专利名称：快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法的制作方法
快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法技术领域-本发明涉及蛋白的测定方法，特别是一种能快速测定铜蓝蛋白的免疫共振 散射光谱法。
背景技术：
铜蓝蛋白属于02—球蛋白(CER)，是一种含铜的a—糖蛋白，是人类和脊 椎动物体内唯一的蓝色蛋白质。目前CER检测方法很多，如根据其氧化酶特性， 应用对苯二胺(PPD)法；根据其免疫学特性，测定方法有酶联免疫吸附法、放射 免疫分析法、免疫沉淀比色分析法、火箭免疫电泳分析法、免疫电扩散分析法， 此外，还有脉冲激光声分析法、应用速率散射浊度法等，以上这些方法有的是 灵敏度不高，有的是步骤繁琐，有的由于基质、反应条件等不一致，而结果缺 乏可比性，有的抗血清用量大，且纯度要求高，不易操作。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，而提供一种能简便快速测定铜蓝 蛋白的免疫共振散射光谱法。实现本发明的目的技术方案是利用铜蓝蛋白和羊抗人铜蓝蛋白在一定温 度水浴条件下，产生特异性免疫结合反应生成免疫复合的微粒，此复合物微粒 存在共振散射，铜蓝蛋白在一定浓度范围内随着其浓度的增加，其共振散射强 度线性增强，采用荧光分光光度计对生成的免疫复合物进行同步扫描得到共振散射光谱，依照共振散射强度与CER浓度的线性关系，快速测定出血清中铜蓝蛋白。应用免疫共振散射光谱法快速测定铜蓝蛋白，包括如下步骤(1) 制备已知CER浓度的测试体系依次移取030 mL pH值为6.4的磷 酸盐缓冲溶液(PBS)， 0.20 mL稀释25倍的羊抗人CER溶液， 一定量10.8 P g/mL 的CER溶液，0.50 mL质量浓度为15%的PEG-6000溶液于5mL带刻度的试管 中，用二次蒸馏水定容至2.0mL，混匀，在37。C水浴锅中温育15min;(2) 用步骤(1)的方法不加CER制备空白对照体系；(3) 分别取上述体系于石英池中，在荧光分光光度计上同步扫描激发波长 入ex和发射波长入em (入ex二 A em)，激发和发射狭缝均为5.0nm，测定电压为 450V，得到体系的共振散射光谱，测定490nm处的散射强度IRS，试剂空白为10，计算AlRS-lRs-I。；(4) 以AI^对CER的浓度关系作工作曲线；(5) 依照步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的CER为含有CER 但未知浓度的被测物，求出被测物的AlRs;(6) 依据(4)的工作曲线，计算出被测物的CER的浓度。 本方法检测铜蓝蛋白的浓度线性范围为27 927" g/ml。
本发明的优点是(1) 与己有的方法相比，本测定方法的仪器简单，操作简便，抗干扰强， 灵敏度高，选择性好，反应条件容易达到。(2) 试剂仅为磷酸盐缓冲溶液、羊抗人CER溶液、CER溶液、PEG-6000 溶液，所用羊抗人CER溶液和CER溶液浓度较低，试剂用量少且均无毒。
-图1为本发明实施例的铜蓝蛋白免疫共振散射光谱图，图中曲线a至e表示a; pH 6.4 PBS —羊抗人CER—37.5mg/mL PEG6000;b: a—0.027卩g/mlCER; c: a—0.324 y g/ml CER; d.. a—0.648 ix g/ml CER; e:a—0.972ug/ml CER。
具体实施例方式下面的实施例阐述了本发明建立CER的免疫共振散射光谱分析法的原理是聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，为一种无电荷线形分子的多糖，PEG 可引起免疫复合物沉淀，沉淀具有可逆性，被沉淀的蛋白质的活性不受影响， 可用于免疫复合物的测定。CER与羊抗人CER之间存在结构和空间上的互补性 及亲和性，会发生免疫反应，生成不溶性免疫复合物，其作用力包括电荷引力、 范德华力、氢键结合力、疏水等作用力，二者之间的反应具有较高的特异性， 生成的免疫复合物存在共振散射。