专利名称：：检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种肿瘤的体外检测试剂盒，尤其涉及一种体外检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法，属于分子生物学和细胞免疫学领域，
背景技术：
乳癌(breastcancer)是女性中最常见的恶性肿瘤，即使在发达国家里乳腺癌也是女性死亡的主要原因之一，其年发病率超过70/10万。被称作为乳癌的标志物很多，但普遍认为肿瘤标志物在乳癌的早期诊断中均无实用价值，更无法用于大范围人群的乳癌筛选。在乳癌的第一个肿瘤标志物CA15-3被确立以后不久，就看到在乳癌的I期和II期，仅有大约10。/。的病人血清CA15-3水平有所升高，其他一些有效的肿瘤标志物如CEA和TPS,也大部分只与乳癌的复发或转移有关目前广泛应用的乳腺癌诊断方法有影像技术，如超声，X射线法。但是这一技术受到影像分辨率的限制，只能诊断大到一定程度的肿瘤，通常是5mm以上的肿瘤。而且，难以区分纤维瘤，囊肿与恶性肿瘤。Elmore和Goetz的最新研究明确强调了这一局限性。活组织的组织学分析是诊断乳腺癌的另一常用方法。这一方法依赖于可见的细胞类型鉴别。虽然这种方法比较客观，但要靠检测者的技术水平。活组织细胞中DNA流动细胞学分析也常被用来测定与肿瘤有关的细胞DNA含量。但是此法需获得活组织并且需要复杂的样品处理过程和昂贵的仪器。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、有效期长、方便快捷和成本较低的体外检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种体外检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒，包括酶标板、酶标单克隆抗体、标准品、浓縮洗涤液、浓縮稀释液、终止液和酶底物液；其中，所述的酶标板是包被有anti-hGTA单克隆抗体的酶标板(该酶标板可以是96孔单条或双条可拆酶标板)；所述的酶标单克隆抗体是酵标抗anti-hGTA单克隆抗体；所述的标准品是重组人hGTA标准品；上述的hGTA为SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。所述的标记单克隆抗体的酶为辣根过氧化物酶，其RZ^3.0。所述的酶底物液优选是TMB酶底物液。肿瘤组织特异抗原hGTA是本申请发现的乳腺组织特异性蛋白，其基因仅在乳腺癌中表达，是继乳腺珠蛋白之后发现的另一个具有乳腺器官特异性的肿瘤标志物，在一系列的临床试验中发现，该抗原在乳腺癌的早期诊断、治疗、监测病程转移及判断预后等方面都具有重要意义。hGTA基因编码大约36kD的分泌性糖蛋白，定位于染色体11ql2.8密集基因簇内。并与人类乳腺癌密切相关。正常情况下，hGTA表达量很低(2.36ng/ml-10.27ng/ml)，在I期乳腺癌患者中，其表达量急剧上升(20ng/mht7.84ng/ml)，鉴于这种特性，其成为诊断早期乳腺癌--个非常重要的血清学标志。本发明酶联免疫吸附试剂盒采用酶联免疫双抗体夹心法原理检测血清里面的hGTA。包被在酶标板上的anti-hGTA和人血清中的hGTA反应，洗涤后然后加入酶标抗抗hGTA抗体结合，洗涤，加入底物显色。显色的强度与血清中的hGTA浓度成正比。然后加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测酶标板各孔的吸光值，绘制标准曲线，然后通过标准曲线测定血清中hGTA的浓度。本发明试剂盒各组分的制备方法为1)抗hGTA单克隆抗体的制备以公司自己重组的人hGTA为免疫原，采用多点注射法免疫BALB/C小鼠，用免疫后的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合后用HT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性细胞生长孔，用有限稀释法对阳性孔进行数次克隆后获得，一株稳定分泌hGTA单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为hGTA3B5，另外一株与其配对的单克隆抗体杂交瘤细胞命名为hGTA2C4;将两株克隆化的杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠腹腔制备腹水抗体，经纯化后为用于制备诊断试剂盒的单克隆抗体，2)抗hGTA单克隆抗体的标记本发明以改良过碘酸钠法标价单克隆抗体，以过碘酸钠先将辣根过氧化物酶(HRP)表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体上的氨基相结合，经乙醇胺还原成稳定的酶标记抗体。3)包被有anti-hGTA酶标板的制备用包被缓冲液将hGTA抗原稀释后加入到酶标板的孔中，依次经第一次洗涤、封闭、第二次洗涤、加入抗体保护剂、第三次洗涤、干燥等步骤后，真空包装后备用。4)准备试剂盒其他组成部分精密分装hGTA标准品于2ml西林瓶中，共分装5支；精密分装浓縮洗涤液于20ml塑料瓶中，共分装1支；精密分装浓縮稀释液于20ml塑料瓶中，共分装1支；精密分装底物A液于10ml塑料瓶中，共分装1支；精密分装底物B液于10ml塑料瓶中，共分装l支；精密分装硫酸终止液于10ml塑料瓶中，共分装1支。。