神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

文档序号:5875842阅读:287来源:国知局

专利名称::神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域
:本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
:烯醇化酶是糖酵解过程的关逢酶,它是由a、(3和Y三种亚基组成的二聚体构成的,可将其分为五种同工酶(aa、a|3、ay、郎和17)。其中Y二聚体同工酶NSE(h,神经特异性烯醇化酶)因最初发现存在于神经细胞及神经内分泌细胞而得名。NSE除具酶共有的催化活性之外,还与神经及神经内分泌细胞的分化和成熟相关。近年来,NSE作为敏感的肿瘤标志物及脑损伤时的定量指标而日益受到人们的重视。在肿瘤标志物的化学分类中,NSE属于酶类标记物。NSE是一项检测小细胞肺癌(SCLC)和神经母细胞瘤的重要参数。其对小细胞肺癌(SCLC)诊断的特异性要优于CEA和TPA。NSE数值与小细胞肺銜(SCLC)的转移程度有关,且与其治疗的反应性之间存在良好的关系。NSE对神经母细胞瘤的早期诊断、疗效监测和预报复发也具有重要的参考价值。此外,血清或脑脊液NSE水平变化还与脑损伤范围或疾病严重程度密切相关,是早期预测预后的重要指标。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速,已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟,具有先进性且实用性强,易于推广的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同,但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的实验结果及临床应用资料,从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看,依次为化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在诸多缺点,如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。酶免疫分析法灵敏度低,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性。现有技术中的化学发光免疫分析定量试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统,需要昂贵的全自动化学发光测量仪,从而限制了推广使用,无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物,因而其灵敏度大大提高,并且操作简便适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量系统,可实现大批量快检测,使用成本低,更易推广应用。
发明内容本发明的发明人致力于解决上述问题从而提出并完成了本发明。本发明的目的之一是提供一种神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析定量测定试齐u盒。本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包括1)神经特异性烯醇化酶校准品;2)神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被的固相载体;3)酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体;以及4)标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的酶所作用的化学发光底物。根据本发明的试剂盒,其中,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。根据本发明的试剂盒,其中,所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。根据本发明的试剂盒,其中,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。优选地,上述试剂盒中,所述1,2-二氧乙垸类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙垸、CSPD或CDP-Star。本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法,包括以下步骤1)配制神经特异性烯醇化酶校准品;2)以神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被固相载体;3)以酶标记祌经特异性烯醇化酶单克隆抗体;4)分装上述神经特异性烯醇化酶校准品、酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体和化学发光底物;以及5)组装为成品。根据本发明的方法,优选,所述包被固相载体的歩骤包括以下步骤I)包被采用0.05MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及III)封闭配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2P(V2H20、2.9gNaH2P(V12H20、10gBSA禾卩lmL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.07.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。具体地,所述包被方法可以包括I)包被采用lOOOmL的0.05MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠去离子水溶液,或lOOOmL的0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液,与适当浓度的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及III)封闭配制封闭液,基于lOOOmL所述封闭液包含0.2gNaH2PCV2H20、2.9gNaH2P04'12H20、10gBSA和lmL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.07.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。在上述方法中,优选,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。在上述方法中,优选,所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。在上述方法中,优选,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。在上述方法中,优选,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。本发明的试剂盒中的神经特异性烯醇化酶校准品,以蛋白分析缓冲液为基质,加入神经特异性烯醇化酶纯品配置而成。神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被固相可以为不透明聚苯乙烯板。神经特异性烯醇化酶单克隆抗体酶标记物可以为辣根过氧化物酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体。化学发光底物可以为HRP-H202-luminol发光体系。神经特异性烯醇化酶单克隆抗体酶标记物可以为辣根过氧化物酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体。采用的是过碘酸钠法进行标记。其具体原理为辣根过氧化物酶为一种分子量为44,000的糖蛋白,含糖量达到18%。本发明使用过碘酸钠氧化与酶活性无关的糖基,生成的醛基与抗体上的氨基形成Sciff's碱,接着加入硼氢化钠将其还原成稳定的结合物,最后往酶标记抗体中加入等量的甘油进行保存。神经特异性烯醇化酶单克隆抗体酶标记物也可以为碱性磷酸酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体,采用戊二醛法连接。神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被固相通过物理吸附作用完成。本发明人考察了不同缓冲体系对神经特异性烯醇化酶单克隆抗体在固相上的物理吸附效率。本发明采用的载体固相可以为96孔微孔板,以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体,催化化学发光底物(由鲁米诺或AMPPD、化学发光增强剂和&02组成)发生化学反应,释放大量能量,产生激发态中间体。使用光电倍增管检测中间体由激发态回到基态放射的光子数。该过程产生的光子数与样品中的神经特异性烯醇化酶浓度成正比关系。据此,建立标准曲线并计算样品中的神经特异性烯醇化酶含量。本发明的试剂盒可以测定样品中的神经特异性烯醇化酶的含量,并据此判断治疗效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该定量测定试剂盒的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且,根据本发明的检测系统为开放式操作,简便快速,不需要昂贵的全自动化学发光测量仪,特别适合广大的中小医院推广使用,为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物,通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物,因而具有与酶联免疫分析同等的特异性,而灵敏度大大提高,比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍,可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。