专利名称：：一种食品中丽春红2r的检测方法
技术领域：
：本发明属于一种丽春红的检测方法。二
背景技术：
：丽春红2R是由煤焦油提炼出来的原料合成的偶氮染料，又名"酸性大红"，分子式为C,8HMN2Na207S2，曾被用作食品染色剂、药品和化妆品的染色，后来发现丽春红2R对人体和动物的肝脏有毒害作用，会导致肝退化性病变、肝硬化等毒性症状。国际上已全面禁止其用于食品染色。但丽春红2R染色效果好，牢度强，使食品富有新鲜感，能激起人们的食欲和购买欲。有报道一些食品生产者非法添加丽春红2R以改善食品色泽。目前尚无食品中丽春红2R的国标推荐检测方法，已报道的丽春红2R的检测方法有(1)点滴法将试液于白色滴定板上滴加浓盐酸、浓硫酸、100g/L的氢氧化钠溶液，12%氨水各两滴,使溶液混合均匀，观察颜色变化进行定性检测。该方法的缺点是受观测者的主观影响较大，且只能定性不能定量检测。(2)紫外光谱仪法根据丽春红2R的最大紫外吸收峰进行定性，将处理的样品测出紫外最大吸收峰处的吸光度，在标准曲线上査出相应的值进行定量。缺点是该方法是受分子结构类似色素的物质影响，不能准确定性定量检测。(3)红外光谱法利用丽春红2R的在2900-2980cnT'特征吸收峰进行对其定性。缺点是作为一种间接的分析技术，需要通过收集大量具有代表性的标准样品，通过严格细致的化学分析测出必要的数据，再通过计算机建立数学模型，才能预测未知样品的结果。而模型的建立需耗用大量的人力、物力和财力；其次，由于NIR谱区为分子倍频与合频的振动光谱，信号弱，谱峰重叠严重，所以目前还仅能用于常量分析，被测定组分的量一般应大于样品重量的0.1%。(4)极谱法利用单扫描示波极谱仪进行定性定量检测。单扫描示波极谱法，是在一个滴汞生成的后期，在电解池两极上快速施加一锯齿波脉冲电压，用示波器记录在一个滴汞上所产生的整个电流-电压曲线。由极化电压发生器产生的锯齿波脉冲扫描电压通过测量电阻R加到极谱电解池的两电极上，并经过放大后同时加到示波器的水平偏向板上。产生的极谱电流经过R产生电压降，后者经过放大后加到示波器的垂直偏向板上。极谱波的产生是由于在极化电极(即滴汞电极)上出现浓差极化而引起的，该方法的主要缺点是:测定结果易受到高浓度阳离子的干扰，而很多食品中的离子浓度较高；滴汞电极产生的汞蒸气对人有毒；滴汞电极作阳极时，电位不得〉0.4V(VsSCE)，否则汞被氧化；残余电流较大且常出现一些异常电流对分析测定形成干扰；所用毛细管易堵塞。单扫描示波极谱法测定丽春红2R的检出限为0.lug/mL。三
发明内容本发明就是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种不受检测者的主观影响和内源物质的影响，步骤简单，检测准确、灵敏度高的食品中丽春红2R的检测方法。为解决上述问题，本发明的技术解决方案是一种食品中丽春红2R的检测方法，其使用的检测仪器用于样品的定性定量分析测定的有配有四元梯度泵、二极管阵列检测器、在线脱气机、手动进样器的高效液相色谱仪，氮吹仪，超声波发生器，超纯水装置，弱阴离子固相萃取柱，固相萃取装置和溶剂过滤器，PH计，低温离心机，移液器；所使用的试剂为研究提供样品的丽春红2R标准品，用于液谱流动相的配制的色谱纯乙睛、优级纯冰醋酸、色谱纯三乙胺、优级纯乙酸铵，用于萃取样品中的丽春红2R的色谱纯乙醇、优级纯氨水，色谱纯甲醇；其步骤如下(1)确定检测的标准A、定性检测标准取丽春红2R标准品用超纯水溶解后定容于容量瓶中，配制成浓度为0.5-2.0mg/mL的标准储备液，将丽春红2R标准储备液用超纯水稀释配制成浓度范围为O.1-15ug/mL的标准溶液，用孔径《0.45um的滤膜过滤后，在XDB-C18色谱柱；流动相A:0.005mol/L乙酸铵肌Ac+0.06%三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸溶液调整pH为8，B:色谱纯乙腈CH3CN;洗脱梯度t=0分钟，10%B;t=2分钟,10%B;t=15分钟，90。/。