专利名称：快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测赤潮毒素的检测器具，特别是涉及一种腹泻性贝 毒(Diarrhetic shellfish poisoning, DSP)的快速检测试纸条，另外还涉及其制法。
背景技术：
赤潮灾害日益严重，已成为一种全球性的海洋生态灾害。腹泻性 贝毒是由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属产生的一类脂溶性多环醚类天然化合物，主要成分是软海绵酸(Okadaicacid， OA)及其衍生 物，经过双壳贝类等率食性动物的食物链传递，能引起人类食用者发 生中毒，产生腹泻、恶心、呕吐及肠胃绞痛等，OA是强烈的蛋白磷 酸酶抑制剂，是一种很强的促癌剂，是目前极受关注的海洋生物毒素。 腹泻性贝毒的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色谱法以及一些 免疫化学方法。其中小鼠法简便易行，适合于大规模、批量样品的检 测，该法的缺点是不能区别毒素的种类和结构、干扰大、不精确；现 在被广泛接受且较为完善的高效液相色谱分析方法在许多国家使用， 可以准确分析确定毒素的含量和种类，检测限可低至ng/g，缺点是 样品前处理繁琐费时，仪器昂贵，对操作人员的技术要求较高，严重 的阻碍了这种分析方法的普及推广，更无法实现现场检测。免疫化学 方法是利用抗体对抗原的特异性结合建立的分析方法，具有灵敏度 高，特异性强，仪器设备简单易操作、样品前处理相对简单等优点， 适用于一定条件下的现场监测和大量样本快速筛查；目前德国、日本等公司生产的ELISA检测DSP的试剂盒，是以竞争性酶联免疫反应为 检测原理，检测全过程需2-4小时，可一次检测多个样品，即可定性 又可定量，但存在假阳性问题；由于ELISA是一种很敏感的技术，分 析结果的变异性较大，不同分析人员的结果有差异，结果判断往往需 要有经验的操作人员，容易发生误检和漏检，同时腹泻性贝毒组分化 学结构较多，各异构体之间也存在一定的抗原性差异，且检测时间也 比较长，实现真正的野外现场操作有困难。近年来，我国每年均有在贝中检测出腹泻性贝毒的报道，虽然其急性中毒未发生有死亡的案例，但其肿瘤促进剂的慢性效应不容忽 视，已引起了全世界的关注。建立腹泻性贝毒的快速灵敏准确的检测 方法和产品，对确保海产品食用安全具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述腹泻性贝毒检测技术的不足，提供一种 特异、敏感和简便的快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条；用胶 体金标记抗体，通过竞争免疫反应，快速检测贝类中的软海绵酸；简 单易操作，快速，不需任何其他仪器设备，非专业人员可现场使用， 产品性能稳定。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是 一种快速检测腹泻 性贝毒的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、 吸水垫和PVC背衬；其具体结构是在PVC背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫上包被有胶体金标 记的抗软海绵酸单克隆抗体，赛多利斯NC膜上分别包被有软海绵酸与卵清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠多抗构成的质控线。 所述抗软海绵酸单克隆抗体为用软海绵酸一血蓝蛋白偶联物免疫B a 1 b / c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗软海绵酸单克隆抗体 的杂交瘤细胞系分泌的。
所述样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背 衬上并装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。所述试纸条为检测腹泻性贝毒主要成分软海绵酸的试纸条。 所述快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条的制法，其步骤包括1、 将软海绵酸与载体蛋白偶联，制备得到软海绵酸一载体蛋白偶联物；2、 用软海绵酸一血蓝蛋白偶联物免疫B a 1 b / c小鼠，经细胞融 合，筛选得到分泌抗软海绵酸单克隆抗体的杂交瘤细胞系；3、 制备抗软海绵酸单克隆抗体；4、 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5、 将步骤3制得的抗软海绵酸单克隆抗体加入步骤4制备得到的胶 体金中，得到抗软海绵酸单克隆抗体一胶体金标记物；6、 将抗软海绵酸单克隆抗体一胶体金标记物喷点(包被)在胶金垫 上；7、 将软海绵酸一卵清蛋白偶联物喷点(包被)在NC膜上构成检测线， 并将羊抗鼠多抗喷点(包被)在NC膜上构成质控线。