专利名称：：基质金属蛋白酶mmp11的血清学检测方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及多种细胞和分子生物学技术，包括RT-PCR、免疫组织化学、Westernblot、细胞转染和动物实验、以及酶联免疫吸附(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)技术。特别涉及一种基质金属蛋白酶MMP11的血清学检测方法及用途。
背景技术：
：恶性肿瘤已经成为人类死亡的重要原因，每年全世界约有700万人死于癌症。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前胃癌的诊断主要依靠影像学和病理学的手段，大多数患者确诊时已经到了中晚期，失去了最佳治疗时期。因此寻找肿瘤分子标志物是肿瘤早期诊断和有效防治的关键问题。其中，血清学的检测经济、方便、病人易于接受，因此血清肿瘤分子标志物的寻找与鉴定是目前十分重要的工作。'
发明内容本发明的目的是克服上述现有技术的的不足，提供一种基质金属蛋白酶固Pll的血清学检测方法。基于上述目的，本实验室前期工作利用Oligo基因芯片技术和生物信息学工具(DigitalGeneExpressionDisplay,DGED)建立了胃癌基因表达谱，我们希望能把基因表达谱mRM水平的信息转变为蛋白水平的信息，并且在细胞、组织，更重要的是在血清中得到验证。细胞外基质和基底膜的降解和破坏是肿瘤转移多阶段过程中的重要步骤，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMPs)是参与这一过程的重要蛋白家族，,P11是该家族一个有趣的成员，在多种肿瘤组织中高表达。此项研究分析了胃癌基因表达谱的信息，以画P11为例，利用分子细胞生物学技术在mRNA和蛋白水平验证了MMP11在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达，并进一步利用ELISA技术检测了305例胃癌、90例乳腺癌、40例结直肠癌、33例肺癌和302例非癌对照组血清中,Pll的水平。结果表明，画Pll蛋白在胃癌病人血清中的表达水平(/7=305;median=l.413;rangefrom1.02to2.46)明显高于非癌对照组(/=302;median=l.159;rangefrom1.00tol.53;0.001)。同样的趋势也见于乳腺癌、结直肠癌和肺癌。选择非癌对照组数值的95%可信区间上限1.442为cutoff值，对胃癌血清检测的灵敏度为45.2%，特异性为97.7%。ROC曲线显示曲线下面积0.872，95%可信区间为0.844-0.899，/<0.001。为对结果进一步验证，我们对部分胃癌病例进行了肿瘤标志物CEA、CA199、CA72.4和CA242的4全测，并与固Pll的结果进行对照。画Pll的灵敏度高于其它四种肿瘤标志物，并且固Pll与CA199有较好的相关性(严O.017)。通过对临床病理资料的统计学分析，血清MMPll水平与胃癌病人的性别、年龄、分期和分化程度无相关性，而与胃癌转移状态呈正相关性(/=0.009)。本发明的技术内容是采用酶联免疫吸附技术，将固P11多克隆抗体与固相载体连接，形成固相抗体，让标本中的醒Pll抗原与固相载体上的抗体结合，然后使固相免疫复合物上的抗原与酶标,Pll单克隆抗体结合，加底物使夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行画P11蛋白的定性或定量。进一步地，所述基质金属蛋白酶画Pll的血清学检测方法建立了血清MMP11的检测试剂盒。进一步地，基质金属蛋白酶固Pll血清学检测可以用于检测胂瘤病人血清中,P11蛋白的水平。我们检测了305例胃癌、90'例乳腺癌、40例结直肠癌、33例肺癌和302例非癌对照组血清中固Pll的水平。结果表明，画Pll蛋白在这几种肿瘤病人血清中的表达水平明显高于非癌对照组07<0.001)。血清固Pll的检测有较高的灵敏度与特异性，其中对胃癌血清检测的灵敏度为45.2%,特异性为97.7%。进一步地，血清醒P11检测的灵敏度高于经典肿瘤标志物CEA、CA199、CA72.4和CA242，其中MMP11与CA199有较好的相关性(产O.017)。同时，血清中醒Pll的水平与胃癌转移状态呈正相关(^0.009)。血清固P11蛋白能成为新的肿瘤血清分子标志物，用于肿瘤的诊断与预后分析。本发明的优点在于本发明利用了基因芯片技术和生物信息学方法，得到了胃癌基因表达镨，以固Pll基因为例，从mRNA和蛋白质水平验证了该基因在肿瘤细胞系和组织中的表达特征。同时，利用酶:^关免疫吸附(enzyme4linkedim画osorbentassay,ELISA)技术建立了血清醒Pll的检测试剂盒，并检测了MMP11蛋白在胃癌病人血清中的表达水平。基质金属蛋白酶醒Pll有较高的灵敏度与特异性，灵敏度明显高于传统肿瘤血清标志物，并且与肿瘤的转移状态有关，能用于病人预后的判断。表明结合胃癌基因表达语，综合各种分子生物学手段寻找肿瘤的分子标志物，并用于早期诊断和预后判断是一个有效、可行的方法。图1MMP11mRNA在10个胃癌细胞系中有差异表达；胃癌组织中MMP11mRNA的阳性率高于配对的正常组织。