BK7分钟，10%B;流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27i:，进样量10uL的分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪分析，根据丽春红2R标准样品的色谱峰的保留时间作为定性标准；B、定量检测标准将步骤A中制取的丽春红2R标准储备液用超纯水分别稀释配制成浓度范围为0.1-0.g/mL、0.5-1.0ug/mL、1.0-2.5ug/mL、2.5-5.0yg/mL、5.0-10ug/mL、10-15yg/mL的标准溶液，分别用孔径《0.45um的滤膜过滤后，在歩骤A的色谱分析条件下，由手动进样器分别进高效液相色谱仪分析，将所得色谱峰的浓度和对应的峰面积绘制成标准工作曲线；在丽春红2R浓度为0.1-15ug/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.0419x+0.0191，线性相关系数为l，以此为实际样品的测定提供定量标准；(2)对待测的食品进行检测A、对待测的食品进行前处理取检测量的非水溶性待测样品加入到具塞试管中，加入乙醇水氨水=75:24:l的乙醇--氨溶液，将试管置于温度为50±2'C的超声波发生器中超声提取20-30分钟，提取的上清液收集到容量瓶中，残渣再加入上述的乙醇-氨溶液，再在超声波发生器中提取上清液3次，将提取的上清液混匀后，再加优级纯冰醋酸溶液，使其pH值调节为6士0.5,加超纯水稀释，定容于容量瓶内，取稀释液离心，吸取上清液备用；或者称取检测量水溶性样品放入烧杯中用热超纯水搅拌溶解，加超纯水稀释，定容于容量瓶内，取稀释液离心，吸取上清液备用；将弱阴离子固相萃取小柱先用色谱纯甲醇活化、再用超纯水进行活化，活化时液面不能干泡，然后取备用上清液用移液器上样2-3ml后，再分别先后用超纯水和色谱纯甲醇3-4ml洗涤固相萃取小柱，输入空气，干燥固相萃取小柱后，最后用含2%的优级纯氨水的色谱纯甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液；将洗脱溶液用氮吹仪吹除优级纯氨水和色谱纯甲醇溶液溶剂；B、定性检测将步骤A中吹除溶剂后的洗脱溶液置于具塞试管中，再加入超纯水，超声波发生器中超声溶解，溶液经孔径《0.45um滤膜过滤后，在XDB-C18色谱柱；流动相A:0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+O.06%三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸调整pH为8，B:色谱纯乙腈CH:iCN;洗脱梯度t=0分钟，10%B;t-2分钟,10%B;t=15分钟，9CmB;t^7分钟，10%B;流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27。C，进样量10yL的色谱分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪分析，根据色谱峰的保留时间来确定是否含有丽春红2R;C、定量检测将步骤A中备用上清液分六组，在XDB-C18色谱柱；流动相A:0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+O.06%三乙胺水溶液，用0.lmol/L的冰乙酸调整pH为8，B:色谱纯乙腈CH3CN;洗脱梯度tO分钟,10%B;t=2分钟,10%B;t=15分钟，90%B;1=17分钟，10%B;流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27。C，进样量10uL的色谱分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪平行测定，取得其色谱峰的峰面积，根据线性回归方程计算得到实际样品中的丽春红2R的浓度，再根据检测量即可计算出丽春红2R的总含量，取平均值后即得测得值。