专利名称：一种色谱峰匹配的分析方法
技术领域：
本发明属于色谱峰的分析方法，特别中药色谱指纹图谱峰匹配的分析方法， 尤其属于用计算机程序通过以目标色谱峰对另一指纹图谱的渐进窗口正交投影 分析来实现不同指纹图谱间色谱峰的匹配的分析方法。
技术背景色谱图谱特别是中药指纹图谱就其本质而言，应可视为中药的一种依赖于 不同提取方法所得的活性化学组分的相对浓度谱。由于中药色谱指纹图谱所含 化学组分较多，且很多化学组分还缺乏相应的标准对照品，难于采用传统的分 析方法来精确描述。如果色谱实验条件控制得好，同一中药样本的色谱指纹图 谱的重复性应是相对稳定的。但是由于实验的时间、地点以及一些不可控实验 因素的差异，往往也会在一定程度上导致色谱保留时间的偏移，给中药色谱指 纹图谱的识别与鉴定带来不便，如不作必要的仪器系统误差的校准，还可能导 致错误的结论。尽管在色谱指纹图谱建立过程中，是以最大信息量为目标尽量 保证峰与峰的分离，但每一色谱图谱中所含的化学成分较复杂，色谱峰间有时 不可避免的发生重叠、缺失或漂移，依据保留时间或相对保留时间无法进行不 同图谱间的色谱峰匹配。另外，中药色谱指纹图谱成为我国对中药注射液进行 质量控制的手段，各地药品检验所对在中药注射液进行复核时，尽管可完全按 标准规定的分析实验条件进行检测，但是，不可能使用同一台仪器、同一色谱 柱，从而将导致所得的中药色谱图谱发生一定的波动和色谱保留时间的偏移， 这将给中药色谱指纹图谱的识别与鉴定带来困难。目前对中药色谱指纹图谱组分保留时间漂移进行校准主要采用局部最小二乘校正法(李博岩，梁逸曾，胡芸,等.分析化学,2004,32(3): 313-316.)等。现有方 法没能充分利用联用色谱仪器在色谱分离过程中所记录的各流出组分的波谱信 息，不易进行程序化处理并使之与HPLC仪相匹配。 发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种联用色谱中的组分光谱信息，通 过设有程序的数字计算机来准确地进行不同指纹图谱间色谱峰的匹配分析。本发明解决一技术问题的技术方案为 一种色谱峰匹配的分析方法，包括含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行检测，存储程序的数字计算机，该存 储程序的数字计算机执行如下步骤a)在图谱2中提取待匹配的色谱峰，扣除色 谱峰中的噪音信号，将扣除噪音信号的待匹配的色谱峰进行奇异值分解形成抽 象光谱2，提取抽象光谱2中的第一列，以此形成矩阵A;b) 在待鉴图谱l中寻找与图谱2中待匹配的色谱峰相匹配的目标色谱峰， 设置移动窗口 w ，在待鉴图谱l中自第1点起移动窗口，同时对待鉴图谱l 进行奇异值分解，并将抽象光谱中的第1至窗口尺寸w的列数提取出来，以其构造正交投影阵M;c) 将矩阵A对M进行投影运算，得投影后的残余光谱；d) 计算待识别色谱峰A与残余光谱的夹角，判断夹角余弦是否小于噪音信号， 若夹角余弦小于噪音信号，则说明在待鉴图谱1中在夹角余弦小于噪音信号的 时间段内的色谱峰的主成分与图谱2中的待匹配的色谱峰为相同的物质，此峰 相匹配，否则，待鉴图谱1中没有与图谱2中待匹配的色谱峰相匹配的色谱峰。所述的W为大于等于1的整数。 所述的噪音信号的值为0.05。 本发明用于决明子色谱指纹图谱峰的匹配分析。本发明用于莪术油色谱指纹图谱峰的匹配的分析。本发明的原理为设X为采用联用色谱测得的样本2的中药色谱指纹图谱的N XM阶二维数据矩阵，它们的行方向表征了色谱的流出信息(M个流出时间点)，列方向表征了光谱信息(N个吸收波长)；设Y为采用联用色谱测得的 样本S l的色谱指纹图谱的iV'xM'阶二维数据矩阵，它们的行方向表征了色谱的流出信息(M'个流出时间点)，列方向表征了光谱信息(iv'个吸收波长)。首先确定样本2中待匹配的基准色谱峰a扃=X ( [ t！ : t2 ]， ) (1) t,、 t2为基准色谱峰的起止时间。再将&1进行奇异值分解，并将抽象光谱中的第一列即主成分提取出来[Si， vb di ] = svd (ai ) (2) A=山(，1 ) (3) 再对样本1进行处理，寻找与样本2中基准色谱峰相匹配的目标色谱峰。 设置移动窗口 w ,在Y中自第1点起移动至n2 -w +1止(n2为Y的列数)， 同时对Y进行奇异值分解，并将抽象光谱中的第1至窗口尺寸w的列数提取 出来，以其构造正交投影阵。