图2醒Pll蛋白在胃癌组织中的表达A、B:MMP11在高分化胃癌组织中的表达；C、D:画Pll在低分化胃癌组织中的表达；E、F:固Pll在异形增生和肠上皮化生组织中的表达；G:固P11在腺颈部高表达；H:MMP11在正常胃组织中的弱阳性表达。(lOOx)。图3肿瘤病人与非癌对照组血清中,Pll水平的比较水平线代表均值，肿瘤病人血清画Pll的均值远高于非癌对照组(；<().001)。图4ROC(ReceiverOperatingCharacteristiccurve)曲线显示曲线下面积0.872,95%可信区间为0.844-0.899,p<0.001。图5WesternBlot方法'险证了肺瘤病人血清中固Pll的水平高于对照组的水平Tl-T3:胃癌；T4-T5:乳腺癌；T6:结肠癌；Nl-N2:非癌对照。具体实施方式下面结合本发明的具体实施方式。材料方法一，胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、PAMC82、MKN45、SNU1、SNU5、SNU16、RF1、RF48在5%胎牛血清DMEM培养基中培养，AGS和N87在10%胎牛血清DMEM培养基中培养，培养基中含有终浓度为100,000units/L的青霉素和100mg/L的链霉素，在5%(:02中37。C培养。二，i7-戶CT取5.0pg总RNA，其中加入.O.5plOligo(dT)，70。C变性10分钟，然后力口入6.0(il5xFirstStrandBuffer、2.0jxl2.5mMdNTPsmix、0.5plRNasin(40一l)和l.O(ilMMLV(200U/|ul),混匀后37。C孵育1小时，最后70。C15分钟终止反应。PCR反应体系的总体积为20包括有10xPCRBuffer,2.5mMdNTPsmix,rs《DNA聚合酶，cDNA模板和特异性引物等。内对照p-actin和目的片段的扩增在同一反应中进行。实验至少重复2次以保持一致性。PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳并经测序确认。鹿Pll的RT-PCR扩增反应程序如下95。C预变性5分钟，94。C变性45秒，6(TC退火45秒，72。C延伸l分钟，32-34循环，最后72。C延伸10分钟。上游引物序列5，-TGGCTGTACGACGGTGAAAA-3，，下游引物序列5，-CATGGGTCTCTAGCCTGATA-3，，扩增片段长度为449bp。见图1，,11mRNA在10个胃癌细胞系中有差异表达，而且胃癌组织中固PllmRNA的阳性率高于配对的正常组织，统计结果见表l。三，>€瘦逸织必穸染^免疫组化染色采用ABC(avidin-biotinylated-peroxidasecomplex)染色法(ABC检测试剂盒，美国VECTOR公司)。應Pllmousemonoantibody(Ab-5，CloneSL3.05)为NeoMarkers公司产品。组织芯片脱蜡，经3%H202封闭内源性过氧化物酶、微波抗原修复及牛奶封闭后，滴加一抗(画Pll稀释度为1:200),4。C孵育过夜；滴加ABC复合物(卵白素与生物素化辣根酶按1:100稀释比例等量混合)，室温孵育30分钟；DAB-HA显色，苏木素复染，温水返蓝，脱水，透明，树脂封片。组织中染色阳性细胞大于5%可判定为阳性。见图2,醒Pll蛋白在胃癌组织中的表达情况A、B:醒Pll在高分化胃癌组织中的表达；C、D:薩Pll在低分化胃癌组织中的表达；E、F:MMP11在异形增生和肠上皮化生组织中的表达；G:固P11在腺颈部高表达；H:MMP11在正常胃组织中的弱阳性表达。统计结果见表l。欧，*feWer/z为、浙将50-10ug血清样品加入2xSDS凝胶加样緩冲液，顺序加样，行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，经湿式电转仪(Bio-Rad)95V恒压水浴转膜(PVDF,Pharmacia公司),5。/。脱脂牛奶4。C封闭过夜；孵育一抗醒Pll(1:500，Ab-5，CloneSL3.05)4X过夜。加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育l小时，化学发光(ECLPlusWesternBlottingDetectionSystem,AmershamBiosciences,UKLimited),显影、定影。观察杂交信号。已杂交过的膜用StrippingBuffer(100mMbeta-巯基乙醇，2%SDS，62.5mMTris.HCl，PH6.7)浸洗后，按前述步骤，依次封闭，进行Tubulin抗体孵育，检测发光信号。见图5，利用WesternBlot技术检测了画P11蛋白。96孔板每孔加入liug/ml(0.05M碳酸溶液pH9.6稀释),P11多克隆抗体(Biological,US)50jil,4°C孵育16小时；弃去上清，0.05%的PBST洗3遍，滤纸吸干；ly。BSA封闭，4"C过夜；弃去上清，0.05%的PBST洗6遍，滤纸吸干，每孔加血清50ji"1:20稀释),阴性对照孔加0.05%的PBST,37°C水浴孵育1.5小时；弃去上清，0.05°/。