8、 将样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC背衬上， 并包装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区，得到检测软海绵酸 的免疫胶体金试纸条。所述快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条在检测软海绵酸 中的应用。本发明借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用以制备快速检测 腹泻性贝毒主要成分软海绵酸的免疫胶体金试纸条，结构更加合理， 应用胶体金标记抗软海绵酸单克隆抗体，选用软海绵酸一载体蛋白偶 联物作为检测线，建立竞争免疫层析快速检测待测样品中是否含有腹
泻性贝毒软海绵酸。通过待检样品中的软海绵酸与包被于NC膜上的 软海绵酸一载体蛋白偶联物共同竞争抗软海绵酸单克隆抗体一胶体 金标记物，在检测线处出现深浅不同的红色条带或不出现条带，质控 线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线无色，同时质控线上出 现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中软海绵酸的浓度高于12.5ng/mL;若待测样品试纸条检测线有红色出现，同时质控线上出 现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中软海绵酸的浓度小于12.5ng/mL;如果质控线上没有出现红色条带，则该试纸条失效。 与现有技术相比，本发明具有以下突出优点1 、本发明的检测软海绵酸的免疫胶体金试纸条，具有特异性强， 检测灵敏度高(可达12.5ng/mL)，检测快速(只需15min)，前处理 简单等优点。2 、本发明的试纸条不需任何仪器设备，携带方便，检测成本低。3、 本发明的试纸条操作简单易掌握，无需专业人员操作。4、 本发明的试纸条储存方便，稳定性好，在室温下至少可保存 六个月。5、 本发明的试纸条检测结果准确性高，精度高。
图1为本发明检测试纸条结构示意中l为样品垫，2为胶金垫，3为赛多利斯NC膜，4为吸水垫， 5为PVC背衬，6为检测线，7为质控线，8为试纸条卡，9为加样 孔，IO为显色区图2为本发明的检测试纸条结果判定示意中A为阴性标准品结果，B为阴性样品结果，CD为阳性样品结 果，E F为试纸条失效具体实施方式
实施例l (制备实施例)检测腹泻性贝毒软海绵酸的免疫胶体金试纸条制备方法1、 软海绵酸一载体蛋白偶联物的制备将软海绵酸(0A)溶于lmL的二甲基亚砜中，加入水溶性碳化二亚胺 (EDC) 、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) ，25。C反应1.5小时后，加入溶于 磷酸盐缓冲液(pH7.0)的血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)， 25°C 反应3小时。将反应混合物移入透析卡中透析3d， 4'C，每12h换液l 次。透析物分装后，-2(TC保存。制备得到OA — KLH和OA — 0 VA偶联物备用。2、 抗软海绵酸单克隆抗体的制备 利用制备的软海绵酸一血蓝蛋白偶联物(0 A — K L H )作为免疫原，免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200uL OA-KLH 与等体积完全弗氏佐剂，充分乳化后，腹腔注射小鼠，第2、 4、 6、 8、 10、 12周取同量OA-KLH与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化，腹 腔注射。取尾血测定小鼠血清效价，待效价大于要求值后，用同量 OA-KLH的PBS溶液腹腔注射进行加强免疫，三天后取脾细胞融合。取生长状态良好的骨髓瘤SP2/0细胞与免疫的小鼠脾细胞按1:10 的比例混合，加入PEG进行细胞融合。融合后接种于96孔细胞培养 板中，在15X血清的HAT培养基中选择培养，5天后换HT培养液， 取细胞培养液上清ELISA检测。选取阳性细胞孔，用有限稀释法克隆， 筛选可稳定分泌抗软海绵酸(OA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8 周龄健康BALB/c雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0. 5mL/ 每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮 于生理盐水中，浓度为10VmL。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射0. 5mL 杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心10min，收集上 清液即为含单克隆抗体腹水。
