专利名称：香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物保护和生物技术领域，尤其涉及香蕉枯萎病菌4 号小种的快速检测方法。
背景技术：
香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵 染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型
(尸〃sarj.〃迈oY75/ arLffl7 f. sp. c〃Z e/ se)。病原菌从受伤的根茎侵入， 通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向叶部蔓延。当植株枯死后， 病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进 行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8 — 10年。由于该菌存活 期长，传播迅速，尚未有防治该病的特效药物，因此容易大面积爆 发而造成重大损失。
尖孢镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(F0C1)感 染香蕉的栽培种"大蜜哈"[Grosmichel (AM)]及龙牙蕉
(MusaAAB)，矮香蕉[Dwarfcavendish (AAA)]较抗病，该小种呈世 界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(F0C2)在中美洲，仅感 染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe (MB)]，不侵染"大蜜哈"；3号 小种(F0C3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia); 4号小种(F0C4) 能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、"大蜜哈"、矮香蕉、 野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大。目前，尚未培育出有效的香蕉
抗4号小种品种。
目前，对香蕉枯萎病菌4号小种仍采用传统的生物学和致病性 检验检测技术鉴定，需要较长的时间才能区别4号小种和1号小种。 即使采用病原菌分离和结合VCG或者Koinada改良培养基上的性状来 确定4号小种，也需要较长时间， 一般需要30天甚至更多的时间鉴 定确诊，不利于香蕉枯萎病的及时防控。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种香蕉枯萎病菌4 号小种的快速检测方法，利用香蕉枯萎病菌4号小种的引物进行香 蕉植株的DNA进行PCR扩增和循环以后进行电泳检测。
本发明的技术方案是提供一种香蕉枯萎病菌4号小种的快速检 测方法，包括以下步骤
(1) 抽提香蕉植株的DNA;
(2) 电泳检测(1)的模板DNA;
(3) PCR扩增DNA扩增；
(4) PCR循环；
(5) 电泳检测。
步骤(2)所述电泳检测模板DNA是取5化(1)步骤提取的香蕉 植株DNA样品与载样缓冲液混合，用1%的琼脂糖凝胶电泳40min， 5v/cm，于凝胶成像系统下观察有无DNA条带。所述载样缓冲液为 TAKARA公司出品的6 X loading buf f er。
步骤(3)所述PCR扩增DNA的扩增反应体系如下模板DNA 1叱；
10XPCR Buffer 2. 5 ML;
Mg2+ (25函L/L) 2. 5叱；
dNTPs (25mmoL/L) 2叱；
引物RF4-1 (lOWnoL/L) 1叱；
引物RF4-2 (10MmoL/L) 1叱；
Taq酶(5U/WJ 0.2叱； 灭菌(1朋20 至总体积25叱。
所述引物为
RF4-1: 5， -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3，； RF4-2: 5， -GGTCCTCACACTCCAATC-3，。 步骤(4)所述PCR循环为94。C预变性5min; 94。C变性30s， 52 。C退火30s， 72。C延伸45s， 35个循环；72。C延伸10min。
步骤(5)所述电泳检测是取出步骤(4)反应混合液5PL与载样 缓冲液混合，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物903bp特异条带。电 泳凝胶为1%的琼脂糖凝胶，配方为lg琼脂糖，100mL0.5XTBE 电泳缓冲液，5化溴化乙锭(EB)，其中，0. 5 XTBE电泳缓冲液由5 XTBE (54g Tris，27. 5g硼酸，20ml 0. 5mol/L EDTA(pH8. 0)，定容至1000ml) 稀释十倍再使用。