[s2， v2， d2 ] = svd ( Y ( i : i + w - 1， ) ) (4) M = I — d2 d2+ (5) 其中，I为单位矩阵，d2+为d2的广义逆阵。用矩阵M对A进行投影运算 a* = M A (6) a*表示A投影后的残余光谱。为消除不等性噪声的影响，令投影后所得 的残余光谱a^与投影前的原始光谱A的夹角余弦为rj ，即并以rj作为鉴别色谱峰峰匹配的判据。由于M扣除了 A与d2相关的光谱信息，a*保留了 A与d2不相关的光 谱信息；所以，r」值越小，即经投影所得的残余光谱a*与投影前的原始光谱A 的夹角越大，说明3*保留A的光谱信息越少，A与d2相关性越大；反之巧值 越大，说明a*保留A的光谱信息越多，A与d2的光谱相关性越小。当巧值 等于0时，a*与A完全正交，M完全扣除了A与d2相关的光谱信息，a*完 全只剩下随机噪声。以样本2中待匹配的色谱峰的抽象光谱矩阵A对投影矩阵M进行投影，可 得光谱残差夹角余弦曲线。随着窗口的移动，若该曲线的r」值为零或接近于零， 则说明样本1中此段时间内的色谱峰的主成分与样本2中的目标色谱峰为相 同的物质，此峰相匹配，否则，样本1中没有与样本2中目标色谱峰相匹配 的色谱峰。指纹图谱通常情况下都是进行主成分间的峰匹配，当采用本发明的分析法 对不同指纹图谱间的色谱峰进行匹配时，通过窗口的设置可将抽象光谱中的第1 至窗口尺寸w的列数提取出来，依次进行峰匹配。如某一色谱峰为由三种物质 组成的混合峰，如设窗口为l，则进行的是主成分间的峰匹配；窗口设为2，则 进行的是次成分间的峰匹配；窗口设为3，则进行的是第三种成分间的峰匹配。本发明与现有技术相比，克服了仅单凭单波长数据进行色谱峰匹配的盲目 性；无需验证峰纯度，光谱识别率较好，可有效区分同系物等具有近似光谱及 末端吸收的成分色谱峰；可处理不复杂的重叠色谱峰问题，既能够快速处理数 据，还能防止数据的漏选。
图1为本发明的计算机流程图。图2为决明子空白溶液的Agilent 1100高效液相色谱仪色谱柱1的HPLC指 纹图谱。图3为标准品溶液的Agilent 1100高效液相色谱仪色谱柱1的HPLC指纹图谱。图4为大决明子生品的Agilent 1100高效液相色谱仪色谱柱1的HPLC指纹图谱。图5为小决明子生品的HP1100高效液相色谱仪色谱柱2的HPLC指纹图谱。 图6为大黄酚标准品与大决明子指纹图谱全部二维数据正交投影前后光谱 矢量夹角余弦图。图7为大黄素标准品与大决明子指纹图谱全部二维数据正交投影前后光谱 矢量夹角余弦图。图8为大决明子的405号峰与小决明子指纹图谱全部二维数据正交投影前 后光谱矢量夹角余弦图。图9为大决明子的415号峰与小决明子指纹图谱全部二维数据正交投影前 后光谱矢量夹角余弦图。图IO为吉马酮标准品的HPLC图谱。图11为蓬莪术挥发油的HPLC指纹图谱。图12为广西莪术挥发油的HPLC指纹图谱。图13为温郁金挥发油的HPLC指纹图谱。图14为吉马酮标准品与温郁金挥发油指纹图谱全部二维数据正交投影前后光谱矢量夹角余弦图。图15为广西莪术的10号峰与蓬莪术指纹图谱全部二维数据正交投影前后光谱矢量夹角余弦图。图16为温郁金的C6号峰与广西莪术指纹图谱全部二维数据正交投影前后 光谱矢量夹角余弦图。图17为蓬莪术的A6号峰与温郁金指纹图谱全部二维数据正交投影前后光谱 矢量夹角余弦图在图3中，31为芦荟大黄素，32为大黄酸，33为大黄素，34为大黄酚，35为 大黄素甲醚；在图4中，401—418为大决明子生品中待匹配的色谱峰；在图5中， l一26为小决明子生品中待匹配的色谱峰；在图11中，A1—A12为蓬莪术挥发油 的色谱吸收峰；在图12中，Bl-B13为广西莪术挥发油的色谱吸收峰；在图13中， Cl-C9为温郁金挥发油的色谱吸收峰；具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。