专利名称：一种霍乱毒素检测免疫传感器及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种传感器，具体涉及一种检测霍乱毒素的免疫传感器及制备方法和应用。
背景技术：
人类历史上已有七次世界性的霍乱大流行。在南亚、非洲和拉丁美洲的部分地区,霍 乱已呈现地方性流行,季节性暴发很普遍，与贫困和较差的卫生状况密切相关。所以对于 霍乱毒素的及时检测对人类具有重大意义。现在使用的检测方法有酶联免疫法，PCR 法、山梨醇发酵试验和CT平板测定法等。这些检测方法大都步骤繁琐，检测所需时间都 在5小时以上，所需仪器成本高。不适宜在疫情现场对霍乱弧菌的快速检测。而基于脂 质体的霍乱毒素免疫传感器可以更快速准确的检测霍乱毒素，实验所需仪器便携且价格 低廉。 发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种简单、灵敏、快速、耗费低 且可以反复使用的霍乱毒素检测免疫传感器以及它的制备方法。本发明的另一目的在于，提供一种利用霍乱毒素检测免疫传感器快速检测霍乱病毒 的方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案一种霍乱毒素检测免疫传感器，包括石英晶振、石英晶振上的疏水层和疏水层上的 磷脂膜。所述疏水层为十八垸基硫醇，磷脂膜为修饰了神经节苷脂的脂质体磷脂膜。 一种制备上述霍乱毒素检测免疫传感器的方法，包括以下步骤1、 将石英晶振浸入十八垸基硫醇溶液中，组装过夜，从而在石英晶振的金盘表面自 组装一层疏水层；2、 将自组装了疏水层的石英晶振置于修饰了神经节苷脂的脂质体溶液中，修饰了神 经节苷脂的脂质体会自发的铺展在石英晶振表面，进而形成一层磷脂膜，制得本发明霍 乱毒素检测免疫传感器。所述表面修饰了神经节苷脂的脂质体溶液的制备方法为将二棕榈酸磷脂(DPPC) 和神经节苷脂(GM1)按照摩尔比为97. 5 : 2. 5的比例称取，溶于甲醇和氯仿的混合溶液 中，所述甲醇和氯仿的体积比为1 : 6;真空旋转蒸发，除去有机溶剂后在烧瓶壁上留下 一层均匀的磷脂膜，加入磷酸缓冲溶液(pH=7.4)，然后将磷脂膜在5(TC的水浴中溶涨 半小时，最后用探头超声仪超声则得到大小均匀的修饰了GM1的脂质体溶液。 一种利用霍乱毒素免疫传感器检测霍乱病毒的方法，包括以下步骤 将霍乱毒素检测免疫传感器浸入磷脂浓度为0. 5mg/mL的脂质体分散的磷酸盐缓冲溶 液中；当压电仪器的频率达到稳定后加入霍乱毒素，用实时检测观察到最初阶段频率下 降非常迅速，在10分钟内可以完成90%的反应，压电响应频率和霍乱毒素在1 6Pg/mL 的范围内成线性关系，检测下限为100ng/mL。本发明的优点是1、所制备的霍乱毒素检测免疫传感器再生十分简单，检测后分别 用己醇和水，将石英晶振表面彻底冲洗干净，就可以恢复到自组装的疏水层界面，然后 再铺展磷脂膜进行新的霍乱毒素检测即可；自组装的疏水层十分稳定，可以反复使用20 次而无明显信号下降，并且疏水层放置于空气中数天天使用也不影响检测信号。2、解决 了霍乱毒素快速检测的系列问题由于GM1 (神经节苷脂)对霍乱毒素B亚单位的特异性 识别，利用支撑磷脂膜将不溶于水的GM1固定在传感界面和脂质体上，脂质体是磷脂双 层膜在水相中均匀分散的微囊，磷脂膜与生物膜类似，除了可以很好的降低界面上的非 特异性吸附外，还能很好的保持所固定的生物分子的活性，真实的模拟生物分子之间的 相互作用。