本发明与现有技术相比，其有益效果表现在 (1)本发明提供了一个快速的检测方法，应用该方法可在6小 时之内对香蕉枯萎病菌4号小种进行快速、准确检测。
(2)本发明提供的引物和方法，无需对样品中的病原菌进行分 离和纯化，步骤简单，容易操作，无需复杂、精密仪器，有利于快 速、便捷开展植物检疫工作。
(3) 本发明的监测方法具有针对香蕉枯萎病菌4号小种的特异 性和准确性。
(4) 本发明能够灵敏检测到低菌量的香蕉枯萎病菌4号小种。
图1采用本发明方法在23个菌株中进行PCR检测的特异性电 泳图检测F0C4的结果(903bp特异条带)
图2本发明方法进行PCR检测不同浓度病原菌F0C4 DNA的灵敏 度电泳图检测结果(903bp特异条带)
图3不同来源香蕉拟似枯萎病样本检测F0C4的结果(903bp特 异条带) 具体实施例
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细地说明。 实施例1本发明方法特异、准确性实验
应用本发明方法在23个菌株中进行PCR检测的特异性电泳图检测。
1. 抽提植株的DNA:按常规CTAB法进行。
2. 电泳检测模板DNA:取5化所提取的DNA样品与载样缓冲液混合， 用ly。的琼脂糖凝胶电泳40min， 5v/cm，于凝胶成像系统下观察，若 有DNA条带，则DNA抽提成功，可以继续使用，若无DNA条带，则 需重新抽提。3. PCR扩增DNA扩增反应体系如下
模板DNA 1 A
10XPCR Buffer 2. 5叱
Mg2+ (25,L/L) 2. 5 I^L
dNTPs (25訓L/L) 2叱
引物RF4-1 (10MmoL/L) 1叱
引物RF4-1 (10WnoL/L) Taq酶(5L但) 灭菌ddH20
1叱
0.2叱
至总体积25叱
4. PCR循环
94 'C预变性 94 °C变性 52 aC退火 72 。C延伸 72 。C延伸
5 min 30 s
30 s 卜 35 Cycles 45 s > 10 min
5.电泳检测取出反应混合液5叱与载样缓冲液混合，1%琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物，观察有无903bp特异条带出现，有则为 阳性扩增。
应用本发明方法对以下病菌作检测香蕉枯萎病菌4号小种 。jf7"S^or咖f. sp. c由775"e race4 (F0C4)禾口香蕉枯萎病菌1号小种 77. ay7s/7arw777 f. sp. cwZ7e/7se racel ( FOCI )， 番茄枯萎病菌 ,.cur7s/ az7/57f. sp. Jj5copor5"/c/(F0L)，西瓜枯萎病菌尸'oz/5/7arLffl7
f. sp. z j'p^/z (F0N)， 苦瓜枯萎病菌尸.cur/"57 or咖f. sp.迈o衡Jj'cae (F0M)，菜豆枯萎病菌F. 。^spora/z7 f. sp. pAaseoJi (FOP)，棉花
枯萎病菌尸-a 75p027i/z f. sp. KasjV /ec^w迈(F0V)， d、麦赤霉病菌
,,^ra/z7i/7eari//z7(FG)，胶孢炭疽菌CaZJeto^rz'c力iz/z7^7。e。spari。iGfes (CG)，检测的结果如附图1所示，仅香蕉枯萎病菌4号小种在903bp
处产生特异性条带。附图1中，M: DL2000 Marker; 1 15: F0C4;
16: F0C1; 17:番茄枯萎病菌；18:西瓜枯萎病菌；19:苦瓜枯萎 病菌；20:菜豆枯萎病菌；21:棉花枯萎病菌；22:小麦赤霉病菌； 23:胶孢炭疽菌；24:清水对照。
实施例2用PCR方法来检测不同浓度病原菌DNA
实验步骤同实施例l，用PCR来检测不同浓度病原菌DNA，其灵 敏度电泳结果见附图2，其中，M: DL2000 Marker; 1 7: F0C4总 DNA稀释梯度(10°—10—6); 8:清水对照。附图2表明DNA抽提液 在稀释104倍后仍能够扩增出903 bp的特异条带，即能够检测出相 当于2ng的新鲜菌丝，说明本发明方法的灵敏性。 实施例3
(1)抽提香蕉植株DNA
按常规CTAB法进行，将待检香蕉组织100 200mg用液氮研磨 成粉状，加入600 n L试剂CTAB和12y L2-巯基乙醇，研磨液转入 1.5mL离心管中，65。C水浴30分钟，加入600 u L酚\氯仿混合液， 于室温、12000rpm条件下离心5分钟，取上清液置于新的离心管中。 加入1/10体积3mol/L、 pH5. 2的NaAc和2倍体积冷无水乙醇，置
-20。C沉淀20分钟；4°C、 12000rpm条件下离心10分钟，分别用70% 乙醇淋洗DNA沉淀，室温下风干；溶于50 ii L灭菌双蒸水中得到DNA 溶液。
