专利名称：微量中性化合物的富集分离方法
技术领域：
本发明涉及一种微量中性化合物的富集分离方法，特别是利用含吸电子取代基团的酯类作为液-液萃取溶剂并结合胶束电动色谱来富集分离微量中性化合物的方法，属化学萃取及色谱和电泳分析相结合的富集分离技术领域。
背景技术：
自从1984年Terabe等人发明胶束电动色谱以来，它一直在分离中性化合物方面备受瞩目。胶束电动色谱是一种电泳模式，它的分离原理主要是基于溶质在胶束相和水相之间的分配。通常情况下，在电泳缓冲液中加入浓度大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂来实现胶束电动色谱的操作。这种方法优点包括分离效率高、分析时间短、操作简单、试剂及试样消耗少。
但是胶束电动色谱也和其它电泳模式一样存在缺点，由于一般毛细管的内径小于100μm，导致柱上检测光程变短，检测灵敏度较低，尤其是一般商品化仪器所配备的紫外-可见检测器检出限仅为10-6～10-5mol/L，常常不能满足低浓度实际样品分析的要求，如环境样品中痕量污染物的监测和临床上痕量生化物质的分析。改善毛细管电泳分析的检出限是毛细管电泳研究中的一个重要方面，对于痕量分析具有重要的实际意义。目前，改善毛细管电泳检出限的方法主要有三种(1)通过设计特殊类型的检测池，扩展在毛细管上的检测光程；(2)发展高灵敏度的检测器，如激光诱导荧光检测、化学发光检测、电化学检测器等；(3)采用样品富集技术，包括离线富集技术和在线富集技术。毛细管电泳高灵敏检测联用技术虽有多种报导，但是成本低廉的商品化检测器却并不多见，采用前两种方法改善毛细管电泳分析的检出限通常需特殊设备或仪器改造，成本高。因此，诸多的研究工作集中在毛细管电泳样品富集技术方面。
富集技术可使毛细管电泳的检测灵敏度显著提高，浓度检出限降低。在一定程度上弥补了毛细管电泳在痕量检测方面的不足，扩展了毛细管电泳的应用范围，也即扩大了胶束电动色谱的应用范围，适用于毛细管电泳分析的样品富集技术具有操作简单、成本低廉、富集倍数高等优点。
目前，富集中性化合物的方法主要分为在线富集和离线富集两大模式。在线富集技术是近几年发展起来的新的毛细管电泳富集技术，由于操作简单、节省时间以及样品不易污染和损失而成为目前在提高毛细管电泳检测灵敏度方面的热点例如Liu等首次介绍了电堆积(stacking)富集技术，Quirino和Terabe提出了一个新的概念“扫集”为样品富集的新方法。Nielson和Foley报道了电动进样中样品基质中使用阴离子混合胶束的方法。Palmer等介绍了一种通过引入高电导的样品来提高灵敏度的策略。总之，不同的研究者采用不同的在线富集中性化合物的技术极大地提高了富集倍数。正如我们所指出的采用样品区带增长的在线富集技术的富集因子是存在上限的，就峰面积而言，富集因子的数值不可能高于样品总进样量与参照标准进样量的比值，(通常这一比值等于进样区带的长度与参照标准的区带长度之比)。就峰高而言，富集因子的数值不可能高于进样的区带长度与在线检测窗口宽度的比值。因此，对于所有采用样品区带增长的在线样品富样技术都受到了进样的限制。事实上，富集因子还可能受到样品基质变化的影响。
离线富集技术包括萃取、经典柱色谱、化学沉淀等方法。萃取包括液-液萃取、固相萃取和固相微萃取。总之，在胶束电动色谱样品前处理技术中，萃取兼有样品富集和净化双重作用，而且还可以减少复杂样品中来自于样品基质的干扰。由于固相萃取和固相微萃取可以避免使用有毒和易燃的有机溶剂，已经成功用于与GC和HPLC的在线耦联，而固相萃取和固相微萃取与脑束电动色谱在线耦联却很困难，这是由于固相的脱附效率低和毛细管样品体积容量小，那么固相萃取和固相微萃取多用于胶束电动色谱的离线富集模式的应用。也有报道关于液-液萃取用于胶束电动色谱的样品前处理，但是只限于离线模式。液-液萃取与胶束电动色谱在线耦联存在两方面的难题，第一，柱内径和柱体积太小；第二，通常所使用的与水不混溶的萃取溶剂由于其电导低而无法维持毛细管电泳运行所需的电流。
通常在胶束电动色谱样品前处理中的萃取过程后都有一个溶剂蒸干-重调步骤，这个过程不仅耗时而且易使样品污染和损失。Zhan等近期报道了一种将液-液半微量萃取用于胶束电动色谱样品前处理的新技术，这种方法采用乙酸乙酯作为萃取剂，乙酸乙酯在NaOH碱催化下于毛细管内分解，解决了电流难以维持的问题。但是，这种方法也存在不足，引入NaOH作为碱性催化剂使得操作繁琐，NaOH还可能对某些溶质有催化作用。因此，为进一步扩大胶束电动色谱对实际样品的分析应用，液-液萃取与胶束电动色谱耦联还应发展新的方法。
发明内容