(3)检出限用超纯水进样，获取信号线噪声信号值，以3倍噪声信号值所相当的丽春红2R含量值为方法最低检出量。(5)回收率和精密度将无丽春红2R的待测食品中加入六组不同量的标准丽春红2R，采用步骤(2)C中所描述的方法平行测定6次，计算进行回收率和相对标准偏差。本发明采用弱阴离子固相萃取小柱进行前处理，它采用高效、高选择性的固定相，能显著减少溶剂用量并简化样品处理程序,有效除去内源干扰物质，提高分析的灵敏度。高效液相色谱仪是目前我国质检部门普遍装备的分析仪器，其不用在为检测丽春红2R专门准备仪器，减少了投入，且与现有的检测丽春红2R的仪器分析方法相比高效液相色谱仪具有选择性高，分离效率高，灵敏度高等特点。固相萃取与高效液相色谱结合起来定性定量检测食品中非食用色素丽春红2R，利用保留时间定性，外标法定量，检出限为0.02ug/mL，相对标准偏差为0.33-2.86%，加标回收率为90.05-94.91%，其具有更高的灵敏度，检测准确，不受检测者的主观影响，步骤简单。具体实施例方式实施例l:市售辣椒粉中丽春红2R的检测1、确定检测的标准A、定性检测标准取丽春红2R标准品用超纯水溶解后定溶解于容量瓶中，配制成浓度为0.5-2.0mg/mL的标准储备液，将丽春红2R标准储备液用超纯水稀释配制成浓度范围为0.1-15ug/mL的标准溶液，0.45um滤膜过滤后，在色谱柱为XDB-C18(150mmX4.6mm1.d.5—;流动相A:0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+O.06%三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸调整pH为8，B:色谱纯乙腈CH3CN;洗脱梯度t=0分钟，10%B;t-2分钟，10%B;t^5分钟，90%B;t=17分钟,10%B;流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27'C，进样量10uL的色谱分析条件下，由手动进样器进Agilent1100高效液相色谱仪分析，根据丽春红2R标准样品的色谱峰的保留时间作为定性标准。B、定量检测标准将丽春红2R标准储备液用超纯水分别稀释配制成浓度范围为0.1-0.5Pg/mL、0.5-1.0yg/mL、1.0-2.5ug/mL、2.5-5.0yg/mL、5.0-10ug/mL、10-15ug/mL的标准溶液，分别经0.45ym滤膜过滤后，在步骤A的色谱分析条件下，由手动进样器分别进AgilentIIOO高效液相色谱仪分析，将所得色谱峰的浓度和对应的峰面积绘制成标准工作曲线；在丽春红2R浓度为0.l-15ug/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.0419x+0.0191，线性相关系数为1，以此为实际样品的测定提供定量标准。2、样品处理将lg辣椒粉样品加入到试管中，加入乙醇水氨水=75:24:1的10mL乙醇-氨溶液，将试管置于温度为5(TC的KQ-100B超声波发生器中提取20分钟，提取的上清液收集到25mL容量瓶中，残渣用5mL所述乙醇-氨溶液用KQ-100B超声波发生器分别提取3次，每次5分钟，合并提取液，加0.lmol/L所述冰醋酸溶液调节pH为6，加超纯水稀释，定容至25mL,取稀释液6mL在6000r/分钟条件下离心20分钟，吸取上清液3mL备用。将所述弱阴离子固相萃取小柱先用所述色谱纯甲醇活化、再用3mL超纯水进行活化，活化时液面不能干涸，然后取上述备用上清液3mL上样，分别先后用3mL水和3mL甲醇溶剂洗涤固相萃取柱，输入空气干燥萃取柱30秒后，最后用3mL含2y。优级纯氨水的色谱纯甲醇洗脱，并收集洗脱液。洗脱溶液在50士2'C条件下用氮吹仪吹除溶剂后，再用2mL超纯水超声溶解后，经0.45nm滤膜过滤，取10uL滤液用所述高效液相色谱仪测定，平行测定六组，根据线性方程得到丽春红2R的浓度，再根据辣椒粉样品的检测量即可计算出丽春红2R的总含量，取平均值后即得测定值。