3、检测步骤简单，检测时间不超过0.5小时，检测所需的压电仪器便携且价 格低廉。4、本传感器对霍乱毒素的响应效果十分明显，但对其他蛋白质几乎没有频率响 应，表面用磷脂膜修饰石英晶振表面起了很好的抑制非特异性吸附的效果。5、利用磷脂 膜固定捕获探针并在同时引发脂质体特异性凝集的方法检测霍乱毒素，是文献从未报道 过的。6、本发明应用了压电石英晶振微天平作为检测手段，压电石英晶振不仅可以响应 晶体表面的质量负载，既霍乱毒素在晶阵表面的特异性识别；还可以响应由于脂质体特 异性凝集而产生的体系(溶液)的密度、粘度等多种参数的变化。并且均相溶液中特异 型凝集的脂质体会自组装到捕获了霍乱毒素的石英晶振传感界面，进而使界面的质量响 应大大的提高，明显地放大了检测信号，提高了传感器的灵敏度。
图1:响应频率与不同浓度的霍乱毒素的标准曲线。
具体实施方式
实施例l:霍乱毒素检测免疫传感器的制备 1、 石英晶振用新配的Piranha洗液(VH2SM : VH2。2 = 7 : 3)洗涤三次，每次三分钟， 以清洁晶振表面，然后用纯水洗净，于氮气下干燥备用。2、 将处理好的石英晶振浸入2mM的十八垸基硫醇的乙醇溶液中，组装过夜，从而在 石英晶振的金盘表面自组装一层均匀致密的疏水层；3、 制备表面修饰了 GMl的脂质体溶液分别称取2mg的DPPC和0. 247mg的GMl， 溶于甲醇和氯仿的混合溶液(1 : 6v/v)，真空旋转蒸发，除去有机溶剂后在烧瓶壁上留 下一层均匀的磷脂膜，加入4mL的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)，将磷脂膜在50°C的水浴中 溶涨半小时，最后用探头超声仪超声则得到大小均匀的修饰了 GMl的脂质体颗粒的水溶 液。4、 将上述自组装了疏水层的石英晶振置于上述制备好的修饰了 GMl的脂质体水溶液 中，修饰了GM1的脂质体会自发的铺展在石英晶振表面，即制得本发明传感器。实施例2:霍乱疫苗的检测将本发明霍乱毒素检测免疫传感器浸入磷脂浓度为0. 5mg/mL的脂质体分散的磷酸盐 缓冲溶液U/15M的Na2HP04和1/15 M的KH2P04按照体积比4 : 1混合配制，PBS， pH=7.4)中，并用压电仪器检测其频率。在压电仪器输出电压为(-10V 10V)的作用 下，电子计数仪可以显示AT切割的9M石英晶振产生的响应频率。通过与电脑相连和数 据处理软件，每秒种读取一个频率响应数据，并将其频率响应与时间作图可以得到频率 响应的实时响应曲线。当频率达到稳定后加入由上海联合赛尔生物工程有限公司提供的 L霍乱毒素疫苗终浓度为1 U g/mL的霍乱疫苗溶液到检测溶液中，用实时检测观察到 最初阶段频率下降非常迅速。在10分钟内可以完成90%的反应，整个检测响应过程不超 过半小时。加入牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人免疫球蛋白等样品溶液(3uL，终浓 度为50ug/mL，购于鼎国生物有限公司)所引起的频率响应小于10Hz，为背景频率响应。 lwg/mL霍乱疫苗溶液的响应频率为770Hz，根据工作曲线(图1，图中各点分别用已知 浓度的霍乱毒素纯抗原检测溶液按上述方法测定)上响应频率770Hz对应的浓度值，得 到霍乱毒素的浓度为0.96ixg/mL。结果表明，本传感器可以对霍乱疫苗溶液中霍乱毒素 进行快速检测。实施例3:霍乱病人血液样品的检测将本发明霍乱毒素检测免疫传感器浸入磷脂浓度为0. 5mg/mL的脂质体分散的磷酸盐