本发明的目的在于实现实-液萃取与胶束电动色谱的耦联结合而提供一种微量中性化合物的富集分离方法。
本发明一种微量中性化合物的富集分离方法，其特征在于利用含吸电子取代基团的酯类作为液-液萃取溶剂耦联结合胶束电动色谱来富集分离微量中性化合物；该方法具有的过程和步骤如下a.制备标准溶液称取一定量的中性化合物标准样品，先加适量溶剂溶解，再于容量瓶中加水稀释至一定体积；然后取一定量的标准溶液放置于胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内；然后对该标准溶液进行胶束电动色谱分析测定；b.对标准溶液的萃取另取上述一定量的标准溶液，置入玻璃容器中，加入少量含吸电子取代基团的酯作为萃取溶剂，以人工或机械搅拌方式使玻璃容器中的水相和酯相充分混合，然后静置分层，用柱射器或玻璃吸管取出酯相，将分离出的酯相直接移至胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，然后进行萃取后酯相中的中性化合物的胶束电动色谱分离测定；c.取一定体积的实际样品溶液，装入玻璃容器中，加入少量含吸电子取代基团的酯作为萃取溶剂，以人工或机械搅拌方式使玻璃容器中水相和酯相充分混合，然后静置分层，用注射器或玻璃吸管取出酯相，将分离出的酯相直接移至胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，然后进行萃取后酯相中的中性化合物的胶束电动色谱分离测定；d.通过测定对样品萃取前后的中性化合物的出峰时间和出峰面积进行富集倍数的计算及样品浓度的测定。
上述的方法中，所述的含吸电子取代基团的酯类包括有氯代乙酸酯、溴代乙酸酯、或硝基乙酸酯；所述的中性化合物为含苯环的芳香族化合物，包括有苯醇类、苯酮类、酚类、或苯胺类化合物。
本发明方法中，所述的胶束电动色谱仪中毛细管电泳的条件为毛细管长度为10～100cm，毛细管内径为25～100μm，分离电压为10～30KV，温度为10～40℃，紫外检测波长为214nm。
本发明方法的优点和特点如下所述(1)本发明方法采用酯作萃取溶剂，在胶束电动色谱过程中，无需另加催化剂，可自行分解来维持毛细管电泳运行所需的电流，从而克服了现有液-液萃取与胶束电动色谱耦联中存在的问题。
(2)操作简便，萃取方法简单易行，萃取平衡时间短，无需蒸干或吹干萃取溶剂，萃取后分离出的酯相可以直接进行胶束电动色谱分离。
(3)无需特殊设备，本发明方法仅需常规毛细管电泳装置和液-液萃取装置。
(4)标样用量少，使用的中性化合物只需几十微克至毫克，而且可用于多次分析过程；萃取溶剂消耗少，且一次取样可用来多次重复分离分析。
(5)灵敏度高，检出限低；利用本发明方法使许多中性化合物的富集倍数达到几十甚至百倍以上；使中性化合物的检出比常规胶束电动色谱的检出限降低一至几个数量级、灵敏度显著提高。
(6)实用性强，适用于富集分离多类中性化合物，尤其适用于环境水样中的微量和痕量有机污染物的分离分析，对环境分析有相当作用。
图1为中性化合物苯乙酮、苯丁酮和苯戊酮萃取前的标样电泳图谱。
其中1为苯乙酮，2为苯丁酮，3为苯戊酮，三者的浓度均为2ppm(mg/L)。
图2为萃取后酯相中的苯乙酮、苯丁酮和苯戊酮的电泳图谱。
其中1为苯乙酮，2为苯丁酮，3为苯戊酮，三者萃取前的浓度为2ppm(mg/L)。图中最大的宽峰是在毛细管中未分解的萃取剂氯乙酸甲酯；4和5是由于萃取剂氯乙酸甲酯不纯而产生的杂质峰。
图3为实际环境水样萃取前后的胶束电动色谱图谱。
其中曲线a为实际环境水样萃取前的胶束电动色谱图谱，曲线b为实际环境水样萃取后的胶束电动色谱图谱。其中最宽的大峰是在毛细管中未分解的萃取剂氯乙酸甲酯；4和5是由于萃取剂氯乙酸甲酯不纯而产生的杂质峰。
具体实施例方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。
实施例1本实施例的具体步骤如下(1).制备标准溶液分别称取三种中性化合物苯乙酮17.1mg、苯丁酮16.9mg、苯戊酮17.0mg；先用4ml甲醇溶三种中性在物；然后用去离子水将三种中性化合物分别定容于250ml的容量瓶中，作为标样的储备液；按需要再进行稀释至各化合物的浓度均为2ppm(mg/L)；然后取1ml稀释液置于胶束动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，对其进行毛细管电泳分离测定。(参见图1)(2)对标准溶液的萃取分别取上述三种标样储备液3ml，混合于100ml的容量瓶中，用去离子水定容至刻度线，摇匀；萃取前三种中性化合物的浓度为2ppm(mg/L)；然后加入2.5ml氯乙酸甲酯萃取剂，振荡容量瓶使水相和酯相充分混合，静置分层，用微型注射器移取酯相，将分离出的酯相直接移入到胶束电动色谱仪中的2.0ml的毛细管电泳样品瓶内，进行毛细管电泳测定。(参见图2)(3)对实际环境水样的富集富分和测定取一定体积水样，经0.45μm的滤头在将其注入2ml毛细管电泳样品瓶中，进行毛细管电泳测定。
