专利名称：一种检测少儿哮喘遗传易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测少儿哮喘遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与少儿哮喘遗传易感性密切相关的编码具有凝血酶敏感蛋白基序12的解离素-金属蛋白酶 (ADAMTS12)、 E74样因子5 (ELF5)、白介素-17 (IL-17)和受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D (PTPRD)四种基 因的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿哮喘遗传易感性。
背景技术：
过敏性哮喘(asthma)在我国是儿童常见病，临床上表现为反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽 等症状，多在夜间或凌晨发作。我国患病率约1%，过敏性哮喘占哮喘症的60%。过敏性哮喘患者常常有 家族史，但近些年该病发病率持续上升，这和环境恶化有密切关系。大气污染、烟尘、运动、冷空气刺激、 精神刺激以及社会、家庭、心理等因素均可诱发哮喘，过敏原如花粉、屋尘、尘螨、动物毛屑、霉菌及职 业性抗原等的大量吸入，食物、化学制品、药品等经胃肠道、皮肤接触或注射均可引发哮喘。过敏性哮喘 反复发作严重儿童的生长发育、生活、学习，当前已经引起社会和医疗界的广泛关注。
过敏性哮喘病因复杂，包括遗传和环境因素，IgE介导的肥大细胞被激活所致的I型超敏反应是发病 的重要因素，但不能解释全部病因。发病有家族性，提示遗传因素与发病相关。目前已经明确许多基因参 与发病。总IgE及特异性IgE (slgE)的产生及气道的高反应性均为特定基因控制。研究提示，常染色体 llq、 12q、 13 q上有控制IgE的反应性的基因，过敏性哮喘与第11染色体上D11S97的DNA多态性有关。
目前，经证实并且机理研究清楚的已知编码具有凝血酶敏感蛋白基序12的解离素-金属蛋白酶 (ADAMTS12)、 E74样因子5 (ELF5)、白介素-17 (IL-17)和受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D (PTPRD)的四种 基因与过敏性哮喘的遗传易感性有密切关系。
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对以 上基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估并递交认定申请后， ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036 号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号SNP位点、rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点通 过了家生物基因检测技术应用评估认证中心的认定，可以用来评估少儿哮喘遗传易感性。
发明内容
基于ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上 的rs8193036号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号SNP位点、rs2175595号SNP位点和rs腿5925 号SNP位点多态性可用来评估少儿哮喘遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测少儿哮喘遗传易感性的 试剂盒。
该试剂盒包括
检测ADAMTS12基因上的rs545861号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测ELF5基因上的rs3901901号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测IL-17基因上的rs8193036号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测PTPRD基因上的rs2279776号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测PTPRD基因上的rs2175595号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测PTPRD基因上的rsl0815925号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5基因上的 rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号SNP位点、 rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这6个SNP位点的DNA片段 的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 1
和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进 行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这六对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5基因上 的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号SNP位 点、rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这六 个SNP位点基因型的Taqraan探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒 中包含具有SEQ ID NO: 13和14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman 探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特 异性荧光T叫man探针对不限于这六对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估少儿 哮喘遗传易感性的六个SNP位点的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括
6nl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，
0. 6nl 25mM dNTP混合液，
3.6nl 25mM MgCl2溶液，
0. 15nl (5units/Vl) Taq DNA聚合酶，
20nM特异性引物对每条引物各0.225nl，
10nM特异性荧光探针对每条探针各0. 25^1，
去离子水31. 95nl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测少儿哮喘遗传易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针对:
有义引物l: 5， - CAATCCTGTGTTTGTTAGTTGTGCTAT —3， (SEQ ID NO: 1)