5)将上述步骤中制备的包被有anti-hGTA的酶标板、抗hGTA的酶标单克隆抗体、hGTA标准品、洗涤液、稀释液、终止液、酶底物液组装到一个试剂盒中并附上使用说明书即得本发明试剂盒。上述制备方法中，其中步骤中所用的免疫动物为BALB/C小鼠；标记抗hGTA单克隆抗体所用的酶优选为辣根过氧化物酶。所用到的hGTA为hGTA为SEQIDN0:2所示的氨基酸序列，本领域技术人员可参考本申请实施例的方法制备重组hGTA,抗hGTA单克隆抗体。本发明试剂盒的制备过程中，其中在包被有hGTA单克隆抗体酶标板的制备时，在包被液中加入了抗体保护剂，在酶标抗体中亦加入了保护剂，两项措施的采用延长了试剂盒的保护期，从而提高了本发明试剂盒的稳定性；本发明试剂盒在检测乳腺癌时，采用酶联免疫吸附法，可显著縮短检测时间，使检测更为方便、快捷，能更早期特异的检测乳腺癌。图lRT-PCR逆转录后的琼脂糖图谱；其中M为DNAmarker;1为阴性对照；2为PCR产物。图2pQE-hGTA酶切鉴定结果；其中M为DNAmarker;1为pQE-hGTA质粒；2，3为双酶切结果。图3hGTA基因的诱导表达结果；其中M为proteinmarker;1为Ml5(pQE)未诱导；2为M15(pQE)诱导6小时；3为M15(pQE-hGTA)未诱导；4，5为M15(pQE-hGTA)诱导6小时。图4用离子交换纯化hGTA重组蛋白结果；其中M为proteinmarker;l为M15(pQE-hGTA)未诱导；2为M15(pQE-hGTA)诱导6小时；3，4，5为蛋白质洗脱峰。图5单克隆抗体(mAb)纯度的SDS-PAGE分析。(A)l:蛋白marker;2:纯化的mMbhGTA2C4;;3:Ascites;4:洗脱液样品；(B)l:蛋白marker;2:Ascites;3:洗脱液样品；4:纯化的mMbhGTA3B5。图6标准曲线图Alb标准品浓度(ug/ml)的常用对数为横坐标，Alb标准品的吸光值为纵坐标。以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。具体实施方式实施例1hGTA抗原的制备一、人hGTAcDNA的逆转录及表达质粒的构建①乳腺癌细胞总RNA提取将乳腺癌细胞MDA-MB453(哈尔滨医科大学附属第一医院乳腺中心)培养于完全RPMI1640培养基，在37"，5%<:02、饱和湿度下培养至对数生长期，对细胞则消化、吹打细胞，制备细胞悬液，计数，2000r/min，弃去培养液，吸取细胞(5-10x106)于lmLTRIZOLReagent中裂解室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离，12000r/min离心5min，取上清，转入一个新的无Rnase的离心管中，加0.3ml氯仿，剧烈振荡20秒，室温放置5min，13000r/min离心5min，样品会分成三层，将含有RNA的水相转移到新管中，进行下一步操作，缓慢加入1倍体积的70%乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，10000g离心30秒，弃掉收集管中的废液，加0.5ml去蛋白缓冲液，10000g离心30秒，弃废液，加0.8ml漂洗液，10000g离心30秒，弃废液，加0.5ml漂洗液，10000g离心5min，小心去除多余的液体，将离心柱转入一个新离心管中，加30-50/xl无Rnase水，室温放置3min，10000g离心3min，取适量提取的RNA溶液，紫外分光光度定量，计算A26Q/28()为1.94，说明提取的总RNA纯度较高。②人hGTAcDNA合成总RNA1.0jUg，01igo(dT)15primer冰上结合，70。C5min，立即冰浴10min,再加入5xReactionBuffer5/il，10mmol/LdNTP1.25/xl，RNA酶抑制剂0.55/xl，M-MLV逆转录酶liul，加入无核酸酶的ddH20补足总体积至25/xl，混匀后按如下程序进行逆转录:42"C1.5-2hr,95。C变性5min。逆转录产物一部分进行PCR扩增，余下的部分-2(TC保存。根据hGTAcDNA序列设计了一对特异引物上游弓I物:5'-GCTGAATTCCCGGTTCGTCGGTTATCCGCGCCGCTC-3'EcoRI下游弓l物:5'-CGGAAGCTTTCGGATGGTGGGGCTACCCACCAGCC-3'HindIII逆转录得到的cDNAlul，上下游引物各1/410xReactionBuffer5pl，25醒ol/LMgCl24pU0mmol/LdNTP2^1，TaqDNA聚合酶(5U/pl，加入无菌水至总体积50jul，混匀后进行扩增，条件为:94。C预变性90s，然后94。C60s，58。C60s，72。C90s，35个循环，最后72'C延伸7min。取扩增产物PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳鉴定(图1)。③感受态细菌的制备从琼脂平板上接种一单菌落(M15)于3mL菌培养液中，37"C振摇培养过夜，向2个内装30mL细菌培养液三角烧瓶中分别加入0.2mL与0.5mL过夜培养的细菌于37。C振摇培养2-3小时。