专利名称：镉离子间接竞争elisa的检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及水产类肉食品的重金属残留的一种快速诊断方法，具体是利用抗重金属镉离子的单克隆抗体对镉离子进行检测的间接竞争ELISA方法。
背景技术：
镉(Cdmium)原子序数48，是严重危害人类健康的重金属之一，主要来源于镉矿、镉冶炼厂。因镉与锌同族，常与锌共生，所以冶炼锌的排放物中必有ZnO，CdO，它们挥发性强，以污染源为中心可波及数千米远。随着我国工农业的迅速发展，环境中重金属的污染越来越严重。重金属污染引起的毒害持久存在，会随土壤、水体再次循环而进入食物链，对食品安全构成威胁，危害人类生命和健康。镉中毒能使肾功能受到破坏，镉进入呼吸道可引起肺炎、肺气肿作用于消化系统则引起肠胃炎。镉中毒者常常伴有贫血，骨骼中有过量镉积累会使骨骼软化、变形、骨折、萎缩，还会引起癌症。我国各类食品中重金属的国家限量卫生标准，农产品安全质量无公害水产品安全要求(2001)中对镉含量都有限定≤0.1mg/kg。欧盟，美国，日本，韩国等我国水产品的主要出口国对水产品的重金属含量的限定也越来越严格，法规和标准也越来越苛刻。
目前重金属镉的检测方法主要有 物理和化学的方法原子吸收分光光度法(AAS)，电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)，电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)，原子荧光光谱分析(AFS)等。这些方法的特点是灵敏、准确，但是需要复杂的仪器设备，专门的分析技术人员，且标准品价格昂贵，前处理麻烦，不能同时检测大量样品，不适合现场及大规模的推广应用。
免疫学检测技术目前较多应用于重金属镉检测的是酶联免疫吸附检测法(ELISA)，其检测的原理是将镉离子与载体蛋白偶联免疫动物，获得针对镉的抗体，利用样品中的镉离子与标准品中镉离子竞争结合抗体并以此对样品中的镉进行定性或定量分析。该法简便、快速，可同时分析大批量样品。
目前国外已开展重金属的免疫学检测技术，成功地制备出In(III)、Pb(II)、Ni(II)、Cd(II)、Hg(II)等特异性重金属抗体，部分抗体已应用于环境检测，研制出重金属的酶联检测试剂盒。国内尚未有重金属的免疫学检测的报道，国外文献报道不充分，依据其不能重复合成人工抗原，因此开发具自主知识产权的重金属的酶联检测方法有重要意义。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用重金属镉单克隆抗体检测镉离子的间接竞争ELISA方法，该方法可以大规模地对海洋鱼贝类食品中残留的重金属镉进行快速、灵敏的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，包括如下步骤分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的镉离子(Cd2+)标准液加入到抗原预包被条的微孔中，再加入抗镉离子的单克隆抗体到每个微孔，混匀孵育，在每个微孔中加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，孵育；经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中镉离子(Cd2+)的含量。
上述镉离子间接竞争ELISA的检测方法，包括如下步骤 (1)在抗原预包被条的每个微孔内分别均加入10μl的100mM EDTA(乙二铵四乙酸)，然后在上述每个微孔中再分别加入80μL鱼贝类样品提取液及80μl系列浓度的Cd2+标准液，混匀；然后每个微孔加入10μL 1∶32000倍稀释的抗镉离子的单克隆抗体；混匀，37℃孵育0.5～2h；然后用洗涤液洗涤微孔； (2)每个微孔加入100μL用稀释液1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5～1h；然后用洗涤液洗涤微孔； (3)每个微孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应10～20min； (4)每个微孔加入50μL 2M H2SO4(终止液)终止反应，并振荡混匀； (5)用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值； (6)将所得标准液和样品吸光度值除以0标准(0浓度(ng/mL)的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，镉离子浓度(μg/kg)的对数为横坐标绘制标准曲线；根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的镉离子浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的镉离子浓度。所述稀释液及洗涤液均为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液。
为了更好地实现本发明，鱼贝类样品提取液按下述方法预处理每克鱼肉或贝肉样品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎匀质；4000rpm/min离心10min，取上清在50℃水浴下氮气流吹干样品；以等体积环己烷和蒸馏水混合提取涡漩1min，取环己烷层，每克样品加入12.5μL 1M HCl，再涡漩1min，静置30min；加入2倍HCl体积量的蒸馏水，8000rpm/min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，用1N NaOH调整到pH7.0～8.0，用稀释液稀释10倍后，即得鱼贝类样品提取液。
所述抗原预包被条是按下述方法制备的 (1)包被用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将Cd-iEDTA-BSA稀释至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得的； (2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将200μl洗涤液加入每个微孔中；3～5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去微孔中的液体；所述洗涤液为含0.05％(质量百分比)吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.2g，Na2PO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20)； (3)封闭在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％(W/V)BSA(牛血清白蛋白)的0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)，37℃封闭0.5h～1.5h； (4)按步骤(2)洗涤微孔3～5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时； (6)干燥微孔板干燥后，即得到抗原预包被条。