3、回收率和精密度将无丽春红2R的辣椒粉中加入三组不同量的标准丽春红2R，采用步骤2中所描述的方法分别平行测定6次，计算进行回收率和相对标准偏差。具体结果如下表所示加标量测定结果回收率相对标准偏平均测定值ug_%差(RSD)%ug11.3790.972.6911.7411.4891.8112.1096.8412.1096.8411.5892.6511.7994.3223.2192.832.1922.8323.6394.5122.4889.9022.7991.1622.3789.4822.4889.9044.0588.111.7145.3345.0088.1145.1089.9945.7390.2045.9491.4646.15_91.88_4、根据检测结果，计算三组加入标准丽春红2R的辣椒粉中的丽春红2R含量分别为11.74ug，22.83ug，45.33ng，与实际加标量非常接近，证明准确性较高，相对标准偏差分别为2.69%，2.19%，1.71%，说明本方法精密度较高。实施例2:市售硬糖中丽春红2R的检测1、确定检测的标准其定性检测、定量检测标准同实施例12、样品处理准确称取2g样品放入200mL烧杯中用7(TC热超纯水溶解，加超纯水稀释，定容于25mL容量瓶中，取稀释液6mL在6000r/min条件下离心20min,吸取上清液3raL备用。将所述弱阴离子固相萃取小柱先用所述色谱纯甲醇活化、再用3mL超纯水进行活化，活化时液面不能干涸，然后取上述备用上清液3mL上样，分别先后用3mL水和3mL甲醇溶剂洗涤固相萃取柱，输入空气干燥萃取柱30秒后，最后用3mL含2%优级纯氨水的色谱纯甲醇洗脱，并收集洗脱液。洗脱溶液在50'C条件下用氮吹仪吹除溶剂后，再用2mL超纯水超声溶解后，经0.45ym滤膜过滤，取10uL滤液用所述高效液相色谱仪测定，平行测定六组，根据线性方程得到丽春红2R的浓度，再根据硬糖样品的检测量即可计算出丽春红2R的总含量，取平均值后即得测定值。3、回收率和精密度将无丽春红2R的硬糖中加入三组不同量的标准丽春红2R，采用步骤2中所描述的方法分别平行测定6次，计算进行回收率和相对标准偏差。具体结果如下表所示-<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4、根据检测结果，计算三组硬糖中的丽春红2R含量分别为11.84ug，22.33yg，48.33Pg，与实际加标量非常接近，证明该方法准确性较高；相对标准偏差分别为2.15%,2.86%,0.33%，说明本方法精密度较高。权利要求1、一种食品中丽春红2R的检测方法，其特征是它包括以下步骤(1)确定检测的标准A、定性检测标准取丽春红2R标准品用超纯水溶解后定容于容量瓶中，配制成浓度为0.5-2.0mg/mL的标准储备液，将丽春红2R标准储备液用超纯水稀释配制成浓度范围为0.1-15μg/mL的标准溶液，用孔径≤0.45μm的滤膜过滤后，在XDB-C18色谱柱；流动相A0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+0.06％三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸溶液调整pH为8，B色谱纯乙腈CH3CN；洗脱梯度t＝0分钟，10％B；t＝2分钟，10％B；t＝15分钟，90％B；t＝17分钟，10％B；流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27℃，进样量10μL的分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪分析，根据丽春红2R标准样品的色谱峰的保留时间作为定性标准；B、定量检测标准将步骤A中制取的丽春红2R标准储备液用超纯水分别稀释配制成浓度范围为0.1-0.5μg/mL、0.5-1.0μg/mL、1.0-2.5μg/mL、2.5-5.0μg/mL、5.0-10μg/mL、10-15μg/mL的标准溶液，分别用孔径≤0.45μm的滤膜过滤后，在步骤A的色谱分析条件下，由手动进样器分别进高效液相