在PH6.4的Na2HP04-NaH2P04(PBS)缓冲液中， CER在一定浓度范围内随着其浓度的增加，在4卯nm处的共振散射强度线性增 强，据此建立CER的免疫共振散射光谱分析法。实施例一种能快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法包括如下歩骤(1) 制备已知CER浓度的被测体系，分别用微量取样器移取0.30 mL pH 值为6.4的磷酸盐缓冲溶液于5支5mL带刻度的试管中，每支试管中分别加入 0.20 mL稀释25倍的羊抗人CER溶液(上海北加试剂有限公司提供)，然后用 微量取样器移取浓度为10.8ug/mL的CER溶液0、 5、 60、 120、 180uL分别 注入5支试管中，再分别加入0.50mL质量浓度为15X的PEG-6000溶液，用二 次蒸馏水定容至2.0mL，分别混匀，在37。C水浴锅中温育15min;(2) 依照步骤(1)的方法，不加入CER制备试剂空白体系；(3) 各取适量于不同的石英池中，在Cary Eclipse荧光分光光度计(美国 Varian公司)上同步扫描激发波长A ex和发射波长A em ( A ex= A em)，激发和 发射狭缝均为5.0 nm，测定电压为450V，得到体系的共振散射光谱，测定490nm 处的散射强度IRS，以不加CER溶液测得的共振散射强度Io为空白，计算AI^ 二Irs—Io惶；(4) 以AlRs对CER浓度的线性关系作工作曲线，即AlRs二0.1505c+4.8656， R2=0.9968。(5) 依据步骤(1)的方法，其中加入未知浓度的CER，按照步骤(3)的 方法，求得未知浓度的CER被测物的Alw为45.20;(6) 依据(4)的工作曲线，求出被测物的CER浓度为267.97ng/mL。
权利要求
1.一种快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法，其特征是测定方法包括如下步骤(1)制备已知CER浓度的测试体系依次移取0.30mL pH值为6.4的磷酸盐缓冲溶液，0.20mL稀释25倍的羊抗人CER溶液，一定量10.8μg/mL的CER溶液，0.50mL质量浓度为15％的PEG-6000溶液于5mL带刻度的试管中，用二次蒸馏水定容至2.0mL，混匀，在37℃水浴锅中温育15min；(2)用步骤(1)的方法不加CER制备空白对照体系；(3)分别取上述体系于石英池中，在荧光分光光度计上在激发波长λex等于发射波长λem(λex＝λem)，激发和发射狭缝均为5.0nm，测定电压为450V的条件下同步扫描，得到体系的共振散射光谱，测定490nm处的散射强度IRS，试剂空白为I0，计算△IRS＝IRS-I0；(4)以△IRS对CER的浓度关系作工作曲线；(5)依照步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的CER为含有CER但未知浓度的被测物，求出被测物的ΔIRS；(6)依据(4)的工作曲线，计算出被测物的CER的浓度。
2. 如权利要求l所述的快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法，其特征 是步骤(2)所述的共振光谱的扫描中，应同步扫描激发波长入ex和发射波长 入em艮卩入ex=入em。
3. 如权利要求l所述的快速测定铜蓝蛋白的免疫共振散射光谱法，其特征 是测定铜蓝蛋白的浓度线性范围是27 927p g/ml。
全文摘要
本发明公开了一种简便、快速测定铜蓝蛋白免疫共振散射光谱法，主要是在37℃水浴条件下，利用羊抗人铜蓝蛋白和铜蓝蛋白在PEG条件下，发生特异性免疫结合反应，生成免疫复合物微粒，此复合物微粒存在共振散射，铜蓝蛋白在一定浓度范围内，其浓度与共振散射强度是线性关系，据此建立起了快速测定铜蓝蛋白新方法。本发明的优点是与已有的方法相比，本测定方法的仪器简单，操作简便，灵敏度高，选择性好，反应条件容易达到；本法羊抗人CER试剂用量少，成本低廉。
文档编号G01N33/68GK101158690SQ20071005060
公开日2008年4月9日 申请日期2007年11月19日 优先权日2007年11月19日
发明者蒋治良, 韦丽丽 申请人:广西师范大学