所述抗镉离子的单克隆抗体按下述方法制备而成用iEDTA(即1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸)将镉离子偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体(MAb-Cd)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。
上述镉离子进行检测的间接竞争ELISA方法可应用于检测海洋鱼贝类食品等。
本发明是将Cd-iEDTA-BSA包被96孔酶标板，加入镉离子标准液(Cd-EDTA)及待测鱼贝类样品提取液(X-EDTA)，再加入抗镉离子的单克隆抗体，包被抗原Cd-iEDTA-BSA与游离的Cd-EDTA竞争抗镉离子单克隆抗体，洗去游离的Cd-EDTA与MAb-Cd-EDTA的复合物，与包被抗原Cd-iEDTA-BSA结合的MAb再与酶标记的羊抗小鼠IgG抗体结合，经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)，OD值越大，样品中自由的Cd-EDTA含量越少，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中Cd2+的含量。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果 本发明利用得到的分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞可大量制得抗镉离子的单克隆抗体，所建立的方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定样品中Cd2+的含量。整个检测过程大约只需2h，不需大型仪器设备且灵敏度可达到国家检测标准100μg/kg样品。该方法可以大规模地对海洋贝类食品中残留的重金属镉进行快速、灵敏的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。
图1为标准抑制曲线图。
图2为抑制曲线线性回归图。
具体实施例方式 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
试剂的配制 稀释液及洗涤液均为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.2g，Na2PO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20)；显色液为TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液；终止液为2M硫酸溶液即量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml。
实施例1 利用抗镉离子单克隆抗体检测镉离子的间接竞争ELISA方法，包括如下步骤 (A)用iEDTA(即1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸)将镉离子偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体(MAb-Cd)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。
(B)用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得检测抗原Cd-iEDTA-BSA。
(C)抗原预包被条的制备 (1)包被用包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)将Cd-iEDTA-BSA稀释至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜。
(2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将微孔板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去微孔中的液体。用洗瓶将200μl洗涤液加入孔中。3分钟后再次倒出微孔中的液体，完全除去微孔中的液体。
(3)封闭每微孔加入160μL含2％(W/V)BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，37℃封闭1.5h； (4)按步骤(2)洗涤微孔3～5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时； (6)干燥置干燥室干燥后，得到抗原预包被条，装入含干燥剂的包装袋中保存。
(D)样品预处理(鱼肉样品提取液) 取剪碎的鱼肉样品置于离心管中，按每克样品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎匀质；4000rpm/min离心10min，取上清在50℃水浴下氮气流吹干样品；以等体积环己烷和蒸馏水混合提取涡漩1min，取环己烷层，按每克样品加入12.5μL 1M HCl，涡漩1min，静置30min；加入2倍HCl体积量的蒸馏水，8000rpm/min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，用1N NaOH调整到pH7.0～8.0，用稀释液10倍稀释后，取80μL进行分析。
