专利名称：吖啶酯和碱性磷酸酶化学发光免疫分析检测心肌钙蛋白t超敏感方法
技术领域：
本发明属于临床免疫分析领域，建立吖啶酯、碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析检测心肌肌钙蛋白T的方法，以早期、敏感、特异地诊断急性心肌梗死。此外本发明也可用于实验室作生理、病理、药理、分子生物学等多项研究。技术背景心血管疾病是常见病和多发病，是威胁人类健康的首要疾病。急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是常见的心血管疾病。正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，降低 急性期病死率，改善预后具有重要意义。在AMI的诊断方面，常用的心电图诊断的准确度仅 为24 — 60% ( Fesmire FM. etal., Instability of ST segments in the early stages of acute myocardial infarction in patients undergoing continuous 12-Lead ECG monitoring. Am J Emerg Med,1995,13:158 163X远达不到临床要求。在生化诊断方面，肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)等是目前常用的心肌酶谱。但是心肌酶谱并非心脏所特有， 在正常人骨骼肌中也有少量存在。非心脏手术或骨骼肌损伤患者CK-MB也可升高，且CK-MB 在AMI发病后4—8小时才开始升高，持续时间较短(48-72小时)，临床应用受到限制。1987 年英国Cummins等首先报告了用测定周围血中心肌钙蛋白(cTn)的含量用以诊断AMI(Cummins, etal. infarction Am heart J, 1987,113:1333-1334) 。 1991年Katus等人 报道了 cTnT对诊断AMI具有高度敏感性和特异性(clin.chem.l991;83:902-912.)。近年来研 究表明，心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin)是心肌特异的调节蛋白，其亚单位肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白I (cTnl)在AMI时释放入血是心肌损伤的特异性标志物，并具有灵敏 度高，在血中出现时间早，诊断窗口时间长等优点。此外cTnT在预测梗塞面积，评价溶栓 疗效，AMI预后心功能判定，不稳定心绞痛预后评估，围手术期心肌损伤的判定等方面均具有重要的临床价值。以往学者们对cTnT诊断AMI的特异性有些争论。1991年katus发现cTnT与骨骼肌有 1%-2%交叉反应(clin. Chem. 1991; 83 : 902-912.)。但也有学者认为cTnT^f骼肌的基因编 码不同，两者在结构和免疫原方面有很大差异。在检测cTnT的方法改进后，用两种均为心 肌特异的单克隆抗体检测cTnT时，与骨骼肌交叉反应阳性率<0.5% (Katus HA. etal. Clin, chem. 1992 ， 38: 386)。 Baum等人对75名无心脏病的骨骼肌患者(其中33名Duchenne病， 42例马拉松运动员长跑后)用改进后的检测方法检测其cTnT，未发现阳性反应(BodorGS. etal. Clin. chem. 1992,38: 2203.)。由此可以认为，在无心脏病的骨骼肌患者的血浆中及运动 员的血浆中未发现cTnT存在，所以cTnT对诊断急性心肌梗死与cTnl同样具有心肌特异性。 然而当发生AMI时，cTnT在升高倍数和持续时间上优于cTnl。由于cTnT在正常人血清中 含量很低，在心肌细胞中含量高， 一旦少量释放入血浆，cTnT即可升高30-200倍，而cTnl 仅升高10-20倍(杨振华中华医学杂志。1992， 72 (1) 51-52)。另外cTnT在血液和淋巴 液中消除速率慢，AMI时cTnT升高可持续2—3周，较cTnl持续时间长。因为cTnT在血浆中正常含量很低，测定方法需具备较高的灵敏度和很低的检测下限。 最初建立的ELISA检测血清cTnT的方法是基于用亲禾鹏的一种多抗和一种单抗，以后又发 展了更敏感更特异的ELISA双单抗一步法，整个反应90分钟完成，检测范围0.1-15 ii g/L 。 由于全部采用单抗，检测结果重复性较高，与骨骼肌交叉反应<0.5% (Katus HA. etal. Clin. chem.,1992,38:386)。