具体实施例方式实施例1神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒的制备一、酶标抗体制备(1)辣根过氧化物酶标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的制备溶解4.4mgHRP于lmL蒸镏水中,加入0.4mL过碘酸钠(5Ommol/L)室温搅拌20min,经lmmol/L醋酸钠缓冲液,pH4.4透析后加入8mg神经特异性烯醇化酶抗体,搅拌2h,最后用200mmol/LNaBH4进行还原,经0.02MPB缓冲液透析后,加等体积甘油,一2(TC以下保存。(2)碱性磷酸酶标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的制备神经特异性烯醇化酶单克隆抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联,对PBS充分透析,加等体积甘油,一20"C以下保存。二、固相包被板的制备(1)包被采用0.05MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;具体地,所述包被方法可以包括无水碳酸钠1.59g碳酸氢钠2.94g去离子水1000mL溶解混匀后,调整pH至9.6,加入5.0mg神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔110pL,4t过夜。或者,柠檬酸4.44g柠檬酸三钠7.3g去离子水1000mL溶解混匀后,调整pH至4.6,加入5.0mg神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混匀,然后加入微孔板各孔中,每孔ll(HiL,4'C过夜。(2)洗漆用生理盐水洗三次。(3)封闭NaH2P04-2H200.2gNa2HP04-12H202.9gBSA10gProclin300lmL双蒸水定容至lOOOmL将上述试剂称量好放入洁净容器中,加双蒸水定容,溶解混匀,测定pH值为7.0。每孔分别加入封闭液300|aL,室温放置3小时。鬼掉封闭液,在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检査无漏气,如果有漏气需重新封袋。贴签后置28。C保存。三、神经特异性烯醇化酶校准品的制备用神经特异性烯醇化酶纯品配制,分装0、5、15、50、150、200ng/mL共6瓶。四、酶标单抗稀释液Tris12.120gBSA5gProclinlmL双蒸水lOOOmL五、抗体浓度选择采用方阵法选择神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被固相所用抗体稀释度为1:5000,酶标抗体的工作浓度大于1:6000。六、化学发光底物液本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法A液在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1MpH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚。B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸,配制成O.lMpH值为4.6的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。使用方法使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法Tris24gHCl15mLNaCl160gKC14gProclin300lmL双蒸水lOOOmLAMPPD200mL七、洗涤缓冲液Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL'去离子水lOOOmL调整pH值至7.4。八、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成定量测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。综上,在本发明的研究过程中,本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定,然后对包被方法进行了研究,选择出最适合的包被缓冲液和封闭液,找到最佳的浓度条件,并且,配制出了能够使酶标记物长期保持活性的稀释液。'实施例23制备本发明的神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒除分别以塑料珠、磁性颗粒作为载体外,其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量测定试剂盒。实施例4本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的试剂盒的具体操作如下1)平衡所有检测试剂和样本至室温;2)取需用量的板条;3)每孔、管依次加入50pL酶标抗体、校准品/待测样本,于微量振荡器上振荡30秒使其混合均匀;4)室温温育60min;5)用自动酶标洗板机进行洗板,将固定在固相载体上的包被抗体-抗原-酶标抗体复合物与未结合物分离;6)以l:1比例混合发光底物A与B,每孔/管加入体积为100pL,室温温育5min,在515min内利用化学发光检测仪进行检测;7)使用Log(x)-Log(y)的双对数数据拟合方式,进行标准曲线的建立,计算实验测定结果。实施例5本发明的试剂盒的方法学鉴定本发明可以达到的方法学指标如下所示灵敏度(与零剂量可以区分开的点)<0.43ng/mL;标准曲线范围为0200ng/mL;精密度批内与批间变异均小于10%;准确度分别进行低、中和高三个浓度血清(浓度分别10ng/mL、25ng/mL和150ng/mL)的回收试验平均为103%、105%和98%(三次平均值);特异性与其类似物的交叉反应率《0.01%;稳定性各试剂组分置37'C,考察6天后,各组分仍稳定。实施例6本发明的神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒与Adlitteram诊断公司的酶联试剂盒比较.取用医院临床收集肿瘤病人血清标本60份,正常人血清标本200份。分别使用本发明实施例1的试剂盒和Adlitteram试剂盒进行血样检测,统计实验结果并进行相关分析,这两种方法高度相关(相关系数为0.9877)。这亦证实了本试剂盒的临床使用价值。本发明试剂盒的临床实验比对,实验结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括1)神经特异性烯醇化酶校准品;2)神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被的固相载体;3)酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体;以及4)标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的酶所作用的化学发光底物。2、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。.4、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤1)配制神经特异性烯醇化酶校准品;2)以神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被固相载体;3)以酶标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体;4)分装上述神经特异性烯醇化酶校准品、酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体和化学发光底物;以及5)组装为成品。7、如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤I)包被采用0.05MpH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于固相载体上;II)用生理盐水洗涤上述固相载体;以及III)封闭配制封闭液,基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2PCV2H20、2.9gNaH2PCV12H20、10gBSA和lmL生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.07.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。8、如权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。9、如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述标记神经特异性烯醇化酶单克隆抗体的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。10、如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。11、如权利要求IO所述的方法,其特征在于,所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚垸)-l,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明涉及免疫分析医学领域,具体地,本发明提供了一种神经特异性烯醇化酶化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括1)神经特异性烯醇化酶校准品;2)神经特异性烯醇化酶单克隆抗体包被的固相载体;3)酶标记的神经特异性烯醇化酶单克隆抗体;以及4)上述酶所作用的化学发光底物。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法,包括配制校准品、包被载体、标记抗体、分装等步骤。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。本发明对小细胞肺癌(SCLC)、神经母细胞瘤以及脑损伤情况等一些疾病的早期发现,病情进展检测,疗效判断提供很好的技术支持。文档编号G01N33/577GK101377499SQ200710121119公开日2009年3月4日申请日期2007年8月30日优先权日2007年8月30日发明者唐宝军,应希堂,李振甲,珍林,林金明,栩王,胡国茂申请人:北京科美东雅生物技术有限公司
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