反义引物l: 5， -GATTTGCACAGCAAATTGAGTTAGA -3' (SEQ ID NO: 2)
有义引物2: 5， - TCATTMCCTCGTTCCMCATGTM -3， (SEQ ID NO: 3)
反义引物2: 5， - CGGACTCCAGTGAGCCATMTT -3， (SEQ ID NO: 4)
有义引物3: 5， - CCATCATGTCTCCTCTCCTTTCTAGT -3' (SEQ ID NO: 5)
反义引物3: 5， - TGTTCCMCCCTGCATGCT -3' (SEQ ID NO: 6)
有义引物4: 5， -GGAGAGATCCCTGTGTTGCMTAT -3， (SEQ ID NO: 7)
反义引物4: 5， - CAGGCTGTTTCCTCTTGTGATGT -3， (SEQ ID NO: 8)
有义引物5: 5， - GCTTTGCTAAGTGGCATTCTAGAGT -3， (SEQ ID NO: 9)
反义引物5: 5' -GGGATGAAAAACGGCACATT -3， (SEQ ID NO: 10)
有义引物6: 5， - CATTTACAAAGCTAGAGACAGMTGCA -3， (SEQ ID NO: 11)
反义引物6: 5， -GTAGMTATGTAGGAGATCAGCTGTTTGA-3' (SEQ ID NO: 12)
带VIC荧光基团探针l: 5， - TCTGTAGMGTTCAGCC -3， (SEQ ID NO: 13)
带FAM荧光基团探针l: 5' -CTGTAGGAGTTCAGC -3' (SEQ ID NO: 14)
带VIC荧光基团探针2: 5， - AMGCCTTCTTGCTGC -3， (SEQ ID NO: 15)
带FAM荧光基团探针2: 5， - AMGCCTCCTTGCTG -3， (SEQ ID NO: 16)(SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)
(SEQ ID NO: 20) -3， (SEQ ID NO: 21) -3'(SEQ ID NO: 22)
带VIC荧光基团探针3: 5' -CTCCATCTTCATCACCT -3' 带FAM荧光基团探针3: 5' - TCCATCTCCATTCACC -3， 带VIC荧光基团探针4: 5' -CCTATAGCCATCTATG -3' 带FAM荧光基团探针4: 5， -TCCTATACCCATCTATG -3' 带VIC荧光基团探针5: 5， - CTTCCTATCTTATCTCTTTAT 带FAM荧光基团探针5: 5， - CTTCCTATCTAATCTCTTTAT 带VIC荧光基团探针6: 5' - CAATTTTAGAGGTAGTTCCA -3， (SEQ ID NO: 23) 带FAM荧光基团探针6: 5， -CMTTTTACAGGTAGTTCC -3， (SEQ ID NO: 24)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测ADAMTS12 基因上的rs545861号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测ELF5基因 上的rs3901901号SNP位点多态性；
有义引物3,反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测IL-17基因 上的rs8193036号SNP位点多态性；
有义引物4，反义引物4、带VIC荧光基团探针4、带FAM荧光基团探针4特异地针对检测PTPRD基因 上的rs2279776号SNP位点多态性；
有义引物5，反义引物5、带VIC荧光基团探针5、带FAM荧光基团探针5特异地针对检测PTPRD基因 上的rs2175595号SNP位点多态性；
有义引物6，反义引物6、带VIC荧光基团探针6、带FAM荧光基团探针6特异地针对检测PTPRD基因 上的rsl0815925号SNP位点多态性；
6个SNP位点分别进行6次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10nl，包含浓度为 20ng/pl的DNA模板2pl、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6pl 25mM MgCl2 溶液、0.025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有义引物和反义引物各0. 225^1、 10nM的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1,去离子水5. 325^1 。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的 95°C、 30秒，60°C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3: SNP基因型分析 '
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行少儿哮喘遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DM抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5 基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号 SNP位点、rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点分别进行荧光定量PCR检湖!l，确定这六个SNP 位点的基因型。
步骤3:少儿哮喘遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具少儿哮喘遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检 测者少儿哮喘遗传易感性的高低，并由医师向被检者详细说明和解读少儿哮喘遗传易感性分析报告单。
序歹lj表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120> —种检测少儿哮喘遗传易感性的试剂盒
<腸24
<210〉 1 <211> 27 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223〉引物 〈400〉 1
CAATCCTGTG TTTGTTAGTT GTGCTAT
27
<210〉 2 <211〉 25 <212>腿 <213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 2
GATTTGCACA GCAAATTGAG TTAGA 25
<210> 3 〈211〉 25 〈212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>引物 <400> 3
TCATTAACCT CGTTCCAACA TGTAA 25
〈210〉 4 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223>引物 〈400〉 4
CGGACTCCAG TGAGCCATAA TT 22
<210> 5 <211〉 26 <212>腿 〈213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 5