(E)重金属镉离子的检测 (1)每微孔分别加入10μL100mM EDTA溶液，然后再分别加入80μL系列浓度(0、10、50、125、250、500、2000、5000ng/mL)的镉离子标准液及80μL上述处理好的鱼肉样品提取液到微孔中； (2)加入10μL用稀释液1∶32000稀释的抗镉离子的单克隆抗体到已有标准液和鱼肉样品提取液的微孔中，轻轻混合，37℃孵育2h； (3)用洗涤液洗涤微孔3～5次； (4)每个微孔加入100μL用稀释液1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1h； (5)用洗涤液洗涤微孔3～5次； (6)每微孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应10～20min； (7)每微孔加入50μL 2M H2SO4(终止液)终止反应，并轻轻振荡混匀； (8)在15分钟内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值。标准液读数依次为1.785，1.645，1.431，1.147，0.958，0.663，0.362，0.120，样品读数为1.250。
(F)结果判定标准 将所得标准液和样品吸光度值除以0标准(0浓度的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，镉离子浓度(μg/kg)的对数为横坐标绘制标准曲线。
根据每个样品的B/B0值就可以从上述标准曲线上读出对应的镉离子浓度92.826ppb，再乘以相应的稀释倍数，最终计算出样品中实际的镉离子浓度为928.26μg/kg。
实施例2 利用抗镉离子单克隆抗体检测镉离子的间接竞争ELISA方法，包括如下步骤 (A)用iEDTA将镉离子偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体(MAb-Cd)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。
(B)用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得检测抗原Cd-iEDTA-BSA。
(C)抗原预包被条的制备 (1)包被用包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)将Cd-iEDTA-BSA稀释至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板的微孔中，4℃包被过夜。
(2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将微孔板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去微孔中的液体。用多通道移液器将200μl洗涤液加入微孔中。5分钟后再次倒出微孔中的液体，完全除去微孔中的液体。
(3)封闭每微孔加入150μL含3％(W/V)BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，37℃封闭1h； (4)按步骤(2)用洗涤液洗涤微孔5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时； (6)干燥置干燥室干燥后，得到抗原预包被条，装入含干燥剂的包装袋中保存。
(D)样品预处理(贝肉样品提取液) 取剪碎的贝肉样品置于离心管中，按每克样品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎匀质；4000rpm/min离心10min，取上清在50℃水浴下氮气流吹干样品；以等体积环己烷和蒸馏水混合提取涡漩1min，取环己烷层，按每克样品加入12.5μL 1M HCl，涡漩1min，静置30min；加入2倍HCl体积量的蒸馏水，8000rpm/min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，用1N NaOH调整到pH7.0～8.0，用稀释液10倍稀释后，取80μL进行分析。
(E)重金属镉离子的检测 (1)每微孔分别加入10μL100mM EDTA溶液，然后再分别加入80μL系列浓度的镉离子标准液和80μL上述处理好的贝肉样品提取液到微孔中； (2)加入10μL1∶32000稀释的抗镉离子的单克隆抗体到已有标准液和贝肉样品提取液的微孔中，轻轻混合，37℃孵育0.5h； (3)用洗涤液洗涤微孔3～5次； (4)每个微孔加入100μL1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5h； (5)用洗涤液洗涤微孔3～5次； (6)每微孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应10～20min； (7)每微孔加入50μL 2M H2SO4(终止液)终止反应，并轻轻振荡混匀； (8)在15分钟内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值。标准液读数依次为1.757，1.684，1.419，1.128，0.955，0.659，0.344，0.126，样品读数为1.404。
(F)结果判定标准 将所得标准液和样品吸光度值除以0标准(0浓度的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，镉离子浓度(μg/kg)的对数为横坐标绘制标准曲线。
根据每个样品的B/B0值就可以从上述标准曲线上读出对应的镉离子浓度58.288ppb，再乘以相应的稀释倍数，最终计算出样品中实际的镉离子浓度582.88μg/kg。
为验证本发明效果得可靠性，进行以下鉴定 取已经封闭好的酶标板，每微孔加入10μL 100mM EDTA溶液，加入80μL配好的Cd2+标准溶液(0、10、50、125、250、500、2000、5000ng/mL)混匀作为竞争抗原，再加入10μL最佳稀释的单抗工作液(1∶32000倍)，混匀，在一孔中加入100μL洗涤液作为不加单抗的空白对照孔；37℃温育1.5h，洗板)加入用稀释液1∶4000稀释的HRP酶标羊抗小鼠二抗，37℃温育1h，加入100μL TMB底物液显色10分钟，用50μL2M H2SO4终止，用酶标仪于450nm波长下判读。以Cd2+浓度对数为横坐标，B/B0(％)为纵坐标，绘制标准抑制曲线。
从图1、图2可以看到0.050-2μg/ml范围内(B/B0)与Cd2+浓度的对数值呈良好线性关系，相关系数为r＝0.9978，以10％抑制率时Cd2+浓度为最低检测限，达0.010μg/ml。
(2)结果再现性 针对Cd2+检测的精密度测试，批间重复5次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(CV％)如表1所示，显示本发明方法具有很高的再现性。
表1竞争ELISA的批间变异系数 (3)回收率计算 取10g空白鱼肉样品中加入Cd2+标样，提取液稀释(稀释到约在标准曲线的浓度范围之内)后，进行ELISA测定。根据OD值及B/B0值从标准曲线查得Cd2+含量再乘以稀释倍数即为样品中Cd2+的含量，然后计算回收率，见表2。