腹水用辛酸硫酸氨方法得到粗制抗体蛋白，再用0.01M的PBS 缓冲液(pH7.4)透析4-5天。取出用紫外分光光度计测得蛋白浓度 为1.78mg/mL。3 、抗软海绵酸单克隆抗体一胶体金标记物的制备及包被胶金垫 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；取40nm的胶体金于 干净的烧杯中，用1M的NaOH调节其pH值为8.2，加入抗软海绵 酸单克隆抗体，使其在胶体金中终浓度为2ug/ml，搅拌lh，加入胶 体金1/10体积的10%BSA溶液，搅拌30min， 5000rpm离心30min， 取沉淀，用0.01M的PBS缓冲液复溶，约加入4ml缓冲液，用紫外 分光光度计扫描胶体金特征吸收峰，确定胶体金OD值后用0.01M的 PBS缓冲液稀释OD值为5，用XYZ-3000喷点仪包被到经预处理的 胶金垫上，包被量为3uL/cm。真空干燥备用。 4、偶联抗原包被NC膜软海绵酸-卵清蛋白偶联抗原用0.01M的PBS缓冲液稀释8倍， 用XYZ-3000喷点仪包被到经预处理的NC膜上，包被量为 0.74ul/cm。 37'C干燥1小时备用。并将羊抗鼠多抗包被在NC膜上 构成质控线。 5、试纸条的组装将处理好的样本垫、包被有抗软海绵酸单克隆抗体-胶体金标 记物的胶金垫、包被有软海绵酸-卵清蛋白偶联抗原作为检测线和包 被有羊抗鼠多抗作为质控线的NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC 背衬上，安装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。阳性 12.5ng/mL完全抑制，无条带出现；加样量为80pL/孔；判断时间 为15min;最低检测限为12.5ng/mL。真空封装，常温保存，有效 期至少6个月。 实施例2(应用实施例) 检测软海绵酸的免疫胶体金试纸条使用方法 1、贝类等样品的预处理将贝类样品洗去泥沙，刨开，去壳，取全部肌肉组织，匀浆绞碎。称取lg匀浆样，加入4mL80。/。的甲醇-水溶液，搅拌萃取5min，离心,弃去组织残渣，上清液待分析用。上述的贝类甲醇萃取液用0.01MPBS稀释4倍，用微量移液枪取80pL 于加样孔中，放置15min观察显色情况。同时分别取80pL 0.01M PBS 和80pL 12.5ng/mL的软海绵酸标准溶液于另两个试纸条的加样孔中， 做阴性空白和阳性标准品对照实验。 3、结果判定如图2所示，若待测样品试纸条检测线颜色比阴性空白试纸条检测线 颜色浅，同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中 软海绵酸的浓度小于12.5ng/mL;若待测样品试纸条检测线无颜色， 同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中软海绵酸 的浓度大于或等于12.5ng/mL;若待测样品试纸条检测线颜色与阴性 空白试纸条检测线颜色一致，同时质控线上出现红色条带，则判断为 阴性样品，即样品中不含软海绵酸；若质控线上无颜色，则该试纸条 失效。实施例3 (应用实施例) 检测软海绵酸的免疫胶体金试纸条的应用 1、特异性实验将腹泻性贝毒的五种组分软海绵酸(Okadaic acid,OA)、扇贝毒素 (pectenotoxin-2，PTX-2 )、虾夷扇贝毒素(Yessotoxin，YTX )、 13-Desmethyl spirolide C(decMeC，SPXl)和Gymnodimine(GYM)配置 成0 . 1 nM (约等于8 0 n g / m L )的样品，将记忆缺失性贝毒的
主要成分软骨藻酸(Domoic acid, DA)配成1 280ng/mL的 样品，将河豚鱼毒素(Tetrodotoxin, TTX)配成8 0 0ng/mL的 样品。按照实施例2所述方法进行实验。实验结果表明，软海绵酸(Okadaic acid,OA)样品检测线无颜色出现，同时质控线出现红色 条带；而腹泻性贝毒的其它四种组分扇贝毒素(pectenotoxin-2,PTX-2 )、虫下夷扇贝毒素(Yessotoxin,YTX )、 13醒Desmethyl spirolide C(decMeC，SPXl)和Gymnodimine(GYM)以及 记忆缺失性贝毒的主要成分软骨藻酸(Domoicacid， DA)和河豚鱼毒 素(Tetrodotoxin， TTX)的样品检测线与阴性空白检测线颜色一致， 同时质控线出现红色条带，这表明腹泻性贝毒的其它四种组分扇贝毒 素(pectenotoxin-2,PTX-2 )、虫下夷扇贝毒素(Yessotoxin，YTX )、 13-Desmethyl spirolide C(decMeC,SPXl)和Gymnodimine(GYM)以及 记忆缺失性贝毒的主要成分软骨藻酸(Domoicacid， DA)和河豚鱼毒 素(Tetrodotoxin, TTX)与本发明试纸条无交叉反应。