由图1所示，本发明所述的色谱峰匹配的分析方法，包括含DAD检测器的高 效液相色谱仪对物质进行检测，形成了图谱的全部信息，利用MATLAB语言进 行处理，得到图谱的全部信息，所述的信息包括相应峰的峰面积，峰高、保留 时间，将图谱的全部信息输入到存储程序的数字计算机，该存储程序的数字计算机执行如下步骤步骤201—207为在图谱2中提取待匹配的色谱峰，扣除待匹配色谱峰中的 噪音信号，将扣除噪音信号的待匹配色谱峰进行奇异值分解形成抽象光谱2，提 取抽象光谱2中的第一列，以此形成矩阵A;步骤101 —102为选取欲与图谱2中提取的待匹配色谱峰进行峰匹配的图 谱，作为图谱l，扣除图谱l中的噪音信号，避免不同仪器或者同一仪器在不同 时间所产生的漂移对检测结果的影响，常用的噪音信号为0.05。步骤103 — 107为在扣除噪音信号的图谱l中设置标准窗口，标准窗口的大小为W，在Y中自第1点起移动至n2 —w+l止(n2为Y的列数)，同时对Y进 行奇异值分解，形成抽象光谱l，并将抽象光谱l中的第1至窗口尺寸w的列 数提取出来，以其构造正交投影阵。步骤108 — 109为将矩阵A对标准图谱中的正交投影矩阵进行投影，扣除所 取窗口处的光谱数据，得残余光谱，计算待识别色谱峰与残余光谱的夹角。步骤110为判断夹角余弦是否小于噪音信号，若夹角余弦小于噪音信号， 则为步骤lll，说明在待测图谱1中在夹角余弦小于噪音信号的时间段内的色 谱峰的主成分与图谱2中的待匹配色谱峰为相同的物质，此峰相匹配；若夹角 余弦大于噪音信号，则为步骤U2，待测图谱1中没有与图谱2中待匹配色谱 峰相匹配的色谱峰。将本发明用于决明子色谱指纹图谱峰的匹配分析。1.仪器与试药1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(包括AgilentllOO四元泵，Agilent 1100 二极管 阵列检测器，Agilent 1100色谱化学工作站)；HP1100高效液相色谱仪(包括 AgilentllOO四元泵，HP1100 二极管阵列检测器，HP色谱化学工作站)。1.2样品与试剂大决明子药材，产地为河北，小决明子药材，产地为安徽，经佳木斯大学 生药学教研室刘娟教授鉴定分别为豆科植物决明(Ca肌'"L.)和小 决明(C似W"tomL.)的成熟种子；芦荟大黄素对照品(批号766-200210)、大 黄素对照品(批号756-200110)、大黄酸对照品(批号774-200311)、大黄酚对 照品(批号796-200204)、大黄素甲醚对照品(批号758-2004080)均购自中国药 品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯，盐酸、磷酸及氯仿为分析纯。2.方法与结果 2.1供试品制备2丄1对照品溶液称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素 甲醚对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成200 ng'mL"的芦荟大黄素、大黄酸、 大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的混合对照品溶液。2丄2供试品溶液取决明子样品，粉碎，过80目筛，称取2.0g，力n 1.5 moH/1的盐酸溶液30 mL，加热回流1.5h，放冷，加氯仿25 mL，回流20min, 取出，分取氯仿层，酸水层再加氯仿25 mL，回流20min，分取氯仿层，同上 法操作，加氯仿再回流提取二次，合并四次氯仿提取液，加水20mL振摇洗脱， 弃去水层，将氯仿液蒸干，残渣加甲醇15mL使溶解，过滤，定量转移至25mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45pm微孔滤膜过滤，即得。2.2色谱条件色谱柱l: Zorbax Eclipse XDB - C18(4.6 mm x 250 mm ， 5 pm )，保护柱 Zorbax SB - <:18柱(4,6 mm x 12.5 mm ， 5 );色谱柱2: Hypersil ODS (4,0 mm x 250 mm ， 5 ,)，保护柱Scienhome (28柱(3.0 mm x 20 mm ， 5 jam );流动 相乙腈(A ) -0.1%磷酸水溶液(B)作梯度洗脱，Omin， 10%A-90% B; 5 min， 15 % A - 85 % B; 10 min， 40 % A - 60 % B; 40 min， 70 % A - 30 % B; 41min后100。