专利名称：一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法
技术领域：
一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
喹诺酮是一类合成抗生素类药物，英文名称quinolones(QNS)。在化学上与萘啶酮酸相关，其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到治疗系统感染疾病，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来，这些药物在动物组织中的残留已引起广泛的注意，我国规定牛、鸡、猪、羊、兔等动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01～1.9mg/kg，欧盟规定在动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01～1.9mg/kg，日本在2002年7月1日对我国产蒲烧鳗鱼实施磺胺类抗生素检测后，又于2003年7月1日起对进口生鳗鱼及其制品进行氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留检测，并且将限量控制在方法检测限的0.05mg/kg。因此，氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。为了建立快速检测方法有必要合成一种喹诺酮抗生素多簇抗原，到目前为止，喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法还未见国内报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法，所合成抗原所制备的抗体可对多种喹诺酮类抗生素产生识别，为今后人们的快速检测的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，以诺氟沙星为原料将其衍生化制备半抗原，进而再与牛血清蛋白采用戊二醛法偶联合成抗原； 工艺步骤为 (1)人工半抗原的合成 合成路线
产物1的合成 2-溴乙胺氢溴酸盐和碳酸二叔丁酯Boc2O反应，配比控制为碳酸二叔丁酯摩尔比过量20％，以甲醇为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到60℃，反应1h，然后室温反应过夜；反应液真空浓缩，残液溶于二氯甲烷，依次用0.5N的盐酸、饱和食盐水和饱和的NaHCO3溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得淡黄色液体产物1，直接用于下一步反应； 产物2的合成 产物1和诺氟沙星反应，配比控制为产物1摩尔比过量20％，以二甲基甲酰胺为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到80℃，反应过夜，冷至室温，滴加0.5N的盐酸控制pH至6，搅拌使体系重新冷却到室温，过滤，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼，干燥，得粗产品产物2，用乙醇重结晶； 产物3的合成 产物2和三氟乙酸反应，脱碳酸二叔丁酯基室温搅拌反应3小时，真空浓缩，将残留物溶于乙醇，加入三乙胺，静止，过滤得到的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯，得产品3半抗原，命名为N-2-乙胺-诺氟沙星； (2)人工抗原的合成合成路线
透析袋的前处理取5-10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
磷酸盐缓冲溶液的配置0.2Mol/L磷酸二氢钠19mL，0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为ph7.4的磷酸盐缓冲液。
偶联蛋白 取0.1mmoL的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液，滴加至使戊二醛的最终质量浓度为1.25％，成A液； 取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液； 搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中，搅拌过夜，PBS透析5天，得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白； (3)抗原鉴定2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。
本发明的有益效果本发明合成了喹诺酮类抗生素的多簇人工抗原，合成步骤简洁，有效，经过后处理，纯度可达99％以上，完全可用于免疫分析中，为今后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
图1半抗原的液相色谱图 图2半抗原的质谱正离子图 图3半抗原的紫外吸收图 图4抗原的紫外吸收图
具体实施例方式 (1)人工半抗原的合成 合成过程 产物1的合成 在一个1L的圆底烧瓶中加入500mL的甲醇，2-溴乙胺氢溴酸盐(10g，49mmol)，三乙胺(30mL)，碳酸二叔丁酯Boc2O(13g，60mmol)，搅拌、加热升温到60℃，反应1h，然后室温反应过夜。反应液真空浓缩，残液溶于500mL二氯甲烷，依次用0.5N的盐酸(250mL×2)、饱和食盐水(250mL)、饱和的NaHCO3(250mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得淡黄色液体产物1(收率63％)，直接用于下一步反应。
产物2的合成 在一个250ml的圆底烧瓶中加入诺氟沙星(5.499g，17.2mmol)，DMF(70mL)，搅拌均匀，加入三乙胺(4.8mL，35mmol)，然后加入产物1(4.631g，20.6mmol)，升温至80℃，反应过夜。反应液冷至室温，滴加0.5N的盐酸调pH至6左右，搅拌使体系重新冷却到室温，过滤，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼，干燥，得粗产品产物2，用乙醇重结晶后，用H-nmr检测，结构正确为目标产物。
产物3的合成 在一个250mL的圆底烧瓶中加入50mL二氯甲烷，3.763g产物3，然后加入35mL三氟乙酸，室温搅拌反应3小时，真空浓缩，将残留物溶于乙醇，加入1.4mL的三乙胺，静止，过滤的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯，纯度为97.61％。
