色齐U:荧光染料1XSYBR Green I;
——阳性对照为副溶血弧菌基因&DNA，阴性对照为不含^fe的反应混合液 用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测
1、 待检副溶血弧菌DNA简易提取过程
(1) 、取50^1过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2^H中，去上清；
(2) 、加入80)a脾品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
(3) 、沸水中煮10射中后立即置于冰上冷却10分钟；
(4) 、 10000rpm离心2^H中，上清即可作为待检副溶血弧菌DNA。
2、 环介导恒温扩增(LAMP)反应
(1) 、在200ulPCR管配制反应混合液引物混合物1.5^1，反应液5.5W， B对DNA聚合酶0.5^1， 待检副溶血弧菌DNA2pl，加水至11.5^1;设置阳性对照反应时，用副溶血弧菌基因组DNA替代 待检副溶血弧菌DNA，设置阴'M照反应时，用不含模板的反应混合液替代待检副溶血弧菌DNA;
(2) 、将含有配制好的反应混合液的PCR管于65。C反应1.5小时。
3、 分析判断反应产物结果
在反应产物中加入2.5(J荧光染料(1XSYBR Green 1)，混匀，静置5min。若显现绿色则为
阳性，橙色则为阴性。
引物序列表 SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 曦，鲁 丽，王 琳,李
<120>副溶血弧菌恒温基因扩±曾^1检测试剂^方法
<130> Notomi T, Okayama H Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K Amino H Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 19 <212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus <400> 1
cgcaccagct actogaaag 19 SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 曦，鲁 丽，王 琳，李
<120> 副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂M方法
<130> Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T， Watanabe Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1
< 170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 20 <212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus <400> 1
cggcgaagaa cgtaatgtct 20 SEQUENCE LIS頂G
<110>华南理工大学 曦，鲁 丽，王 琳，李
<120>副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂M方法
<130> Notomi T， Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 40 <212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus <400> 1
ccaccagtag ccgtcaatgg tggcgaccga ttgggaatgg 40 SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 權，鲁 丽，王 琳，李
<120>副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂M方法
<130> Notomi T， Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E6！3.
<160> 1
< 170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 41 <212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus <400> 1
acaccaacac gtcgcaaaac gtgcgttctc gttcgccaaa t 4权利要求
1、一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括——引物混合液四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4；——Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl；——反应液10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO4＝8∶5∶2； ——样品预处理液20mM Tris-HCl(pH 8.0)，2mM EDTA，1.2％Triton X-100；——显色剂荧光染料1×SYBR Green I；——阳性对照为副溶血弧菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。
2、 一种用权利要求l所述的试剂，测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤-(1)待检副溶血弧菌DNA提取过程取过夜培养的增菌液于离心管中，100帥m离心2分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10辦中后立即 置于冰上冷却10射中；10000—12000rpm离心2^H中，上清即可作为待检副溶血弧菌DNA;其中增菌液与样品预处理液的用量比为5: 8;(2) 恒温基因扩增反应在PCR管中配帝仮应溶液引物混合液1.5^1，反应液5.5W， B对DNA 聚合酶0.5nl， (1)中得到的待检DNA2pl，加7jC至11.5^;设置阳'IW照反应时，用副溶血弧菌 基因组DNA替代(1)中得到的待检副溶血弧菌DNA，设置阴tt^照反应时，用不含模板的反应 混合液替代(l)中得到的待检副溶血弧菌DNA;将含有配制好的反应溶液的PCR管于65。C反 应1.5小时；(3) 分析判断反应产物结果在(2)中得到的产物中加入2.5Ml显色剂，混匀，静置5min; 若显现绿色则为阳性，離则为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法，试剂盒包括引物混合液，其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，Bst DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色剂、阳性对照及阴性对照。利用该试剂盒通过提取副溶血弧菌基因组DNA、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对副溶血弧菌高特异性、快速、高灵敏度、简便的检测。
文档编号G01N21/77GK101178363SQ200710030948
公开日2008年5月14日 申请日期2007年10月19日 优先权日2007年10月19日
发明者芳 刘, 琳 李, 丽 王, 磊 石, 耿予欢, 曦 鲁 申请人:华南理工大学