无菌条件下选取生长状况良好的细菌转移到6个无菌一次性的以冰预冷的5mL离心管中，5mL/管，冰上置5min，40°C8000r/min离心2-3min，倒出培养液并倒置1min使尽量流尽，移液器小心吸尽，冰预冷0.1mol/LCaCl23mL/管重悬，冰浴5min，40°C8000r/min2-3min，弃上清液，以0.2mL/管含20%甘油的0.1mol/LCaCL2溶液重悬，-2(TC保存。④pQE质粒(购自上海生物工程研究所)的转化及质粒的提取冷冻的感受态细菌取出后置于冰上解冻，lng-10ng质粒DNA与复融感受态细菌混合，轻弹管壁混匀,冰上放置30min，42。C热休克90s，再置冰上2min,加800pd预置室温下的细菌培养液，37t:200r/min振摇l小时，分别将50/d、200/il和余下细菌(离心收集)涂于相应抗生素琼脂平板，37。C过夜培养。挑阳性单菌落于20ml培养液中，37'C振荡培养过夜，14000r/min离心2min收集3ml菌液的沉淀，弃上清，力B150/d质粒抽提试剂SolutinI(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，2%TritonX-100，8%蔗糖)，重悬细菌，加300/dSolutinll(0.2mol/LNaOH)，颠倒混匀，加150/ilSolutinlll(3mol/LNaAC(pH4.8))，颠倒混匀，力口150^1SolutinIV(lmol/LTris)，颠倒混匀。14000r/min离心10min,吸取上层水相移至新管，加2jLtl10mg/mlRnaseA，55。C水浴育10min，加400/^1酚和400/d氯仿，然后14000r/min离心10min，吸取上层水相移至新管，加600/1l异丙醇，颠倒混匀，14000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2遍，14000r/min离心8min，吸干乙醇，室温干燥，每管加3(^1无菌纯水溶解质粒，紫外吸收法测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳结果，-20^贮存备用。双酶切及酶切产物的回收EcoRl/HindIII分步双酶切鉴定重组质粒，37r反应2-3h，用胶回收试剂盒回收酶切片段。小心从琼脂糖凝胶上切下DNA片段胶条，放入离心管中称重，加入3倍体积的Buffer,50。C水浴lOmin，至胶条完全融化，检査颜色为黄色，加入等胶条体积的100%异丙醇，颠倒几次混匀，将柱放入2ml收集管中，将全部样品移入柱内，13000r/min离心lmin，倒出流过柱子的液体，将柱放回同一收集管中，加500/xlBuffer于柱内，13000r/min离心lmin，倒出流过柱子的液体，将柱放回同一收集管中，加750plBuffer于柱内洗涤，放置5min后，13000r/min离心lmin，倒出流过柱子的液体后，13000r/min离心lmin，将柱放入一个干净的离心管仲，加10/xlBuffer于柱上的膜中心，洗脱DNA，柱子自立lmin后，13000r/min离心lmin。◎pQE-hGTA表达载体的构建及测序pQE质粒的制备将pQE质粒转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，常规摇菌进行质粒扩增，提取质粒，经电泳鉴定后-2(TC保存备用；H的片断的制备hGTA克隆产物pGEM-T/hGTA以EcoRI/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收电泳槽回收纯化DNA片段。载体的制备:将pQE以EcoRl/Hindin双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收电泳槽回收纯化DNA片段。连接反应:将酶切并回收的目的片段和载体以T4DNA连接酶连接，4'C反应过夜。连接产物转化入感受态大肠杆菌XL1-Blue中，离心收集细菌铺板，37。C培养过夜后，无菌条件下挑取单克隆菌落，常规摇菌扩增并提取质粒，EcoRl/HindIII双酶切对重组表达质粒进行鉴定(图2)。人乳腺癌细胞来源的hGTAcDNA测序结果见SEQIDNo:1，共1159bp。⑦hGTA基因融合蛋白的诱导表达。SDS-PAGE结果显示(图3)，与pQE空质粒转化菌相比，诱导后pQE-hGTA质粒转化菌在36KDa左右出现明显条带，与预期的hGTA蛋白分子量相符。应用DNAssist软件对hGTA蛋白进行分析，该蛋白由321个氨基酸组成，其中极性氨基酸188个，疏水性性氨基酸133个。该蛋白含有5对二硫键，等电点位为5.5，分子量为36kDa。二、hGTA重组抗原的纯化①转入重组质粒的细菌的裂解及表达包涵体的溶解取出实施例1所制备的冰冻菌体，称重，每克细菌加入10ml预冷破菌液，冰上待融，冰浴超声破菌，将菌液于4'C，10000g,离心25min弃去上清，加入与破菌液等体积的包涵体洗涤液I(0.2MNaCL，0.08%Triton-100，20mM，Tris1Murea，ph9.0)，冰上搅拌30min，4°C，lOOOOg，离心25min，弃上清，用包涵体洗涤液II(0.2MNaCL，0.08%Triton-100，20mMTris，2Murea，ph9.0)再次洗涤包涵体。