表2测定样品的回收率 从表中可以看出回收率93～101％。
(4)结果特异性 针对以下重金属运用竞争ELISA进行特异性交叉反应测试，结果如下 表3重金属镉其他几种的交叉反应 结果显示，抗体除对Cd2+以外，对Hg2+有明显的交叉，对其他几种金属则交叉反应很小，因此，此单抗可以用来同时检测Cd2+和Hg2+两种重金属，扩大了应用范围。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于包括如下步骤分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的镉离子标准液加入到抗原预包被条的微孔中，再加入抗镉离子的单克隆抗体到每个微孔，混匀孵育，在每个微孔中加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，孵育；经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各微孔的吸光度，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中镉离子的含量。
2.根据权利要求1所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于包括如下步骤
(1)在抗原预包被条的每个微孔内分别均加入10μl的100mM EDTA，然后在上述每个微孔中再分别加入80μl鱼贝类样品提取液及80μL系列浓度的Cd2+标准液，混匀；然后每个微孔加入10μL 1∶32000倍稀释的抗镉离子的单克隆抗体；混匀，37℃孵育0.5～2h；然后用洗涤液洗涤微孔；
(2)每个微孔加入100μL用稀释液1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5～1h；然后用洗涤液洗涤微孔；
(3)每个微孔加入100μL显色液TMB底物工作液，反应10～20min；
(4)每个微孔加入50μL终止液2M H2SO4终止反应，并振荡混匀；
(5)用酶联读数仪测定在450nm波长下的吸光度；
(6)将所得标准液和样品吸光度值除以0标准的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，镉离子浓度的对数为横坐标绘制标准曲线；根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的镉离子浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的镉离子浓度；所述稀释液及洗涤液均为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于所述鱼贝类样品提取液按下述方法预处理每克鱼肉或贝肉样品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎匀质；4000rpm/min离心10min，取上清在50℃水浴下氮气流吹干样品；以等体积环己烷和蒸馏水混合提取涡漩1min，取环己烷层，每克样品加入12.5μL 1M HCl，再涡漩1min，静置30min；加入2倍HCl体积量的蒸馏水，8000rpm/min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，用1N NaOH调整到pH7.0～8.0，用稀释液稀释10倍后，即得鱼贝类样品提取液。
4.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于所述抗原预包被条是按下述方法制备的
(1)包被用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将Cd-iEDTA-BSA稀释至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得的；
(2)洗涤倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将200μl洗涤液加入每个微孔中；3～5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去微孔中的液体；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液；
(3)封闭在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％BSA的0.01MPBS，37℃封闭0.5h～1.5h；
(4)按步骤(2)洗涤微孔3～5次；
(5)加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
(6)干燥微孔板干燥后，即得到抗原预包被条。
5.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于所述抗镉离子的单克隆抗体按下述方法制备而成用iEDTA将镉离子偶联到血蓝蛋白上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种镉离子检测的间接竞争ELISA方法，该方法分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的镉离子标准液加入到抗原预包被条的微孔中，再加入抗镉离子的单克隆抗体到每个微孔，混匀孵育，在每个微孔中加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，孵育；经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各微孔的吸光度，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中镉离子的含量。本发明利用得到的可分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞可大量制得抗镉离子的单克隆抗体，所建立的方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定样品中镉离子的含量。本发明可以大规模地对海洋鱼贝类食品中残留的重金属镉进行快速、灵敏的检测。
文档编号G01N33/577GK101196521SQ20071003291
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者向军俭, 王建华, 勇 唐, 峙 黄, 宁 邓, 宏 王, 杨红宇 申请人:暨南大学