显示本发明试 纸条有良好的特异性。 2、样品中的软海绵酸模拟检测实验分别向贝肉中添加软海绵酸标准品，按实施例2制成0 n g /m L、 12.5ng/mL和20.0ng /mL的样品待测液，并按实 施例2所述方法，用本发明试纸条对Ong/mL、 12.5ng/ mL和2 0.0 n g /mL的样品检测，重复实验6次，结果显示0 n g /mL样品的试纸条检测线与阴性空白检测线颜色一致，同时质 控线出现红色条带，判断为阴性样品；而1 2 . 5 n g / mL和2 0 . 0 n g /mL的样品的试纸条检测线无颜色，同时质控线出现红色条 带，判断为阳性样品。说明本发明试纸条可以用来检测贝类样品。
权利要求
1、快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水纸和PVC背衬，其特征是在PVC背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫为包被抗软海绵酸单克隆抗体-胶体金标记物的胶金垫，赛多利斯NC膜上分别包被软海绵酸-卵清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠多抗构成的质控线。
2、 根据权利要求1所述的快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试 纸条，其特征是软海绵酸单克隆抗体为用软海绵酸一血蓝蛋白偶联 物免疫B a 1 b / c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗软海绵酸单克隆 抗体的杂交瘤细胞系分泌的。
3、 根据权利要求1或2所述的快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体 金试纸条，其特征是样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次 粘附在PVC背衬上并装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区。
4、 根据权利要求1或2所述的快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体 金试纸条，其特征是其为检测腹泻性贝毒主要成分软海绵酸的试纸 条。
5、 快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步 骤包括(1) 将软海绵酸与载体蛋白偶联，制备得到软海绵酸一载体蛋白偶联物；(2) 用软海绵酸一血蓝蛋白偶联物免疫B a 1 b / c小鼠，经 细胞融合，筛选得到分泌抗软海绵酸单克隆抗体的杂交瘤 细胞系；(3) 制备抗软海绵酸单克隆抗体； (4) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(5) 将步骤(3 )制得的抗软海绵酸单克隆抗体加入步骤(4 ) 制备得到的胶体金中，得到抗软海绵酸单克隆抗体一胶体 金标记物；(6) 将抗软海绵酸单克隆抗体一胶体金标记物喷点在胶金垫上；(7) 将软海绵酸一卵清蛋白偶联物喷点在NC膜上构成检测线， 并将羊抗鼠多抗喷点在NC膜上构成质控线；(8) 将样本垫、胶金垫、NC膜、吸水垫按顺序依次粘附在PVC 背衬上，并包装在试纸条卡里，上面开有加样孔和显色区，得到所述 的检测软海绵酸的免疫胶体金试纸条。
6、快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条在检测软海绵酸中 的应用。
全文摘要
本发明涉及检测赤潮毒素的检测器具。一种快速检测腹泻性贝毒的免疫胶体金试纸条，包括样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫和PVC背衬；其具体结构是在PVC背衬上按顺序依次粘附有样本垫、胶金垫、赛多利斯NC膜、吸水垫，胶金垫上包被有胶体金标记的抗软海绵酸单克隆抗体，赛多利斯NC膜上分别包被有软海绵酸与卵清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠多抗构成的质控线。本发明试纸条具有特异性强，检测灵敏度高，检测快速，前处理简单等优点，不需任何仪器设备，携带方便，检测成本低，操作简单易掌握，无需专业人员操作；试纸条储存方便，稳定性好，在室温下至少可保存六个月；检测结果准确性高，精度高。
文档编号G01N33/558GK101131390SQ200710157470
公开日2008年2月27日 申请日期2007年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者刘仁沿, 刘永健, 梁玉波, 许道艳 申请人:国家海洋环境监测中心