力口入二分之一破菌液体积的包涵体溶解液(50mMTris,8Murea,pH9.2)，冰上搅拌1小时，4"C，10000g，离心25min，取上清，加入三倍包涵体溶解液体积的去离子水，补加NaCI至终浓度为0.3M，混匀，用lMHCl调pH至颗粒状沉淀产生，置于4°C过夜，使沉淀完全；4°C10000g，离心25min，弃上清。②N产鳌合亲和层析纯化变性蛋白将经预处理的N产鳌合亲和层析柱，接入AKTAExplorer,用BufferA(购自南京博士德生物工程公司)平衡200ml，将溶解后的包涵体用系统泵上样，流速10.0ml/min，用BufferA平衡至A280曲线呈水平，分别用BufferB(购自南京博士德生物工程公司)，BufferC(购自南京博士德生物工程公司)洗脱杂蛋白及目的蛋白，收集目的洗脱峰。③复性目的蛋白将经N产鳌合亲和层析粗纯化的目的蛋白倒入透析袋中，放入盛有1L复性液I(4mol/LUrea,GSH2mmol/L，GSSG1mmol/L，EDTA5mmol/L，Tris-盐酸20mmol/L，pH8.2)的烧杯中，4。C透析过夜；次日，取出透析袋放入盛有IL复性液II(3mol/LUrea，GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L,Tris-盐酸20mmol/L，pH8.2)的烧杯中进行透析；每隔4h依次换复性液III(2mol/LUrea,GSH2mmol/L,GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L,Tris-盐酸20mmol/L，pH8.2)、复性液IV(lmol/LUrea,GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L，Tris-盐酸20mmol/L，pH8.2)，换到复性液V(EDTA5mmol/L,Tris-盐酸20mmol/L，pH8.2)时4'C透析过夜；透析结束后，4°C15000r/min离心20min，上清即为可溶性复性蛋白。离子交换层析纯化复性蛋白将装好DEAESepharoseFastFlow填料的柱子接入AKTAExplorer,用BufferD(购自南京博士德生物工程公司)平衡；将复性的蛋白用系统泵上样，流速10.0ml/min;用BufferD平衡至A280曲线呈水平；分别用BufferE(购自南京博士德生物工程公司)，BufferF(购自南京博士德生物工程公司)洗脱杂蛋白及目的蛋白，流速200ml，流速10.0ml/min;收集各洗脱峰(图4)。本发明最终从1L的细菌经诱导表达、超声裂解、尿素变性、Ni2+鳌合亲和层析、透析复性、离子交换层析的系列过程，最终获得了24.6mg的hGTA的重组蛋白，经高效液相分析，纯度为98.4%。实施例2抗hGTA单克隆抗体的制备一)ALB抗原的单克隆抗体制备1、试验材料1)、人hGTA抗原实施例l所制备。2)、实验动物六周龄BALB/c小鼠购自哈尔滨医科大学动物实验中心；3)、DMEM告糖培养基Hclone公司4)、其它试剂福氏完全佐剂，自己配制2、制备方法1)免疫动物用人hGTA抗原与福氏完全佐剂等体积混合腹腔注射免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠，每周一次，剂量为100ug/只，每只小鼠腹腔注射0.5ml。而后间隔l周连续免疫2次，剂量及免疫方式相同，佐剂改为不完全佐剂，在融合前三天用PBS稀释抗原，经小鼠尾静脉注射进行冲击免疫。免疫2-3次后，用间接法ELISA检测小鼠血清效价，当效价达到4000以上时，便可准备分离脾细胞进行细胞融合。2)细胞融合及HT筛选将免疫后的小鼠，经眼眶放血，分离血清供检测抗体用；将经免疫的小鼠处死后，局部消毒剖腹，无菌条件下取脾，制备成脾细胞悬液，进行细胞计数和活力检测，取108个脾细胞悬液备用。融合前2-3天，将每瓶Sp2/0骨髓瘤细胞传至4瓶细胞，取处于对数生长期的细胞用于融合。将脾细胞和SP2/0细胞分别计数后，按7:1的比例加入50ml离心管中混合均匀，离心10分钟，倒尽上清液，使两种细胞混匀成糊状，加入37"C预温的50y。PEG(分子量4000)，边滴加边搅拌；融合后的细胞用含20%小牛血清的HAT培养液制备成细胞悬液，分划于192孔细胞培养板(2板)中进行选择培养。在选择培养液中培养4天后，其他细胞逐渐消失，只有融合的杂交瘤成簇生长，形成小的细胞集落，8天后，停止使用HAT培养液，改用HT培养液，一周后换用含10%牛血清的DMEM培养液培养。待杂交瘤细胞长满培养孔底部的1/3时，这时吸取培养上清进行筛选。用间接酶联吸附法(ELISA)进行特异性抗体检测，选择分泌抗hGTA抗原的杂交瘤细胞。3)杂交瘤筛选及有限稀释以人hGTA为包被抗原(包被量0.4ug/孔)，用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的培养上清为阴性对照。选取对hGTA抗原阳性反应的杂交瘤细胞集落，以有限稀释法进行克隆化培养，当细胞长满孔底约1/3时，测定各孔中培养液的特异性抗体的活性，选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续按有限稀释法进行2次克隆和扩大培养。最终获3株能稳定分泌抗hGTA抗原的杂交瘤细胞株，这三株细胞的编号为hGTA2C4，hGTA3B5，hGTA4F11。