专利名称：：检查痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法
技术领域：
：本发明涉及检査病毒制备物中的外源病毒污染物的方法。特别地，本发明涉及检查痘病毒或其重组病毒、特别是痘苗病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法。
背景技术：
：病毒制备物在毒种选育和生产过程中，都需要使用动物或细胞作为培养基质。作为培养基质的细胞可能存在病毒污染，因此有可能造成病毒制备物被外源因子(特别是外源病毒)所污染。为保证产品质量，需要对毒种和作为培养基质的细胞进行外源病毒检查。通常，毒种外源病毒检査的原理是使用非人源和非猴源的特异性抗血清中和适当稀释的毒种。将中和后的病毒悬液接种细胞(简称"细胞法")、动物(简称"动物法")或者鸡胚(简称"鸡胚法")，观察是否有外源病毒的存在。其中细胞法是较为简便，且使用最多的方法。细胞法的具体步骤包括将中和后的病毒悬液分别接种人源、猴源和生产用细胞，并将细胞于36士1'C培养2周；镜下观察是否有细胞病变或血球吸附现象；如结果无细胞病变和血球吸附现象则表明毒种无外源病毒污染(xnc病毒外源因子检査，《中国药典三部》，2005)。然而细胞法不能用于检査一些不能被特异性抗血清完全中和的病毒("不完全中和病毒")的制备物中是否存在外源病毒污染，这类不能被特异性抗血清完全中和的病毒例如为痘病毒等。这类病毒即使在经适当稀释后仍不能被其特异性抗血清完全中和，接种细胞后未被中和的病毒也将与外源病毒类似地产生细胞病变或血球吸附现象，导致无法判断结果。因此这类病毒及其重组病毒制备物无法在细胞上完成外源病毒污染物的检查。这类不能被特异性抗血清完全中和的病毒通常用动物法和鸡胚法进行外源病毒污染物的检査，即将经特异性抗血清中和后的病毒悬液接种小鼠和乳鼠的脑室和腹腔、鸡胚尿囊腔和卵黄囊。试验判定标准是(1)7天后鸡胚尿囊液血球凝集试验阴性且80%鸡胚存活；(2)14天后乳鼠80%存活且死亡动物无病毒感染，解剖死亡的乳鼠，取病变组织、脑、脾制成细胞悬液再次接种乳鼠，观察14天，乳鼠无病毒感染现象；(3)21天后小鼠80%存活且死亡动物无病毒感染；解剖死亡的小鼠，取病变组织、脑、脾制成细胞悬液再次接种小鼠，观察21天，小鼠无病毒感染现象。当鸡胚、乳鼠、小鼠试验均为阴性时，表明无外源病毒污染(XDC病毒外源因子检查，《中国药典三部》，2005)。该方法操作复杂，耗时长，且易受外界因素影响。PCR和免疫化学方法是WHO建议的方法(参见，WHORECOMMENDATIONSFORPRODUCTIONANDCONTROLOFSMALLPOXVACCINE*REVISED2003，p5)，但迄今为止这两种方法均未建立，其最大的技术障碍在于，无法囊括所有可能存在的外源病毒，极易造成漏检。
发明内容本发明针对不能被其特异性抗血清完全中和的痘病毒或其重组病毒提出了一种在细胞上进行痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的检查的新方法。应用本发明的方法，可以实现在细胞上对痘病毒(特别是痘苗病毒)或其重组病毒制备物进行外源病毒污染物的检查。具体而言，本发明提供了一种检查痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法，该方法包括以下步骤a)将待检痘病毒或其重组病毒制备物用对应的痘病毒特异性抗血清进行中和；b)将中和后的病毒悬液经滤膜过滤；和C)将滤液接种细胞，其中所接种的细胞产生细胞病变或血球吸附现象表明所述痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染。在前述方法中，还可进一步包括在步骤a)之前用滤膜对待检痘病毒或其重组病毒制备物进行过滤以除去制备物中的细胞碎片的步骤。在前述方法中，采用孔径大于0.22^im的滤膜在中和之前对病毒制备物进行过滤以除去其中的细胞碎片；采用孔径为约0.22Min的滤膜过滤中和后的病毒悬液。特别地，在本发明的方法中所述痘病毒是痘苗病毒。图1:将痘苗病毒天坛株制备物用特异性抗血清中和后经0.22pm孔径的滤膜过滤，将所得滤液接种CEF细胞后的显微照片。从图中可见，接种后的CEF细胞后未出现细胞病变。