/。A。流速l.OmL'min";柱温室温；检测波长278 nm， 参比波长550 nm;光谱数据记录范围220 500 nm，波长间隔2nm;色谱记录 时间0 50min;进样量IO jaL。2.3色谱图的确定2.3.1特征峰选定按3.1.2供试品溶液的制备方法做空白试验，结果见图 2。检出峰中峰面积最大值及峰高最大值分别在200A及5毫吸收度以下，因此10选取AreaRejec＝200， Height Reject=5对所有供试品进行积分，选取有积分值的 峰作为决明子的特征峰。2.3.2取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品混合溶 液于Agilent 1100高效液相色谱仪、色谱柱1上按选定色谱条件同法测定，结 果见图3。2.3.3另取大决明子、小决明子供试品溶液分别于Agilent 1100高效液相色 谱仪、色谱柱1及HP 1100高效液相色谱仪、色谱柱2上按选定色谱条件测定， 记录其色谱图，按规定方法积分，结果见图4 图5。2.4色谱峰的匹配对不同条件下的标准品溶液、大、小决明子供试品溶液的色谱指纹图谱间 的峰进行匹配分析。如大黄酚标准品与大决明子指纹图谱间的峰匹配，见图6; 大黄素标准品与大决明子指纹图谱间的峰匹配，见图7;大决明子的5号峰与小决明子指纹图谱间的峰匹配，见图8;大决明子的15号峰与小决明子指纹图谱间的峰匹配，见图9。由图6可知，大黄酚标准品的色谱峰与大决明子指纹图谱中时间点在 40.3955 40.0488的色谱峰即第415号色谱峰相匹配；由图7可知，在大决明子 的色谱指纹图谱中没有与大黄素标准品色谱峰相匹配的色谱峰；由图8可知， 大决明子的第405号色谱峰与小决明子指纹图谱中时间点在14.9471 14.9956 的色谱峰即第7号色谱峰相匹配；由图9可知，大决明子的第415号色谱峰与 小决明子指纹图谱中时间点在40.9990 41.3033的色谱峰即第22号色谱峰相匹 配。同理可知，大决明子的401、 402、 403、 404、 405、 406、 407、 408、 409、 410、 411、 412、 413、 414、 415、 416、 417、 418号峰分别与小决明子的1、 2、3、 4、 7、 9、 10、 13、 14、 15、 17、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26号峰相匹配; 大决明子的412、 415、 416号峰，小决明子的19、 22、 23号峰分别为大黄素、 大黄酚和大黄素甲醚。本发明用于莪术油色谱指纹图谱峰的匹配的分析。3.实验部分3.1仪器与试剂Agilent 1100高效液相色谱仪(包括Agilent 1100四元泵，Agilent 1100 二极 管阵列检测器，Agilent 1100色谱化学工作站)。蓬莪术、广西莪术和温郁金购于 北京兴中中药饮片厂，产地浙江，经佳木斯大学生药教研室史权教授鉴定，符 合中国药典(2005版) 一部项下的规定。吉马酮对照品(批号111665-200401)购 自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，无水硫酸钠、磷酸为分析纯。3.2供试品制备3.2.1挥发油制备取经粉碎过30目筛的蓬莪术、广西莪术、温郁金粗粉 各100g，分别置于2000mL圆底烧瓶中，加8倍量的水浸泡过夜，按中国药典 (2005版) 一部附录X D中挥发油测定的甲法，水蒸气蒸馏提取8h。分别收 集挥发油部分，加入无水硫酸钠脱水后，密封、暗处冷藏。3.2.2供试液制备取蓬莪术、广西莪术、温郁金挥发油各20iiL，分别置 10mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀。经0.45pm微孔滤膜过滤，制成蓬莪术、 广西莪术、温郁金挥发油的供试液。取吉马酮对照品约10 mg，精密称定，置 100mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，经0.45 pm微孔滤膜过滤，吸取滤 液lmL置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，配制吉马酮对照品溶液。