当克隆至阳性率达到100%时，及时将分泌抗单克隆抗体的单株细胞冻存于液氮中，留存种子细胞库。4)单克隆抗体的制备及纯化在同系的BALB/c(6周龄)腹腔注射液体石蜡，约第8天将克隆后分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞hGTA2C4、hGTA3B5或hGTA4F11注入腹腔(l-2xl06细胞/鼠)，待小鼠腹部开始增大后，收集腹水。一只小鼠收集腹水2-3次后，杀死小鼠一次性取腹水，离心除去腹水中的细胞和细胞碎片，加入等体积的饱和硫酸铵到—卜.清液中，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时，使蛋白质充分沉淀，将沉淀物溶于少量的PBS中，用1Ommol/LPBS(Ph7.4)在4。C透析24小时。然后通过DEAE-SephadexA52层析柱，收集并合并洗脱液中含蛋白的部分，浓縮后即得抗hGTA单克隆抗体，该抗体的纯度分析结果见图4，将所筛选到的合格单克隆抗体保存备用。表l杂交瘤细胞染色体数目、单克隆抗体的亚型以及单克隆抗体的亲和常数<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3抗hGTA单克隆抗体的酶标记称取2mgHRP溶解于lml超纯水中，加入30ul新配的0.1MNaIC溶液，将上述溶液装入拦截分子量为8000的透析袋中，对2mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析过夜；加30/xl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，调醛化HRP的pH升高到9.09.5，立即加入0.5ml抗hGTA抗体，室温避光在脱色摇床上轻轻振摇2小时；加40ul新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4。C2小时。上述液装入分子量为8000的透析袋中，对0.01MPH8.2磷酸盐缓冲液透析过夜，用硫酸铵法纯化即得。实施例4本发明乳腺癌早期检测试剂盒的制备1、试验材料1)hGTA抗原实施例1所制备。2)抗hGTA单克隆抗体l，2:实施例2所制备。3)所用的试剂3.1包被缓冲液碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.45g，硫柳汞O.lg，氯化钙，0.2g，对羟基水杨酸0.02g，加双蒸水至1000ml调pH9.6，灭菌备用。3.2、封闭液氯化钠4.0g，磷酸二氢钾O.lg，磷酸氢二钠1.45g，氯化钾O.lg，硫柳汞0.08g,去免疫球蛋白牛血清白蛋白15g，加双蒸水至500ml，调pH7.2，高压灭菌即可。3.3、终止液20ml硫酸加双蒸水至184ml3.4稀释液的配制氯化钠4X)g，磷酸二氢钾O.lg，磷酸氢二钠1.45g，氯化钾O.lg,硫柳汞0.08g，加双蒸水至500ml，调pH7.2，高压灭菌即可。3.5酶底物液的制备A液磷酸氢二钠14.60g以酸钠9.33g0.75°/。过氧化氢尿素20ml加双蒸水至IOOO，调PH值5.0B液TMB20mgDMF28ml双蒸水60ml3.6、洗涤液的配制氯化钠4.0g,磷酸二氢钾O.lg磷酸氢二钠1.45g氯化钾O.lg硫柳汞0.08g吐温201.0ml加双蒸水至1000ml调pH值7.2。3.7、本发明试剂盒的组成，见表2。表2本发明试剂盒的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试剂盒使用说明书一份。3.8、本发明试剂盒保存及有效期2-8°C、密闭、避光保存，有效期12个月。3.9操作方法包被用包被缓冲液将hGTA抗体稀释成2pg-8/ig/ml工作浓度，每孔加入工作浓度抗体100/xL，共包被96孔，盖好酶标板，置于4"C冰箱中过夜；洗涤弃去包被液，用PBS-T洗涤液满孔洗涤3次，每次3分钟，最后一次扣干；封闭用封闭液加满各反应孔，去除加样时产生的贴壁气泡，盖好酶标板，于37'C水浴箱中孵育30分钟。洗涤弃去包被液，用PBS-T洗涤液满孔洗涤3次，每次3分钟，最后一次拍干。于37"C干燥20分钟，然后真空包装于铝箔袋中保存备用。灌装(1)灌装浓縮洗涤液调整分装器灌装量至12.5ml，将分装器管道中的水放掉，使除菌过滤后洗涤液通过自动灌装机将洗涤液灌装于15ml白色的塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。(2)灌装浓縮样品稀释液调整分装器灌装量至lO.Oml，将分装器管道中的水放掉，使除菌过滤后样品稀释液通过自动灌装机将样品稀释液灌装于15ml白色的塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。(3)灌装酶标抗体工作液调整分装器灌装量至5.0ml，将分装器管道中的水放掉，使除菌过滤后酶标抗体工作液通过自动灌装机将酶标抗体工作液灌装于8.0ml白色塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。(4)灌装底物A液调整分装器灌装量至5.0ml，将分装器管道中的水放掉，使除菌过滤后底物A液通过自动灌装机将底物A液灌装于8.0ml白色塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。