图2A:将痘苗病毒天坛株制备物用特异性抗血清中和后不经过滤直接接种CEF细胞，然后用血球吸附法显示病变部位。从图中可见，接种后的CEF细胞出现了细胞病变，且出现病变的细胞表面均吸附了鸡血球。图2B:用荧光抗体染色显示图2A中的病变部位。从图中可见，在经痘苗病毒特异性抗体的荧光染色后，吸附鸡血球的病变部位显示出荧光，这说明CEF细胞的病变是由痘苗病毒引起的(图中箭头所示血球吸附明显的区域亦是荧光强度较强的区域)。图3A:痘苗病毒天坛株制备物不经特异性抗血清中和而直接经0.22拜孔径的滤膜过滤，将所得滤液接种CEF细胞，然后用血球吸附法显示病变部位。从图中可见，接种后的CEF细胞出现了细胞病变，且出现病变的细胞表面均吸附了鸡血球。图3B:用荧光抗体染色显示图3A中的病变部位。从图中可见，在经痘苗病毒特异性抗体的荧光染色后，吸附鸡血球的病变部位也显示出荧光，这说明CEF细胞的病变是由痘苗病毒引起的。具体实施例方式术语"不完全中和病毒"大多数病毒与特异性中和抗体结合后将失去感染敏感细胞的能力。但极少数种类的病毒与特异性中和抗体结合后，仍有少量病毒可以感染敏感细胞，这类病毒称之为不完全中和病毒o不完全中和病毒的实例是痘病毒，例如痘苗病毒。"毒种"一定数量的已验明其来源、历史和生物学特性并经临床研究证明其安全性和免疫原性良好的病毒株(或菌株)或用于制备原疫苗(OriginalVaccine)的活病毒(或菌体)悬液。"血球吸附"部分病毒表面的蛋白具有凝集红细胞的能力，在病毒感染的细胞中加入红细胞，感染细胞的表面会凝集红细胞，这一现象称为血球吸附。"血吸点"被病毒感染的细胞吸附红细胞后，肉眼观察可见棕褐色的小点，称之为血吸点。"血抑效价"部分病毒表面的蛋白具有凝集红细胞的能力，病毒特异性抗血清可以与这些蛋白结合，从而抑制血细胞的凝集(简称"血抑")。能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度的倒数即为血抑效价。"痘苗病毒VTT":痘苗病毒天坛株。"细胞病变"病毒在细胞内增殖，可引起不同的结果，有的细胞完全被破坏，有的只有轻微的病变，这些统称为细胞病变。痘病毒科病毒是已知动物病毒中颗粒最大的一类DNA病毒，这类病毒即使在经适当稀释后仍不能被其特异性抗血清完全中和，接种细胞后未被中和的痘病毒也将与外源病毒类似地产生细胞病变或血球吸附现象，导致无法准确判断痘病毒制备物是否存在外源病毒的污染。因此，不能将传统的"细胞法"用于对痘病毒进行外源病毒污染物的检査。然而，用"动物法"和"鸡胚法"对痘病毒进行外源病毒污染物的检查不仅费时且结果易受外界影响。目前，对痘苗病毒的需求正日益增加。痘苗病毒属于痘病毒科正痘病毒属，长期以来作为天花疫苗在世界范围内广泛使用，主要有Lister株、纽约株、天坛株、MVA等。80年代初世界卫生组织宣布天花消灭后，天花疫苗停止接种。我国在1980-1983年间，逐渐停止了天坛株的接种，疫苗的生产也随即终止。此后，天坛株作为一种新型疫苗载体，构建了EBV、HBV、麻疹以及艾滋病重组疫苗。2001年"9.11"事件后，美国出于生物反恐的需要，在军队和医护人员中重新开始天花疫苗接种。包括中国在内的许多国家也重新开始生产天花疫苗作为战略储备。根据新颁布的《中国药典三部》(2005),天花疫苗和以痘苗病毒为载体构建的重组疫苗都需要进行病毒外源因子检査。痘病毒的颗粒大小接近常用滤膜0.22Mm的孔径，例如，痘苗病毒的大小约为270X218nm(《分子病毒学》，侯云德，22页)，猴痘病毒大小约为300X150nm，金丝雀痘病毒大小约为320X260nm。而其他容易造成痘病毒制备物被污染的外源病毒远小于0.22nm，例如腺病毒直径约为7090nrn，鸡白血病病毒直径约为80130nm，疱疹病毒直径约为110180nm。在痘病毒的特异性抗血清中含有中和抗体和结合抗体，尽管中和抗体不能完全中和病毒，但结合抗体仍然能够与未被中和的病毒相结合。将经适当稀释的病毒与特异性抗血清混合、孵育后，抗体与病毒结合形成病毒/抗体复合物，该复合物的大小远远大于0.22pm的孔径，因此不能通过孔径约0.22pm的滤膜。而其他外源病毒因为无抗体结合将仍然能够被孔径约0.22miti的滤膜滤过。