快速定性测定方法采用金免疫层析法(郑佐娅，陶义训，上海医学检验 杂志，1996， 11， 57-58。)。1977年Arakawe创建了化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay ,CLIA)。该 方法可以使检测范围达到6个数量级，并且敏感度可达10的负18次方摩尔水平。根据标记 物的不同，化学发光免疫分析可分以下三个类型(1)以辣根过氧化物酶(HRP)为标记物 的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为二酰基肼的衍生物，在氧化剂存在下,HRP催化二 酰基肼衍生物发光，波长425nm。苯酚类化合物可增强其发光强度。(2)以碱性磷酸酶为标 记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1， 2—二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生 物)。例如AMPPD、 CSPD、 CDP-Star、 Lumi-phos480、 Lumiphos-530等。荧光素衍生物和表 面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470nm。 (3)以吖啶酯类为标记物的化学发光 系统。该系统不需酶催化，不需增强剂，吖啶酯类在碱性H202作用下直接发光，波长430nm。 吖啶酯类发光系统发光强度高，反应干扰因素少，背景发光低，信噪比高，具有较高的灵敏度。吖啶酯类发光系统是一类很有效的化学发光系统。 发明内容吖啶酯、碱性磷酸酶为标记物的双单抗夹心发光法检测cTnT:该方法需要同cTnT结合 具有不同结合位点的兩中单抗。首先需将链霉亲合素固化于固相载体上；然后制备单抗(1) 同生物素的复合物；制备单抗(2)同吖啶酯(或碱性磷酸酶)的复合物。检测时将样品(或 标准品)、单抗(1)同生物素的复合物、单抗(2)同吖啶酯(或碱性磷酸酶)的复合物一起 加入反应池，通过一步反应后生成如下复合物固相载体一链霉亲合素一生物素一单抗(1) 一cTnT—单抗(2) —吖啶酯(或碱性磷酸酶)，经洗涤后，吖啶酯标记物加入发光启动剂便 可发光；碱性磷酸酶标记物加入其底物和增强剂便可发光。吖啶酯(或碱性磷酸酶)为标记物的竞争发光法检测cTnT:首先将单抗(1)固化于固 相载体上作为扑捉抗体。然后制备吖啶酯(或碱性磷酸酶)标记cTnT的复合物。检测时将 样品(或标准品)、吖啶酯(或碱性磷酸酶)标记的cTnT复合物一起加入反应池，反应 后经洗涤，吖啶酯的标记物加入发光启动剂便可发光；碱性磷酸酶的标记物加入其底物和增 强剂便可发光。有效的吖啶酯类化合物有吖啶酯DMAE—NHS、吖啶磺酰胺、吖啶酯AE、双吖啶 (DMDSBA)等，其发光启动剂为碱性H202;碱性磷酸酶的底物有1， 2—二氧环乙烷衍生 物(金刚垸衍生物)，例如AMPPD、 CSPD、 CDP—Star等。发光增强剂有荧光素、表面活性剂等。酶促化学发光免疫分析法可采用全自动检测仪，也可采用半自动发光仪。根据需要，固 相载体可选用多孔板、高分子聚合物管(或球)、磁微粒等。碱性磷酸酶标记抗体，生物素标记抗体已成常规方法，参照下述文献进行1、 J.A， Arends， J. I咖uno. Methods, 1997, 25:171。2、 D. M. Boorana ，etal. J， Immuno. Methods 30:245。3、 J .Immunological Methods ,1979,31:231-236。4、 J. Histochem. Cytochem ， 1979,22:1084-1091。5、 尹伯元、王仁芝、李振甲、许以平等编著《标记免疫学》41一50页。6、 Peters JH , Baumgarten H eds. Monoklonale Antik5rper. 1988:1349—53 。
具体实施方式
实施例1吖啶酯DMAE-NHS ( 2' ， 6' _ 二甲基一4 (N—琥珀酰亚胺一氧羰基)苯基一10— 甲基一吖啶一9一甲酸酯一甲氧基硫酸盐)标记单抗1、 制备抗cTnT的两组单抗由本专利权人合成。具体方法详见专利《化学发光免疫分析检测 心肌钙蛋白T的方法，实施例l》(申请号:200610130403.3)。2、 标记方法取单抗(2) 150ulX1.5g/L，对碳酸盐缓冲液(pHlO. 1， 0. lmol/L)透析过 夜(4'C)。用无水二甲基甲酰胺将吖瞎酯DMAE-NHS溶解并配成6.0mmol/L溶液，取该 液8.0 ix 1加入透析过的单抗溶液中，4'C搅拌反应过夜，次日加入5g/L赖氨酸溶液100 u 1 继续反应1小时终止标记反应。