缓冲溶液中，并用压电仪器检测其频率。在压电仪器输出电压为(-iov iov)的作用下,电子计数仪可以显示AT切割的9M石英晶振产生的响应频率。通过与电脑相连和数据处 理软件，每秒种读取一个频率响应数据，并将其频率响应与时间作图可以得到频率响应 的实时响应曲线。当压电仪器的频率达到稳定后加入血桨样品3"L，由湖南大学校医院 提供，用实时检测观察到最初阶段频率下降非常迅速，在10分钟内可以完成90%的反应, 整个检测响应过程不超过半小时，正常血浆样品所引起的频率响应为10Hz，为背景频率 响应。病人血桨样品1的响应频率为920Hz,根据工作曲线上(如图1可知)响应频率 920Hz对应的浓度值，得到霍乱毒素的浓度为2.25ng/mL。与酶联免疫方法得的检测结 果2. 34ix g/mL基本一致；病人血浆样品2的检测频率响应为596Hz，根据工作曲线上(如 图1可知)响应频率596Hz对应的浓度值，得到的霍乱毒素浓度为0. 9ix g/raL，与酶联免 疫法得出的检测结果0.96pg/mL基本一致。对比结果表明，本传感器可以快速准确的对 霍乱毒素进行检测。
权利要求
1、一种霍乱毒素检测免疫传感器，包括石英晶振，其特征在于还包括石英晶振上的疏水层和疏水层上的磷脂膜。
2、 根据权利要求1所述的霍乱毒素检测免疫传感器，其特征在于所述疏水层为十八 烷基硫醇，所述磷脂膜为修饰了神经节苷脂的脂质体磷脂膜。
3、 一种制备权利要求1或2所述霍乱毒素检测免疫传感器的方法，其特征在于包括以下步骤a、 将石英晶振浸入十八烷基硫醇溶液中，组装过夜，从而在石英晶振的金盘表面自 组装一层疏水层；b、 将自组装了疏水层的石英晶振置于修饰了神经节苷脂的脂质体溶液中，修饰了神 经节苷脂的脂质体会自发的铺展在石英晶振表面，进而形成一层磷脂膜，制得本发明霍 乱毒素检测免疫传感器。
4、 根据权利要求3所述制备霍乱毒素检测免疫传感器的方法，其特征在于，所述表 面修饰了神经节苷脂的脂质体溶液的制备方法为将二棕榈酸磷脂和神经节苷脂按照摩 尔比为97.5 : 2.5的比例称取，溶于甲醇和氯仿的混合溶液中；真空旋转蒸发，除去有 机溶剂后在烧瓶壁上留下一层均匀的磷脂膜，加入磷酸缓冲溶液，然后将磷脂膜在水浴 中溶涨半小时，最后用探头超声仪超声则得到大小均匀的修饰了神经节苷脂的脂质体溶 液。
5、 根据权利要求4所述制备霍乱毒素检测免疫传感器的方法，其特征在于，所述甲 醇和氯仿的体积比为1 : 6。
6、 一种利用权利要求1或2所述的霍乱毒素检测免疫传感器检测霍乱病毒的方法， 其特征在于包括以下步骤将霍乱毒素检测免疫传感器浸入含磷脂的脂质体分散的PBS 中；当压电仪器的频率达到稳定后加入霍乱毒素，用实时检测观察到最初阶段频率下降 非常迅速，在10分钟内可以完成90%的反应，压电响应频率和霍乱毒素在1 6Pg/mL 的范围内成线性关系，检测下限为100ng/mL。
全文摘要
本发明提供了一种霍乱毒素检测免疫传感器，包括石英晶振，石英晶振上的疏水层和疏水层上的磷脂膜；本发明还给出了所述霍乱毒素检测免疫传感器的制备方法。本发明霍乱毒素检测免疫传感器制备简单、反应灵敏、检测快速、耗费低且可重复使用。
文档编号G01N33/53GK101149378SQ20071003606
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者俞汝勤, 吴海龙, 沈国励, 蒋健晖, 欢 陈 申请人:湖南大学