将痘病毒或其重组病毒制备物与特异性抗血清中和后，经孔径约0.22拜的滤膜过滤；过滤后，除痘病毒外其他可能存在的外源病毒将仍存在于滤液中；再将滤液接种不同种类的细胞，如果发生细胞病变或血球吸附现象，则说明痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染，如果接种后不发生细胞病变或血球吸附现象，则说明痘病毒或其重组病毒制备物不存在外源病毒的污染。本发明的方法可以对痘病毒或其重组病毒制备物在细胞上进行外源病毒的检查。与传统的细胞法相比较，本发明的方法在中和步骤之后，增加了过滤的步骤。具体地，可按照如下实施本发明的方法将适当稀释的痘病毒或其重组病毒制备物与特异性抗血清混匀，进行中和；将中和后的病毒悬液经适当孔径的滤膜过滤；以及将滤液接种细胞，其中所接种的细胞产生细胞病变或血球吸附现象表明所述痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染。为保证约0.22^im孔径的滤膜能够对经特异性抗血清中和后的病毒悬液顺利地进行过滤，防止作为培养基质的细胞的碎片阻塞滤孔，可以在实施中和步骤之前，采用适当孔径的滤膜先对经稀释的痘病毒制备物进行过滤以除去其中的细胞碎片。用以除去细胞碎片的滤膜的孔径的选择原则是既能保证除去细胞碎片，又保证痘病毒制备物中的痘病毒及其他外源病毒能顺利通过该滤膜，因此滤膜孔径应大于0.22|im。可用于本发明的方法中的用以除去细胞碎片的滤膜例如有Coring公司滤膜孔径为0.45nm的针式滤器。在本发明的方法中，病毒滴度与抗血清血抑效价优选在一定比例范围内进行，决定该比例的原则是抗血清中的抗体与病毒的比例应该大于l。不同来源的抗血清的效价通常不相同，当效价不同时，抗血清的稀释比例也不同；相应地，病毒的稀释度也不同。本领域技术人员可以通过常规的试验容易地确定适当的痘病毒稀释度，以及病毒稀释度与特异性抗血清的稀释度之间的配合比例。在本发明的一个优选的实施方式中，痘病毒被稀释至终浓度2X1058X105PFU/ml，血抑效价为1:5120的特异性抗血清被稀释20-100倍；且经稀释的痘病毒与经稀释的特异性抗血清被等体积混匀，进行中和反应。对中和后的病毒悬液进行过滤的滤膜的孔径的大小应接近0.22^im。这样，除痘病毒外的其它外源病毒由于其颗粒大小远小于该孔径，将被完全过滤到滤液中；而大于该孔径的痘病毒或其重组病毒/抗体复合物将被完全留在滤膜上。对中和后的病毒悬液进行过滤的滤膜例如有Coring公司滤膜孔径为0.22jmi的针式滤器。在本发明的方法中，可将中和后的病毒悬液经过滤后所得的滤液接种细胞。接种的细胞种类可以包括1)生产痘病毒制备物所用的细胞，例如CEF细胞；2)人^I的贴壁细胞，例如Hela细胞；3)猴源的贴壁细胞，例如Vero细胞。以下结合具体实施例对本发明做进一步的非限制性阐述。本领域技术人员可在不偏离本发明的精神的范围内对其进行各种变形和修饰。实施例中所使用的通用材料痘苗病毒vTT制备物自制，将痘苗病毒vTT接种CEF细胞，于37。C培养48小时后收获细胞，反复冻融三次即获得痘苗病毒vTT制备物。兔源vTT特异性抗血清自制，用痘苗病毒vTT免疫新西兰白兔，2个月后采兔血，待血液凝固后，吸取血清即获得兔源vTT特异性抗血清。病毒稀释液含10°/。小牛血清的Eargle，s液(Gibco公司)10%鸡血球自制，采敏感鸡血放入ALSERVER，S液中，离心，漂洗，然后按照l:IO加入生理盐水，即配得10%鸡血球。健康兔血清采集健康兔血，待血液凝固后，吸取血清，56X:灭活30min即获得健康兔血清。实施例l:中和实验(1)材料痘苗病毒vTT制备物1.5X107PFU/ml兔源vTT特异性抗血清血抑效价l:5120，56'C灭活30min(2)实验步骤1)将兔源vTT特异性抗血清用PBS(0.01M，pH7.2~7.4)进行20X、50X、IOOX、500X、IOOOX稀释；将痘苗病毒vTT制备物用病毒稀释液稀释成100PFU/ml、1000PFU/ml、10000PFU/ml。2)将2ml不同稀释度的痘苗病毒vTT制备物分别与2ml病毒稀释液混匀后放置于4'C过夜，作为无血清对照组P、Q、R(分别对应于100PFU/ml、1000PFU/ml、10000PFU/ml的病毒滴度)。