专利名称：一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法
一种0 -内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法技术领域一种P -内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
技术背景7-氨基头孢垸酸，英文名称7-AminoCephalosporanicAcid (7-ACA)， CAS 号957-68-6，分子式为C1()H12N205S,是P-内酰胺类中头孢类抗生素中间体。P -内酰胺类抗生素是指化学结构中含有P-内酰胺环的一类抗生素，主要包括青 霉素类和头孢菌素类，其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性,从而阻止 细菌细胞壁的合成，呈现杀菌活性。在畜类动物词养中，e-内酰胺类抗生素广 泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其 使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给 人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐 药性等。因此其在乳制品中的残留也越来越引起了国内外的重视。其中头孢类 抗生素由于具有抗菌谱广等优点被广泛用于人畜疾病的防治。且头孢类抗生素 种类繁多，现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对所有头孢类抗生素进 行快速、准确的检测，有必要研究快速、便携的免疫检测技术——胶体金免疫 技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内尚没有针 对头孢类抗生素的胶体金免疫检测方法的报道，为了弥补这一空白，设计合成 了以头孢类抗生素的中间体7-氨基头孢烷酸为半抗原的用于头孢类抗生素检测 的完全抗原。 发明内容本发明的目的是提供一种e -内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法。所制 备的产品用于头孢类抗生素的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必 需的人工抗原。本发明的技术方案 一种头孢类抗生素中间体7-氨基头孢垸酸人工抗原的 合成方法，7-氨基头孢垸酸縮写为7-ACA，以7-氨基头孢垸酸为半抗原，用戊 二醛法将其与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联，用紫外扫描仪 (UNICO，UV-2802pcs)测定偶联物的偶联比。其反应方程式为<formula>formula see original document page 3</formula>(1)人工抗原的合成7-ACA、戊二醛、'牛血清蛋白以摩尔比为100 : 10 : 1
的比例反应，首先让戊二醛与半抗原7-ACA的氨基室温下反应30min,然后加 入牛血清蛋白室温下搅拌反应3h，即得7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液。因为 7-ACA分子量为272，作为半抗原相对较小，采用戊二醛作为交联剂，戊二醛 既是交联剂又是连接臂，省去了加入连接臂的半抗原合成步骤。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液和2X2L 的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人 工抗原7-ACA-牛血清蛋白。(2)人工抗原的鉴定7-ACA-牛血清蛋白采用紫外扫描仪测定其偶联比， 分别在262nm、 278nm处测吸光值，并计算其偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方 法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓 度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联 物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸收系数e:配制7-氨基头孢烷酸(7-ACA)浓度为0， 10， 20， 30吸mL—1 的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-氨基头孢烷酸的最大吸收波长为262nm， 牛血清白蛋白的最大吸收波长为278nm，分别在262nm、 278 nm处测其吸光值， 每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为^=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得 Sa262=9850 L，l"、 s趣-6177L.m。r1。配制浓度分别为0 、 0.2 、 0.4 、 0.6、 0.8、 l.Omg'mL"的牛血清蛋白(BSA)， 通过紫外扫描可知BSA的最大吸收波长为278 nm，分别在278nm、 262 nm测 吸光值，每个浓度做平行样。本发明计算得摩尔吸光系数分别为 s腦-40293L，r1 、 sB262=24954 L，l-1 。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度 与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液 的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液 的蛋白浓度为4.7916mgTnL"。偶联比测定将偶联产物用超纯水稀释到150吗.mL—1，测262nm、 278nm 波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值为Ap A2，则偶联比率 Ca/Cb为Ca/Cb气A!XsB278-A2XsB262)/(A2XsA262-AiXs甜8)，本发明计算得r" 16 。其中s为摩尔吸光系数(Lmor1)， 65000为牛血清蛋白的分子量，150xl(T3
为牛血清蛋白浓度(吸ml/1)。本发明的有益效果本发明成功合成了 7-ACA的人工抗原，合成步骤简洁， 有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以 满足国内对其研究的需要。
图l 7-ACA、 BSA及其偶联物的紫外扫描组合图。
具体实施例方式实施例1(1) 人工抗原的制备称取7-氨基头孢垸酸27.2mg (O.lmmol)溶于8mLPBS(0.01mol/L)溶液中， 充分溶解后逐滴加入40nL25。/。的戊二醛(O.Olmmol)，反应30min。另称取BSA 68mg (O.OOlmmol)溶于2 mL PBS(0.01mol/L)溶液中后逐滴加入上述反应液， 室温下搅拌反应3h。即得人工抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M pH7.4的PBS缓冲液 和2X2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末， 即得到人工抗原7-ACA-牛血清蛋白。(2) 7-氨基头孢垸酸人工抗原的鉴定偶联比测定估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法， 虽然方法很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量) 的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的 原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子 均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸收系数s:配制7-氨基头孢垸酸(7-ACA)浓度为0， 10， 20， 30吸mU1 的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-ACA的最大吸收波长为262nm，分别在 262nm、 278nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为^=吸 光值/摩尔浓度。本发明计算得SA26f9850L'mor1、 SA27f6177L'mor1。配制浓度分别为0 、 0.2 、 0.4 、 0.6、 0.8、 1.0mg'mL"的牛血清蛋白(BSA)， 通过紫外扫描可知BSA的最大吸收波长为278 nm，分别在278 nm、 262 nm测 吸光值，每个浓度做平行样。本发明计算得摩尔吸光系数分别为 SB27『術93L.mor1 、 sB262=24954 L，l-1 。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200昭'ml/1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定7-ACA-牛血清蛋 白抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算 得抗原溶液的蛋白浓度为4.7916mg.mL"。偶联比测定将偶联产物7-ACA-牛血清蛋白用超纯水稀释到150昭.mL-1， 测262nm、 278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值为A,， A2，则偶联比率r=Ca/Cb为i^Ca/Cb^Ai X eB278-A2X eB262)/( AzXsa^-AjX Sa278)，本发明计算得r"16。
权利要求
1.一种头孢类抗生素中间体7-氨基头孢烷酸人工抗原的合成方法，7-氨基头孢烷酸缩写为7-ACA，其特征是以7-ACA为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清蛋白偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的合成7-ACA、戊二醛、牛血清蛋白以摩尔比为100∶10∶1的比例反应，首先让戊二醛与半抗原7-ACA的氨基室温下反应30min，然后加入牛血清蛋白室温下搅拌反应3h，即得7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原7-ACA-牛血清蛋白；(2)人工抗原的鉴定7-ACA-牛血清蛋白采用紫外扫描仪测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。
全文摘要
一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以7-氨基头孢烷酸为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了7-氨基头孢烷酸的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号G01N33/53GK101153871SQ200710134518
公开日2008年4月2日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者刘利强, 彭池方, 胡拥明, 胥传来, 谢会玲 申请人:江南大学