专利名称：镁(离子)诊断/测定试剂盒及镁(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电
极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。
镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法 法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自 动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、 邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2_ (8' -羟基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费 用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子 的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。
离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025) 液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)&2+最大干 扰10%等不足。
离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释 和过滤。Thie叩ont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35%，认为离子色谱法 可作为总镁测定有价值的参考方法。
Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg"
测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、
磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶 联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法； ⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准 确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵 敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原 型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁(离 子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁(离子)诊断/ 测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行镁(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切 实的推广应用。
本发明镁(离子)浓度测定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶/^^2+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸甘油激酶/^^2+甘油+腺苷三磷酸 甘油+辅酶甘油脱氢酶甘油酸+还原型辅酶 这种方法应用需要镁离子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1; EC2.7丄2)酶(偶)联甘油激酶(Glycerokinase; EC2.7丄30)(也需要镁离子激活)、 甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase; EC 1丄1.6; EC l丄1.72; EC 1丄1.156; EC Ll.99.22)酶促反应速率比色法。在镁离子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三 磷酸反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合甘油激酶、甘油脱氢酶的作用， 最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸 收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量 340nm处吸光度上升的速度，可以测算镁(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想
缓冲液100mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
己糖激酶10000U/L
甘油激酶12000U/L
甘油脱氢酶12000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
甘油-3-磷酸3 mmol/L
本发明的镁(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、 腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶。辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-
磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、己糖激酶。
辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定镁(离子)浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括:
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
己糖激酶10000U/L
甘油激酶12000U/L
甘油脱氢酶12000 U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
甘油-3-磷酸3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。实施例二
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
葡萄糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油-3-磷酸 3 mmol/L试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
己糖激酶 10000 U/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《
0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测镁(离子)样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2
分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的镁(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶
腺苷三磷酸
甘油-3-磷酸试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
甘油脱氢酶
3 mmol/L20 mmol/L3 mmol/L3 mmol/L
画mmol/L500 mmol/L12000 U/L12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
10000U/L
:试剂，可以直接使用,
己糖激酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体测定镁(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时
间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达6mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士 5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达O.l ± 0.04AA/mmol
/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的镁(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 <u>甘油激酶/Mg</u><u>2+</u> 甘油+腺苷三磷酸甘油+辅酶 <u>甘油脱氢酶</u> 甘油酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出镁(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种镁(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L己糖激酶1000———訓OO U/L甘油激酶1000———80000 U/L甘油脱氢酶1000-——80000 U/L葡萄糖1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L甘油-3-磷酸1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、己糖 激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶组成。辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢 酶、.葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不 限。
5. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺 苷三磷酸、甘油-3-磷酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、甘油 激酶、甘油脱氢酶组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、己糖激酶组成。辅酶、 己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在 试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述镁(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸、己糖激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出镁(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464384SQ20071019217
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司