(2)电泳检测模板DNA
取5化所提取的DNA样品与载样缓冲液混合，用1%的琼脂糖凝 胶电泳40min， 5v/cm，于凝胶成像系统下观察，若有DNA条带，则 DNA抽提成功，可以继续使用，若无DNA条带，则需重新抽提。所述 载样缓冲液为TAKARA公司出品的6X loading buffer。
(3) PCR扩增用全自动DNA合成仪进行合成。DNA扩增反应 体系如下
模板DNA 10XPCR Buffer Mg2+ 25画L/L dNTPs 25画1/L 引物RF4-1 10Pmol/L 引物RF4-2 10陶ol/L Taq酶 5U/叱 灭菌ddH20
肌 2. 5PL 2. 5叱
2PL l叱 肌 0. 2叱
适量加入至反应体系 总体积25化
(4) PCR循环
94。C预变性5min; 94。C变性30s， 52。C退火30s， 72。C延 伸45s， 35个循环；72t:延伸10min。列表表示如下
94 。C预变性 5 min
94 °C变性 30 s
52 °C退火
35 Cycles
72 。C延伸 45 s
72 。C延伸 10 min
(5)电泳检测取出反应混合液5化与载样缓冲液混合，1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测结果见附图3，其中，M: DL2000
Marker; 1:廉江市香蕉样品；2 10:高州市香蕉样品；11 16:徐 闻县香蕉样品；17 21:汕头市香蕉样品；22 23:中山市香蕉样品； 24 29:揭阳市香蕉样品；30:珠海市香蕉样品；31:清水对照；32:
健康植株对照，检测结果与病菌分离鉴定方法结果一致。若有903bp 特异条带，则为阳性扩增，有香蕉枯萎病菌4号小种；若无903bp 特异条带，则为阴性，没有香蕉枯萎病菌4号小种。
权利要求
1、一种香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)抽提香蕉植株的DNA；(2)电泳检测(1)的模板DNA；(3)PCR扩增DNA扩增；(4)PCR循环；(5)电泳检测。
2、 根据权利要求1所述香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法， 其特征在于步骤(3)所述PCR扩增DNA的扩增反应体系如下模板DNA 1ML;10XPCR Buffer 2. 5PL;Mg2+ 25mmoL/L， 2. 5叱；dNTPs 25,L/L， 2pL;引物RF4-1 10MmoL/L， l叱；引物RF4-2 10MmoL/L， 1ML;Taq酶 5U/PL， 0. 2叱；灭菌ddH20 适量加入至反应体系总体积25叱。
3、根据权利要求2所述香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法， 其特征在于所述引物分别为引物RF4-1: 5， -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3，； 引物RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC—3'。
4、 根据权利要求1所述香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法， 其特征在于步骤(4)所述PCR循环为94C预变性5min; 94匸变性 30s， 52。C退火30s， 72。C延伸45s， 35个循环；72。C延伸10min。
5、 根据权利要求1所述香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法， 其特征在于步骤(5)所述电泳检测是取出步骤(4)反应混合液5PL 与载样缓冲液混合，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物903bp特异条 市。
全文摘要
本发明公开了一种香蕉枯萎病菌4号小种的快速检测方法，包括抽提香蕉植株的DNA、电泳检测模板DNA、PCR扩增DNA扩增、PCR循环和电泳检测步骤，利用香蕉枯萎病菌4号小种的引物进行香蕉植株的DNA进行PCR扩增和循环以后进行电泳检测，整个检测过程耗时6小时之内，大大提高了检测效率，无需对样品中的病原菌进行分离和纯化，步骤简单，容易操作，无需复杂、精密仪器，更加准确灵敏，有利于快速、便捷开展植物检疫工作。
文档编号G01N27/447GK101178379SQ200710032118
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者廖林凤, 王振中, 纪春艳, 董章勇 申请人:华南农业大学