(5)灌装底物B液调整分装器灌装量至5.0ml，将分装器管道中的水放掉，使除菌过滤后底物A液通过自动灌装机将底物A液灌装于8.0ml黑色塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。(6)灌装终止液调整分装器灌装量至5.0ml，将分装器管道中的水放掉，通过自动灌装机将终止液灌装于8.0ml白色塑料瓶中，随灌装进行及时旋上瓶塞。包装将每支塑料瓶插入泡沫垫各个孔中，将泡沫垫装入中纸盒中，在上面放上经真空包装的酶标板，然后放上两张不干胶片，放入一张说明书即得。实施例5本发明试剂盒的使用一、试验材料1、检测试剂盒本发明实施例所制备；2待检样品的采集取病人静脉血，离心分离得血清备用；3、试剂准备1)将10x稀释液用前置于37t:水浴15分钟，然后用蒸馏水做10倍稀释；2)将20x洗涤液用前置于37t:水浴15分钟，然后用蒸馏水做20倍稀释；3)将0.2ug标准品用500ul稀释液准确复溶(0.2ug/ml)。取出200ul用稀释液作稀释为如下几个浓度100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.0ng/ml六个标准点。二、操作步骤1、加样将酶标孔每孔加入标准品100ul，每个浓度加一个孔，绘制回归曲线;加入待测血清样本lOOul，每个样本加复孔；阴性对照血清加两个复孔，轻轻振荡混匀，37。C水浴40分钟；2、洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3分钟，甩干，反复3次后拍干；3、加酶标抗体每孔加入酶标抗体lOOul，轻轻振荡混匀，37"C水浴40分钟；4、洗涤弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3分钟，甩干，反复3次后拍干；5、显色临用前把底物A、B溶液按体积比l:l混合均匀。每孔加底物液IOOul，37t:水浴15分钟；6、终止比色每孔加入50ul终止液，轻轻混匀30秒，在酶标仪450mn处，以底物空白孔调零，测各孔的吸光值。三、数据处理以hGTA标准品浓度(ng/ml)的常用对数为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线(图2)，待测标本含量(ng/ml)可从标准曲线上算出，然后乘以稀释倍数即可。四、评定标准1)阴性<5ng/ml。2)阳性〉10ng/ml。3)临界值5-10ng/ml，若检测结果为临界值，应进行重复实验，若仍为临界值判为阴性，重复实验以后者结果为准。试验例1本发明试剂盒临床应用观察试验于2005年1月10日到2005年8月10日在哈尔滨医科大学附属第一医院对本发明试剂盒进行临床应用观察试验；临床考核80例，其中阴性病人30例，阳性病人50例，以影像检测法为进标准，将考核人群分为四个组正常，I期乳腺癌，II期乳腺癌，III期乳腺癌，临床考核结果见表3。表3本发明试剂盒临床应用观察试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>609119732HY-F0060女25II期乳腺癌135.69II期乳腺癌619119741HY-F0061女38II期乳腺癌124.56II期乳腺癌629119725HY-F0062女46止常7.25可疑636084712HY-F0063女49止常4.45正常649114358HY-F0064女37正常1.56正常655486915HY-F0065女32II期乳腺癌135.78II期乳腺癌666115740HY-F0066女26ii期乳腺癌142.48II期乳腺癌676105255HY-F0067女36正常3.45正常686140205HY-F0068女29I期乳腺癌23.47I期乳腺癌695373805HY-F0069女34I期乳腺癌23.58I期乳腺癌709114576HY-F0070女39止常4.25正常716116085HY-F0071女26II期乳腺癌26.45II期乳腺癌726092254HY-F0072女34n期乳腺癌30.25II期乳腺癌739114947HY-F0073女46i期乳腺癌44.59I期乳腺癌749114970HY-F0074女37正常4.12正常759134052HY-F0075女31正常3.25正常768984117HY-F0076女36正常6.15可疑774414078HY-F0077女35正常6.48可疑789149490HY-F0078女35n期乳腺癌164.58II期乳腺癌799149805HY-F0079女42ii期乳腺癌125.48II期乳腺癌806102275HY-F0080女37i期乳腺癌66.47I期乳腺癌应用本发明hGTA酶联定量检测试剂盒对50例患有各期乳腺癌病人及对30例无乳腺癌疾患的健康人检测，结果显示在乳腺癌各期中hGTA阳性率为I期78%，11期98%，111期100%。并且在对本法检测可疑的病人其中有4例最终进展为乳腺癌，说明本法诊断乳腺癌具有比影像检测更早的特点。试验结果表明，本发明hGTA酶联定量检测试剂盒对早期发现乳腺癌有极好的临床意义，可适用于妇女乳腺癌的筛査检测。<110><120><130><160〉<170><210><211><212><213>序列表北京关康生物技术研究中心检测早期乳腺^的酶联免疫吸阳试剂,汰及JL.