的PBST洗6遍，滤纸吸干，每孔加1jug/ml腿Pll单克隆抗体(NeoMarkers，Fremont,CA)50jul，37°C水浴孵育l.5小时；弃去上清，0.05%的PBST洗6遍，滤纸吸干，加入辣根酶标记小鼠IgG(1:1500稀释)，37°C水浴孵育40分钟；弃去上清，0.05%的PBST洗6遍，滤纸吸干，四曱基联苯胺(3,3'，5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)室温避光显色20分钟；12.5%H2S04终止反应；酶标仪450nm检测0D。见图3与图4，肿瘤病人血清,Pll的均值远高于非癌对照组(/K0.001),水平线代表均值；ROC曲线显示曲线下面积0.872,95%可信区间为0.844-0.899,p<0.001,表明该检测方法的灵敏度与特异性较高。统计数据见表2、3、4和5,表3对比了画Pll与其它肿瘤标志物的灵敏度；表4与表5分别分析了匿Pll与其它肿瘤标志物以及临床病理资料的相关性。附表l，,Pll在胃癌组织中表达水平的比较TotalcasesPositiveNegativepvaluemRNAlevelNormalGarcinomaProteinlevelNormalCarcinoma3030201007(23.0%)18(60.0%)5(25.0%)41(41.0%)23(77.0%)12(40.0%)15(75.0%)59(59.0%)0.0040.179表2，,Pll在肿瘤病人血清中的表达水平PatientgroupMean士SEMedianRangepvalueGastricCancerControl1.437±0.0131.4131.02-2.4581.174±0.0061.1591.001-1.530.001BreastCancerControl2.245±0.0432.1661.42-3.1081.162±0.0981.1481.01-1.47O扁ColorectalCancerControl2.206±0.0482.2171.35-2.731.136±0.0781.1291.01-1.28O遠LungCancerControl1.785士0.07451.781U3±0.08321.131.05-2.521.0-1.280.001SE，standarderror.表3，MMPll与其它肿瘤标志物灵敏度的比较Positive(%)NegativeTotalCEA55(27.6)144199CA19963(32.3)132195CA72.461(34.9)114175CA24233(26.2)93126MMPll138(45.2)167305表4,MMPll与其它肿瘤标志物的相关性分析MMPllTumormarkersPositiveNegativevalueCEAPositive20340.091Negative6972CA199Positive28340.017Negative6135CA72.4Positive22380.052Negative5755CA242Positive11210.07Negative45429表5,血清函Pll水平与胃癌临床病理因素的关系<table><table>权利要求1、一种基质金属蛋白酶MMP11的血清学检测方法，其特征在于采用酶联免疫吸附技术，将MMP11多克隆抗体与固相载体连接，形成固相抗体，让标本中的MMP11抗原与固相载体上的抗体结合，然后使固相免疫复合物上的抗原与酶标MMP11单克隆抗体结合，加底物使夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2、根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶MMPll的血清学检测方法，其特征在于所述方法建立了血清躍Pll的检测试剂盒。3、一种基质金属蛋白酶固P11血清学检测的用途，其特征在于可以用于检测肿瘤病人血清中画Pll蛋白的水平。4、根据权利要求2所述画Pll血清学检测的用途，其特征在于血清MMPll的检测有较高的灵敏度与特异性，國Pll蛋白能成为新的肿瘤血清分子标志物，用于肿瘤的诊断与预后分析。全文摘要本发明公开了基质金属蛋白酶MMP11(Matrixmetalloproteinase11)的血清学检测方法及用途。利用基因芯片技术和生物信息学方法，得到了胃癌基因表达谱，以MMP11基因为例，从mRNA和蛋白质水平验证了该基因在肿瘤细胞系和组织中的表达特征。同时，利用酶联免疫吸附(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)技术建立了血清MMP11的检测试剂盒，并检测了MMP11蛋白在胃癌病人血清中的表达水平。MMP11蛋白在胃癌病人血清中的水平明显高于非癌对照组(p＜0.001)。同样的趋势也见于乳腺癌、结直肠癌和肺癌。在对胃癌的血清检测中，MMP11的灵敏度高于CEA、CA199、CA72.4和CA242等肿瘤分子标志物，并且MMP11与CA199有较好的相关性(p＝0.017)。通过对临床病理资料的分析，血清MMP11水平与胃癌病人的转移状态有明显的相关性(p＝0.009)。MMP11有可能成为一个新的肿瘤血清标志物，用于肿瘤的诊断与预后判断。文档编号G01N33/564GK101324577SQ20071011120公开日2008年12月17日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者吕有勇,张青云,杨艳红,耿排力,白肖,华邓申请人:北京市肿瘤防治研究所