(2)人工抗原的合成。合成过程为 透析袋的前处理 取5-10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
磷酸盐缓冲溶液的配置 磷酸盐缓冲液(Borate saline buffer)0.2Mol/L磷酸二氢钠19ml和0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
偶联蛋白 取0.1mmol的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液，滴加至溶液的戊二醛终浓度为1.25％，成A液。
取0.002mmol的牛血清蛋白(BSA)溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液。
搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中。搅拌过夜，PBS透析5天。得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白； (3)抗原鉴定 摩尔吸收系数ε配制人工半抗原浓度为0，10，20，30μg·mL-1的20％乙醇溶液，通过紫外扫描可知人工半抗原的最大吸收波长为278nm，在278nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定配制牛血清蛋白浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的磷酸盐缓冲液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样。、在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白曲线。估算偶联物的蛋白质浓度蛋白质量/偶联产物的体积，以此来确定稀释比例，让稀释后的浓度在牛血清蛋白曲线以内，稀释过的样品要同牛血清蛋白曲线的测定进行同样测定，经过数据处理可得到偶联产物蛋白浓度。
偶联比测定配制150μg·mL-1 BSA的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到1 50 μg·mL-1，在242nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为r＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/65000) 其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，65000为BSA分子量，150×10-3为BSA浓度(μg·mL-1)。
权利要求
1.一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，其特征是以诺氟沙星为原料将其衍生化制备半抗原，进而再与牛血清蛋白采用戊二醛法偶联合成抗原；
工艺步骤为
(1)人工半抗原的合成
合成路线
产物1的合成
2-溴乙胺氢溴酸盐和碳酸二叔丁酯Boc2O反应，配比控制为碳酸二叔丁酯摩尔比过量20％，以甲醇为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到60℃，反应1h，然后室温反应过夜；反应液真空浓缩，残液溶于二氯甲烷，依次用0.5N的盐酸、饱和食盐水和饱和的NaHCO3溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得淡黄色液体产物1，直接用于下一步反应；
产物2的合成
产物1和诺氟沙星反应，控制配比为产物1摩尔比过量20％，以二甲基甲酰胺为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到80℃，反应过夜，冷至室温，滴加0.5N的盐酸控制pH6，搅拌使体系重新冷却到室温，过滤，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼，干燥，得粗产品产物2，用乙醇重结晶；
产物3的合成
产物2和三氟乙酸反应，脱碳酸二叔丁酯基室温搅拌反应3小时，真空浓缩，将残留物溶于乙醇，加入三乙胺，静止，过滤得到的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯，得产物3半抗原，命名为N-2-乙胺-诺氟沙星；
(2)人工抗原的合成
合成路线
透析袋的前处理取5-10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
磷酸盐缓冲溶液的配置0.2Mol/L磷酸二氢钠19mL和0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为pH7.4的磷酸盐缓冲液；
偶联蛋白
取0.1mmol的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲液中，搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液，滴加至溶液的戊二醛最终质量浓度为1.25％，成A液；
取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液；
搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中，搅拌过夜，磷酸盐缓冲液中透析5天，得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白；
(3)抗原鉴定N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。
全文摘要
一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以诺氟沙星为原料，经过诺氟沙星的衍生化和羧基保护制备半抗原N-2-乙胺-诺氟沙星，再偶联蛋白合成喹诺酮类抗生素多簇抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白。本发明成功合成了喹诺酮类抗生素多簇抗原，合成步骤简洁，经过提纯后处理，纯度可达到99％以上，完全可以用作喹诺酮类多簇酶联免疫试剂盒的应用，为今后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号G01N33/53GK101158680SQ200710134500
公开日2008年4月9日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者胥传来, 李雅丽, 王灿辉, 唐剑峰, 伟 陈, 刘丽强, 陶冠军, 昉 秦 申请人:江南大学