制备方法P0892PatentInversion3.311158DNA智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(97)..(1059)<1gccaagggtccaggctccttgagctacaacUccggactgcctsctaaccgcaattggctcaagttaaccgccttaccttcttaggctgccctgaaggccaagcagccaacggcGlvGinAlaAlaAsnGly1560114cgcggcgtgaactggctgegggccctgtgcgagaacgetcagctgggc162ArgGlyValAsnTrpLeuArgAlaLeuCvsGluAsnAlaGinLeuGlv101520agaaccegggccttcgetgccaccgetgetgacgtcagaagegggccc210ArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAlaAspValArgSerGlvPro253035ateatgctggccgagagatgcteacagtgcctgggctecgacgcctealieMetLeuAlaGluArgCvsSerGinOsLeuGlySerAspAlaSer40&50258ctggagacgacctggctgcacgaggetaagagetgcaataccgtcggt306LeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlaLysSerCysAsnThrValGly55606570agaaacccacacgaaaccaggcctggagetctgggacacetcgccggc354ArgAsnProHisGluThrArgProGlvAlaLeuGlvHisLeuAlaGlv758085atetttgacagetecgacggceggageeggatectggccaacgaggccliePheAspSerSerAspGlyArgSerArglieLeuAlaAsnGluAla9095100402ccgaaggagctgctgactggcaataccgtgcccgtcgatagegetgtcProLysGluLeuLeuThrGlvAsnThrValProValAspSerAlaVal105110115450atgagtaggctttacteccgaattaccctgtact.tcetctgtteaaagMetSerArgLeuTyrSerArglieThrLeuTyrPheLeuCvsSerLvs120125130498ttcg(:cgggaggttcaaggtclxgtattgrctgragtacageetctttPheAlaGlvArgPheLvsValSerTyrCvsLeuGinTyrSerLeuPhe1351^0145150546gccetcccccagctgtgcccctegcaggaccccctggacgcctatgcaAlaLeuProGinLeuCysProSerGinAspProLeuAspAlaTvrAla155160l65594gtggcc固gccgggct,gctgaagct(:cagU('gc('tgggggttcgccValAlaThrAlaGlyLeuLeuLvsLeuGinPheA〗aTrpGlvPheAla17017518b642tiggcctggcrcagtcccacaaa(、gagtgggac.('tgcaactgc(.caggLeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrpAsp(;lnLeuProArg690gtgValGlu215etcLeu33gLyscccPro2001853gcSercaa('tgGinl,euThrProPl]egagGluctgLeuetcLeucagGintuPhegccAla250ArgtecSer235ctgLeug3CAspsiclie220ctgLeut3CTyreglArg205GluC3gGinGlu190gggGlyGluetcLeuttcPhetggTr卩HiscctPro3CtThr255ThrgccA]aPhe240gtgValgtgValg3gGiu225tggTrpUcPhegccAla210C.8tHis3gCSercagGin195('tgLeuttgC8CHisttgLeuCt3L,euaagLysgagGluctgLeu260gccAa3tgMetttcPhe245gccAlactgatgMet230C3gGinegg738786834882tacTyr3gtSerctgLeu295gtgValLysutPhe280t8tTyrtecSerThr265gccAlatecSertggTrpPro3gtSergggGlyctgLeutegSertggTrpttgLeugtcVal315ThraagLysLystscTyrt3CTyrGin285g3CAspetcLeuattlie270Ala3ggArgeggArg3gtSerProtggTrpProGinProThr3tclie32033ggtcValPro305C3gGint8CTyrLvsThrThr275tatTyrC3gGing3tAsptctSerSerThrg3tAspsag匕ysgacAspgtcVal3ggArg3109309781026agctgcaacctcgagctccc1079tgtcctgctcaccaagtcttgcttcacctgtgacgcccagcttggtcaactgatctaatg1139accttcaacaaegtaatec1158<210>2<211>321<212>PRT<213〉智人<400〉2(Homosapiens)GlvGinAlaAlaAsnGlyArgGlyValAsnTrpLeuArgAlaLeuCys151015GluAsnAlaGinLeuGlyArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAla202530AspValArgSerGlyProlieMetLeuAlaGluArgCysSerGinCvs35'404^匕euGlySerAspAlaSerLeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlaLvs505560SerCvsAsnThrValGh'A]'gAsnProHisGluThrArgProGlvAla65707580LeuGlyHisLeuAlaGiy〗lePheAspSerSerAspGlyArgSerAi.g859095lieLeiiAlaAsnGliiAlaProUsl"、iiLeuThrGlvAsnThrVa100105'110ProValAspSerAlaValMetSerZh'gL(、u'l'yi'Ser,'U.glieThrLeun5120125TvrPheLeuCvsSerLvsPheAlaGlvArgPheLvsValSe]..Tyi"s130135140LeuGinTvrSerbniPheAlaLeuProGinLeu(:ysProSerGinAs!)145150155160ProLeuAspAlaTvrAlaValAlaThrAlaGlvLeuLeuLvsLeuGlr1^5170175PheAlaTrpGlyPheAlaLeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrp18i)185190AspLeuGinLeuProArgVeilProSerGinLeuAspArgGlvTrpThr195200205ValAlaLeuLeuAlaLeuGluThrProPheArglieGluGluHisAla210215220GluHisLeuLvsMetMetLeuGluLeuPheSerLeuGinLeuProPhe225230235240TrpSei'HisGluPheGinLysLeuGinAlaLeuTvrGluPheThrVal245250255PheGinLeuLeuAlaArgTyrLvsThrProSerThrTvrlieArgPro260265270LvsTyrThrAspThrAspSerPheAlaSerTrpLvsGinAlaSerTrp275280285ValLysTyrSerAspValLeuTyrSerGlyLeuLysAspArgProGin2§02953b0ProThrGinSerLysArgValSerTrpLeuValTyrLeuProThrlie305310315320Gin权利要求1.一种体外检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒，包括酶标板、酶标单克隆抗体、标准品、浓缩洗涤液、浓缩稀释液、终止液和酶底物液，其特征在于所述的酶标板是包被有anti-hGTA单克隆抗体的酶标板；所述的酶标单克隆抗体是酶标抗anti-hGTA单克隆抗体；所述的标准品是重组人hGTA标准品；所述的hGTA为SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2、按照权利要求1的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的标记单克隆抗体的酶为辣根过氧化物酶，其RZ^3.0。3、按照权利要求1的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的酶底物液是TMB酶底物液。4、按照权利要求1所述的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的酶标板为96孔单条或双条可拆酶标板。5、权利要求14任意一项所述的酵联免疫吸附试剂盒在检测早期乳腺癌中的应用。全文摘要本发明公开了一种体外检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括包被有anti-hGTA单克隆抗体的酶标板、酶标抗anti-hGTA单克隆抗体、重组人hGTA标准品、浓缩洗涤液、浓缩稀释液、终止液和酶底物液；所述的hGTA为SEQIDNO2所示的氨基酸序列。临床应用试验表明本发明试剂盒可准确的检测出早期乳腺癌，具有特异性强、灵敏度高、有效期长、成本低等优点，可应用于临床检测乳腺癌。文档编号G01N33/577GK101261273SQ200710064198公开日2008年9月10日申请日期2007年3月6日优先权日2007年3月6日发明者路戴,军杜,王文雅,鑫金申请人:北京美康生物技术研究中心