反应液对pH6.3 ， O.lmol / L的PBS透析，然后上Sephadex 一G50层析柱(lcmX 30cm)分离标记物和吖啶酯DMAE - NHS。用pH6.3 , O.lmol /L的PBS 平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪分别检测发光强度cps和280nm吸光度。收集光度 值高且吸光度大的洗脱液，加入等体积甘油，分装并置于一10'C保存备用。实施例2吖啶酯双单抗夹心化学发光检测cTnT的方法1、 按上述文献1一6制备单抗(1)同生物素的复合物，将链霉亲合素结合于Nunc板上。因 为这些方法已成常规方法，此处不再繁述。2、 按实施例l制备单抗(2)同吖啶酯DMAE-NHS的复合物。3、 吖啶酯双单抗夹心化学发光法检测cTnT:将待测血清样品(或cTnT的标准品O.Ol — 5.00ng/ml)、单抗(1)同生物素的复合物(1: 2000)、单抗(2)同吖啶酯DMAE-NHS 的复合物(1: 1500)各50nl加入经链霉亲合素包被的Nanc板孔中，37'C温育60分钟， 用PBST溶液(注释)洗涤5次，加入发光启动剂O. 15mol/LNa0H、 0.1% H2O2各100y 1，测 定430nm发光值。整个操作过程应用全自动化学发光免疫分析仪完成，根据标准曲线由微机 软件算出样品含量。该方法的灵敏度经测定(Bo+2SD)为0.003ng/ml，检测范围0.01 — 5.00ng/ml。批内CVy。平均值为2. 29%， 批间CW。平均值为4. 5%，平均回收率为100. 9%。注释PBST溶液的配制方法向pH 7. 4， 0. L5mol/L的磷酸盐缓冲液中加入终浓度达1% 吐温一20、 15% NaCL，混匀后稀释20倍应用。实施例3碱性磷酸酶竞争性CLIA检测cTnT的方法竞争性CLIA检测cTnT的方法只需一种单 抗。按上述文献1—6制备cTnT—链霉亲合素的复合物、碱性磷酸酶一生物素的复合物，将 扑捉单抗(1)固化于固相载体上。这些常规方法此处不再繁述。测定时将样品(或标准品 0.01—8.00ng/ml) 、 cTnT—链霉亲合素复合物(0.6ng/ml)、碱性磷酸酶一生物素复合物(1: 1500)各50u 1 —起加入反应池，混匀37'C温育60分钟。反应后用PBST溶液(配法同实 施例2)洗涤5次，洗涤后加入碱性磷酶的底物CSPD、增强剂共150ul。室温避光反应30 分钟。用北京滨松光子有限公司的化学发光检测仪检测波长470nrth由仪器软件自动计算出 样品的cTnT含量。本法验灵敏度测定值(Bo均值一2SD)为0.08 ng/ml，检测范围0.01 — 8.00ng/ml，批内CW。平均值为3. 6%，批间CVy。平均值为7. 6%，平均回收率为96.8%。碱性磷酸酶购于sigma公司，碱性磷酸酶的发光底物CSPD和增强剂购于Bio-Rad公司。
权利要求
1. 心肌钙蛋白T(cTnT)化学发光免疫分析方法，其特征在于用吖啶酯和/或碱性磷酸酶化学发光免疫分析体系检测cTnT。
2、 根据权利要求1所述cTnT化学发光免疫分析方法，其特征在于用双单抗夹心法和/或竞 争法；固相载体采用微孔板、高分子聚合物管(或球)、磁微粒等；测定手段采用全自动 检测法或半自动检测法。
3、 根据权利要求1所述吖啶酯化学发光免疫分析体系，其特征在于用吖锭酯作为标记物，用碱性H202作为发光启动剂。
4、 根据权利要求l所述碱性磷酸酶化学发光免疫分析体系，其特征在于用碱性磷酸酶作为标 记物；用1， 2—二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)作为碱性磷酸酶的底物；用荧光素 衍生物和表面活性剂作为发光增强剂。
全文摘要
本发明是关于用化学发光免疫分析检测人cTnT的方法。用吖啶酯和/或碱性磷酸酶作为标记物。免疫反应采用双单抗夹心法和/或竞争法。为了提高敏感度，免疫反应优选链霉亲合素-生物素双单抗夹心一步法。用NaOH、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>作为吖啶酯发光启动剂；用1，2-二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)作为碱性磷酸酶的发光底物，用荧光素衍生物、表面活性剂作为发光增强剂。固相载体采用微孔板、高分子聚合物管(球)、四氧化三铁磁微粒等。
文档编号G01N33/68GK101226200SQ20071005648
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月19日 优先权日2007年1月19日
发明者苏殿杰, 苏 韩, 魏桂梅 申请人:天津天美生物技术有限公司