另取100ml滤过的水样，装入容量瓶中，加入2.5ml氯乙酸甲酯作为萃取溶剂，剧烈振荡使容量瓶中水相和酯相充分混合，静置分层，用微型注射器移取酯相，将分离出的酯相直接移入2ml毛细管电泳样品瓶内，进行毛细管电泳测定。(参见图3)毛细管电泳测定时的条件对于标准以及萃取后的酯相的毛细管电泳测定，其条件为毛细管的长度为55cm，毛管内径为50μm，分离电压为18KV，温度为25℃，检测波长为214nm。
对于前述三种苯酮类中性化合物在萃取前后毛细管电泳测定结果可进行富集倍数的计算；萃取后三种中性在物的峰面积与萃取前标样所得出的三种中性化合物的峰面积之比就是富集的倍数。根据实验所得数据计算得出，上述苯乙酮、苯丁酮和苯戊酮三者的富集倍数分别为63、73和151。苯乙酮的检限为100ppb(μg/L)，苯丁酮和苯戊的检限达到50ppb(μg/L)。
本发明方法适用于环境水样中的微量和痕量有机污染物的富集分离分析，对环境分析有相当作用。
权利要求
1.一种微量中性化合物的富集分离方法，其特征在于利用含吸电子取代基团的酯类作为液-液萃取溶剂耦联结合胶束电动色谱来富集分离微量中性化合物；该方法具有的过程和步骤如下a.制备标准溶液称取一定量的中性化合物标准样品，先加适量溶剂溶解，再于容量瓶中加水稀释至一定体积；然后取一定量的标准溶液放置于胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内；然后对该标准溶液进行胶束电动色谱分析测定；b.对标准溶液的萃取另取上述一定量的标准溶液，置入玻璃容器中，加入少量含吸电子取代基团的酯作为萃取溶剂，以人工或机械搅拌或振荡方式使玻璃容器中的水相和酯相充分混合，然后静置分层，用注射器或玻璃吸管取出酯相，将分离出的酯相直接移至胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，然后进行萃取后酯相中的中性化的胶束电动色谱分离测定；c.取一定体积的实际样品溶液，装入玻璃容器中，加入少量含吸电子取代基团的酯作为萃取溶剂，以人工或机械搅拌或振荡方式使玻璃容器中水相和酯相充分混合，然后静置分层，用注射器或玻璃吸管取出酯相，将分离出的酯相直接移至胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，然后进行萃取后酯相中的中性化合物的胶束电动色谱分离测定；d.通过测定对样品萃取前后的中性化合物的出峰时间和出峰面积进行富集倍数的计算及样品浓度的测定。
2.如权利要求1所述的一种微量中性化合物的富集分离方法，其特征在于所述的含吸电子取代基团的酯类包括有氯代乙酸酯、溴代乙酸酯、或硝基乙酸酯；所述的中性化合物为含苯环的芳香族化合物，包括有苯醇类、苯酮类、酚类、或苯胺类化合物。
3.如权利要求1所述的一种微量中性化合物的富集分离方法，其特征在于所述的胶束电动色谱仪中毛细管电泳的条件为毛细管长度为10～100cm，毛细管内径为25～100μm，分离电压为10～30KV，温度为10～40℃，紫外检测波长为200-360nm。
全文摘要
本发明涉及一种微量中性化合物的富集分离方法，特别是利用含吸电子取代基团的酯类作为液－液萃取溶剂结合胶束电动色谱来富集分离微量中性化合物的方法，属化学萃取及色谱和电泳分析相结合的富集分离技术领域。本发明方法是取一定体积的样品溶液放于玻璃容器中，加入少量含吸电子取代基团的酯类如氯乙酸甲酯作为萃取溶剂，通过搅拌或振荡使容器中的水相和酯相充分混合，静置分层，用吸管取出酯相放入胶束电动色谱仪中的毛细管电泳样品瓶内，进行毛细管电泳测定。测定过程包括对萃取前后中性化合物的出峰时间和出峰面积的测定，还包括萃取前后中性化合物的富集倍数的计算及样品浓度测定。本发明方法适用于液体样品，尤其是环境水样中低浓度中性化合物的富集分离测定。
文档编号G01N1/40GK101074942SQ20071003870
公开日2007年11月21日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者王田霖, 唐婧, 万文, 何海波, 赵淑贞 申请人:上海大学