3.3色谱条件色谱柱Zorbax Eclipse XDB - C18(4.6mmx250mm， 5jim)，保护柱ZorbaxSB-ds柱(4.6mmxl2.5mm， 5pm);流动相甲醇(A) -0,2%磷酸水溶液(B) 作梯度洗脱，0min， 55%A-45%B; 5 min， 55%A-45%B; 25 min， 75% A-25%B; 40min， 75%A-25%B; 50min, 100 %A。流速l.Oml.min—、 柱温室温；检测波长210nm;光谱数据记录范围190 350 nm，波长间隔2 nm;色谱记录时间0 50min;进样体积20 pL。取吉马酮对照品按选定色谱条件测定，结果见图IO。另取蓬莪术、广西莪 术、温郁金供试液分别按选定色谱条件同法测定，记录其色谱图，结果见图11 图13。4色谱峰的匹配对吉马酮标准品、蓬莪术、广西莪术、温郁金挥发油色谱指纹图谱间的峰 进行匹配分析。如吉马酮标准品与温郁金挥发油指纹图谱间的峰匹配，见图14; 广西莪术的IO号峰与蓬莪术指纹图谱间的峰匹配，见图15;温郁金的6号峰与 广西莪术指纹图谱间的峰匹配，见图16;蓬莪术的6号峰与温郁金指纹图谱间 的峰匹配。由图14可知，吉马酮标准品的色谱峰与温郁金挥发油指纹图谱中时间点在 28.1160 28.1360的色谱峰即第C6号色谱峰相匹配；由图15可知，在蓬莪术的 色谱指纹图谱中没有与广西莪术的B10号色谱峰相匹配的色谱峰；由图16可知， 温郁金的第C6号色谱峰与广西莪术指纹图谱中时间点在24.5048 24.5248的色 谱峰即第B9号色谱峰相匹配；由图17可知，在温郁金指纹图谱中没有与蓬莪 术的第A6号色谱峰相匹配的色谱峰。
权利要求
1、一种色谱峰匹配的分析方法，包括含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入到存储程序的数字计算机，其特征在于该存储程序的数字计算机执行如下步骤a)在图谱2中提取待匹配的色谱峰，扣除色谱峰中的噪音信号，将扣除噪音信号的待匹配的色谱峰进行奇异值分解形成抽象光谱2，提取抽象光谱2中的第一列，以此形成矩阵A；b)在待鉴图谱1中寻找与图谱2中待匹配的色谱峰相匹配的目标色谱峰，设置移动窗口w，在待鉴图谱1中自第1点起移动窗口，同时对待鉴图谱1进行奇异值分解，并将抽象光谱中的第1至窗口尺寸w的列数提取出来，以其构造正交投影阵M；c)将矩阵A对M进行投影运算，得投影后的残余光谱；d)计算待识别色谱峰A与残余光谱的夹角，判断夹角余弦是否小于噪音信号，若夹角余弦小于噪音信号，则说明在待鉴图谱1中在夹角余弦小于噪音信号的时间段内的色谱峰的主成分与图谱2中的待匹配的色谱峰为相同的物质，此峰相匹配，否则，待鉴图谱1中没有与图谱2中待匹配的色谱峰相匹配的色谱峰。
2、 根据权利要求l所述的一种色谱峰匹配的分析方法，其特征在于所述的W为大于等于1的整数。
3、 根据权利要求l所述的一种色谱峰匹配的分析方法，其特征在于所述的噪音信号的值为O. 05。
4、 权利要求l所述的一种色谱峰匹配的分析方法用于决明子色谱指纹图谱 峰的匹配分析。
5、 权利要求l所述的一种色谱峰匹配的分析方法用于莪术油色谱指纹图谱 峰的匹配的分析。
全文摘要
本发明公开一种色谱峰匹配的分析方法，包括含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入存储程序的数字计算机，计算机执行如下步骤选取待鉴别的色谱峰，将待鉴别色谱峰形成抽象光谱2，提取抽象光谱2中的第一列形成矩阵A；选取欲峰匹配的图谱1，设置窗口大小为W，移动窗口形成抽象光谱1，构造成正交投影矩阵；将矩阵A对正交投影矩阵进行投影，得残余光谱；判断残余光谱与原始光谱A的夹角余弦是否小于噪音信号，若小于噪音信号，此峰相匹配；否则不匹配。本发明与现有技术相比，无需验证峰纯度，光谱识别率较好，可有效区分同系物等具有近似光谱及末端吸收的成分色谱峰，既能够快速处理数据，还能防止数据的漏选。
文档编号G01N30/86GK101256176SQ200710190088
公开日2008年9月3日 申请日期2007年11月21日 优先权日2007年11月21日
发明者邹纯才, 鄢海燕 申请人:邹纯才