CCATCATGTC TCCTCTCCTT TCTAGT 26
<210〉 6 〈211〉 19 〈212〉腿 〈213〉人工序列
<220>
<223>引物 〈400〉 6
TGTTCCAACC CTGCATGCT 19
<210> 7 〈211> 24 <212>腿 〈213〉人工序列
<220〉
〈223>引物 〈400〉 7
GGAGAGATCC CTGTGTTGCA ATAT 24
〈210〉 8 〈211〉 23 <212〉腿 〈213>人工序列
<220>
<223>引物 <400> 8
CAGGCTGTTT CCTCTTGTGA TGT 23
<210> 9 <211> 25 〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 9
GCTTTGCTAA GTGGCATTCT AGAGT 25
〈210> 10 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉引物 〈400〉 10
GGGATGAAAA ACGGCACATT 20
<210> 11 <211〉 27 〈212> DNA <213〉人工序列
〈220>
<223>引物 〈400〉 11
CATTTACAAA GCTAGAGACA GAATGCA
<210> 12 <211> 29 〈212〉引物 <213>人工序列
<220>
〈223〉探针 〈400> 12
GTAGAATATG TAGGAGATCA GCTGTTTGA
27
29
〈210> <211> 〈212〉 <213〉
13 17 DNA
人工序列
<220>
<223〉探针 <400〉 13
TCTGTAGAAG TTCAGCC 17
<210> <211〉 <212> 〈213>
14
15 腿
人工序列
<220〉
<223>探针 <400> 14
CTGTAGGAGT TCAGC 15
〈210> 〈211〉 <212> 〈213〉
15
16 DNA
人工序列
<220>
〈223>探针 〈400> 15
AAAGCCTTCT TGCTGC 16
〈210〉 <211> <212> 〈213〉
16 15 腿
人工序列
<220>
<223>探针 <400〉 16
AAAGCCTCCT TGCTG 15 <210〉 17
<211> 17 〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223>探针 簡> 17
CTCCATCTTC ATCACCT 17
<210> <211> <212> <213〉
18 16 腿
人工序列
<220〉
〈223>探针 〈400〉 18
TCCATCTCCA TTCACC 16
<210〉 19 〈211〉 16 <212> DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<223>探针 ■> 19
CCTATAGCCA TCTATG 16
<210〉 20 <211> 17 〈212〉腿 <213〉人工序列
<220〉
<223>.探针 ■〉 20
TCCTATACCC ATCTATG 17
<210> 21 <211> 21 <212>纖 <213>人工序列 <220〉
<223〉探针 ■〉 21
CTTCCTATCT TATCTCTTTA T 21
〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213>
22 21 醒
人工序列
<220〉
<223>探针 <400> 22
CTTCCTATCT AATCTCTTTA T 21
〈210〉 〈211> <212> <213>
23 20 腿
人工序列
<220〉
<223>探针 <400〉 23
CAATTTTAGA GGTAGTTCCA 20
<210> <211〉 <212〉 <213>
24 19 腿
人工序列
<220>
<223>探针 〈400〉 24
CAATTTTACA GGTAGTTCC 19
权利要求
1.一种检测少儿哮喘遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测ADAMTS12基因上的rs545861号SNP位点、ELF5基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、PTPRD基因上的rs2279776号SNP位点、rs2175595号SNP位点和rs10815925号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对ADAMTS12基因上的 rs545861号SNP位点、ELF5基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、PTPRD 基因上的rs2279776号SNP位点、rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点而设计，能特异性扩增 出包含这6个SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对ADMTS12基因上 的rs545861号SNP位点、ELF5基因上的rs3901901号SNP位点、IL-17基因上的rs8193036号SNP位点、 PTPRD基因上的rs2279776号SNP位点、rs2175595号SNP位点和rsl0815925号SNP位点而设计，能通过 荧光定量PCR技术特异性检测出这六个SNP位点基因型的Taqman探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 13和 14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman探针对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括6nl 10 X荧光定量PCR反 应缓冲液、0.6^1 25mM dNTP混合液、3.6^1 25mM MgCl2溶液、0. 15pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM特异性引物对每条引物各0. 225nl、 10nM特异性荧光探针对每条探针各0. 25pl、去离子水31. 95pl。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测少儿哮喘遗传易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测与少儿哮喘遗传易感性密切相关的编码具有凝血酶敏感蛋白基序12的解离素-金属蛋白酶(ADAMTS12)、E74样因子5(ELF5)、白介素-17(IL-17)和受体型蛋白酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)四种基因上六个SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与少儿哮喘遗传易感性密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿哮喘遗传易感性。
文档编号G01N33/50GK101354345SQ20071004428
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司