将不同稀释度的痘苗病毒vTT制备物分别与不同稀释度的特异性抗血清等体积混匀，于4'C放置过夜进行中和，制得vTT+特异性抗血清组A-0(见下表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3)血球吸附法测定病毒滴度a.将上述无血清对照组(P、Q、R)及vTT+特异性抗血清组(A-O)各2ml分别用病毒稀释液作10倍连续稀释，原倍及每个稀释度取0.3ml分别与2.7mlCEF细胞悬液(1X106个CEF细胞/ml)充分混匀后，加入24孔板，每孔lml，每个稀释度3个复孔，然后放置于37匸孵箱培养6872小时。b.向每孔中加入10%鸡血球0.5ml以完全覆盖CEF细胞，于室温放置30分钟。c.标示出无血清对照组及各vTT+特异性抗血清组中可见血吸点的最高稀释度孔，肉眼计数孔内血吸点数，并计算各组中3个复孔的平均血吸点，结果示于下表2表2原病毒滴度vTT+特异性抗血清组中可见血吸点的最高稀释度孔的平均血吸点无血清对照组(PFU/ml)20X50X100X500X,x平均血吸点1000000(原倍)"0.3(原倍)4.41000(原倍)0.3(原倍)0.6(原倍)0.6(原倍)3.2(原倍)2.8(1(T1)3.210000(原倍)4.4(原倍)4.0(原倍)3.6(l(T')1.6(10—')2.7(10_2)'2.4l表示可见血吸点的最高稀释度孔中的各组被病毒稀释液稀释的倍数d.按如下公式计算病毒滴度病毒滴度(PFU/ml)二平均血吸点X病毒稀释倍数/0.1ml在上述公式中，"病毒稀释倍数"指各无血清对照组及vTT+特异性抗血清组被病毒稀释液稀释的倍数；"0.1ml"为每孔中混合液的体积。病毒滴度结果示于下表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4)按下列公式计算中和率中和率=(对照组病毒滴度一vTT+特异性抗血清组病毒滴度)/对照组病毒滴度在上述公式中，vTT+特异性抗血清组A-E对应于对照组P;vTT+特异性抗血清组F-J对应于对照组Q;vTT+特异性抗血清组K-0对应于对照组R。中和率(％)的计算结果请见下表4表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根据以上结果可以看出，vTT仅在100PFU/ml可以被高效价血清中和，随着病毒滴度的升高，中和效率逐渐降低。而100PFU/ml的滴度很低，不符合《中国药典三部》(2005)中关于病毒外源因子检查对病毒浓度的要求。实施例2:痘苗病毒vTT制备物的中和、过滤实验(1)材料痘苗病毒vTT制备物1.5X107PFU/ml。兔源vTT特异性抗血清血抑效价l:5120，56。C灭活30min。(2)实验步骤A.将兔源vTT特异性抗血清用PBS(0.01M,pH7.27.4)进行50X稀释。B.将痘苗病毒vTT制备物用病毒稀释液稀释成4X105PFU/ml，用0.45pm的滤膜过滤，以除去病毒制备物中的细胞碎片。C.中和无血清对照组将稀释后的痘苗病毒vTT制备物与病毒稀释液等体积混匀后放置于4'C过夜，终体积30ml;vTT+特异性抗血清组将稀释后的vTT与稀释的特异性抗血清等体积混匀后放置于4'C过夜，终体积30ml;D.过滤无血清对照组和vTT+特异性抗血清组各取15ml用0.22pm滤膜过滤。其余样品不过滤，备用。E.接种细胞用无血清对照组和vTT+特异性抗血清组的过滤及未过滤样品分别接种CEF细胞(25T细胞培养瓶，细胞90%成片)，每种样品接种3瓶细胞，每瓶接种2ml。37"C培养，观察。F.结果培养72小时后，只有vTT+特异性抗血清组且过滤的样品没有出现细胞病变(图1)，vTT+特异性抗血清组未过滤的样品及经过滤的无血清对照组均出现细胞病变(图2A，图3A)。对各组中的病变细胞进行免疫荧光染色，方法如下a)倾去细胞培养物上清，用甲醇丙酮(1:1)混合溶液固定细胞2min，然后用PBS(0.01M,pH7.2~7.4)漂洗两次。b)加入一抗(一抗为兔源vTT抗血清，用含3。/。胎牛血清的PBS稀释一抗，稀释度为1:100)，在摇摆平台上于室温孵育1小时。然后，用PBS(0.01M,pH7.27.4)漂洗两次，每次2min。c)加入荧光标记的第二抗体(GoatF(ab，)2FragmentAnti-rabbitIgG(H+L)-TRITC，BD公司，Cat:54546.1,l:200稀释)，在摇摆平台上室温孵育30-45min。d)PBS漂洗两次，每次2min。荧光显微镜下对细胞进行观察。观察结果显示，病变部位均有特异性免疫荧光(图2B,图3B)，证实病变是由痘苗病毒感染所致。该实验结果证明，痘苗病毒vTT可以通过0.22mjti滤膜，而与特异性抗血清结合后不能通过0.22拜的滤膜。本实验证实通过利用孔径为约0.22pm的滤膜进行过滤可以去除不能被特异性抗血清中和的痘苗病毒，从而使得可以在细胞上进行痘苗病毒制备物的外源病毒污染物的检查。实施例3:重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗的外源因子检查(1)材料重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4(专利申请号200610007567.7):2.2X107PFU/ml。兔源vTT特异性抗血清血抑效价l:5120,56'C灭活30min(2)实验步骤A.将兔源vTT特异性抗血清用PBS(0.01M,pH7.27.4)进行50X稀释。B.将重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4用病毒稀释液稀释成4X105PFU/ml，经0.45nm的滤膜过滤，除去病毒液中的细胞碎片。C.中和将20ml经稀释的7A2-4与20ml经稀释的兔源vTT特异性抗血清混匀后放置于4'C过夜，进行中和反应。D.过滤将中和后的病毒/血清混合悬液用0.22pm滤膜过滤。E.接种细胞用滤液接种CEF细胞、Vero细胞和Hela细胞，每种细胞各接种6瓶，每瓶接种2ml。置37'C培养14天。F.同时设立3种细胞对照，每种细胞2瓶不接种任何滤液。置37'C培养14天。G.血球吸附外源因子检查按2000年版《中国生物制品规程》通则中"生物制品病毒外源因子检查规程"进行。在培养的6~8天和14天，接种滤液的3种细胞各取2瓶，3种细胞对照各取1瓶进行血球吸附实验，结果显示接种滤液的细胞和对照细胞均未见血吸点。非血球吸附外源因子检查按2000年版《中国生物制品规程》通则"生物制品病毒外源因子检测规程"进行。结果显示，培养14天后，3种被接种的细胞均未见细胞病变。以上检查结果显示，重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4不存在外源病毒污染。权利要求1.一种检查痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法，该方法包括以下步骤a)将待检痘病毒或其重组病毒制备物用对应的痘病毒特异性抗血清进行中和；b)将中和后的病毒悬液经滤膜过滤；和c)将滤液接种细胞，其中所接种的细胞产生细胞病变或血球吸附现象表明所述痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染。2.权利要求1的方法，进一步包括在步骤a)之前用滤膜对待检痘病毒或其重组病毒制备物进行过滤以除去制备物中的细胞碎片的步骤。3.权利要求2的方法，其中用以除去制备物中的细胞碎片的步骤中所使用的滤膜的孔径大于0.22pm。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤b)中所用滤膜的孔径为约0.22nm。5.权利要求4的方法，其中所述痘病毒是痘苗病毒。全文摘要本发明涉及检查痘病毒或其重组病毒、特别是痘苗病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法。所述方法包括以下步骤将待检痘病毒或其重组病毒制备物用对应的痘病毒特异性抗血清进行中和；经合适孔径的滤膜对中和后的病毒悬液进行过滤；和将滤液接种细胞，其中所接种的细胞产生细胞病变或血球吸附现象表明所述待检痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染。文档编号G01N33/48GK101387635SQ200710148950公开日2009年3月18日申请日期2007年9月12日优先权日2007年9月12日发明者颖刘,段丹丽,邵一鸣申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心