色谱仪分析，将所得色谱峰的浓度和对应的峰面积绘制成标准工作曲线；在丽春红2R浓度为0.1-15μg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.0419x+0.0191，线性相关系数为1，以此为实际样品的测定提供定量标准；(2)对待测的食品进行检测A、对待测的食品进行前处理取检测量的非水溶性待测样品加入到具塞试管中，加入乙醇∶水∶氨水＝75∶24∶1的乙醇--氨溶液，将试管置于温度为50±2℃的超声波发生器中超声提取20-30分钟，提取的上清液收集到容量瓶中，残渣再加入上述的乙醇-氨溶液，再在超声波发生器中提取上清液3次，将提取的上清液混匀后，再加优级纯冰醋酸溶液，使其pH值调节为6±0.5，加超纯水稀释，定容于容量瓶内，取稀释液离心，吸取上清液备用；或者称取检测量水溶性样品放入烧杯中用热超纯水搅拌溶解，加超纯水稀释，定容于容量瓶内，取稀释液离心，吸取上清液备用；将弱阴离子固相萃取小柱先用色谱纯甲醇活化、再用超纯水进行活化，活化时液面不能干涸，然后取备用上清液用移液器上样2-3ml后，再分别先后用超纯水和色谱纯甲醇3-4ml洗涤固相萃取小柱，输入空气，干燥固相萃取小柱后，最后用含2％的优级纯氨水的色谱纯甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液；将洗脱溶液在用氮吹仪吹除优级纯氨水和色谱纯甲醇溶液溶剂；B、定性检测将步骤A中吹除溶剂后的洗脱溶液置于具塞试管中，再加入超纯水，超声波发生器中超声溶解，溶液经孔径≤0.45μm滤膜过滤后，在XDB-C18色谱柱；流动相A0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+0.06％三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸调整pH为8，B色谱纯乙腈CH3CN；洗脱梯度t＝0分钟，10％B；t＝2分钟，10％B；t＝15分钟，90％B；t＝17分钟，10％B；流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27℃，进样量10μL的色谱分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪分析，根据色谱峰的保留时间来确定是否含有丽春红2R。2、根据权利要求1所述的食品中丽春红2R的检测方法，其特征是其还可进一歩进行定量检测歩骤如下将所述步骤(2)A中备用上清液分六组，在XDB-C18色谱柱；流动相A:0.005mol/L乙酸铵NH4Ac+0.06%三乙胺水溶液，用0.1mol/L的冰乙酸调整pH为8，B:色谱纯乙腈CH线洗脱梯度t:0分钟，10%B;t二2分钟,10%B;t二15分钟，90%B;t=17分钟，10%B;流速1.0mL/分钟，检测波长504nm，柱温箱温度27。C，进样量10uL的色谱分析条件下，由手动进样器进高效液相色谱仪平行测定，取得其色谱峰的峰面积，根据线性回归方程计算得到实际样品中的丽春红2R的浓度，再根据检测量即可计算出丽春红2R的总含量，取平均值后即得测得值。全文摘要本发明公开了一种食品中丽春红2R的检测方法，非水溶性待测样品在超声波发生器中经乙醇-氨溶液提取上清液，水溶性样品用热水溶解后提取上清液，然后用弱阴离子固相萃取小柱萃取，用高效液相色谱仪分析萃取液，根据色谱峰的保留时间来确定是否含有丽春红2R；进一步采用加标回收法，根据线性方程计算得到实际样品中的浓度，再根据检测量来确定丽春红2R的含量，其检出限为0.02μg/ml，相对标准偏差为0.33-2.86％，加标回收率为90.05-94.91％，本发明能显著减少溶剂用量并简化样品处理程序，有效除去内源干扰物质，其不受检测者的主观影响，步骤简单，灵敏度高，检测准确。文档编号G01N30/02GK101173913SQ20071019544公开日2008年5月7日申请日期2007年11月29日优先权日2007年11月29日发明者吴广臣,庞艳苹,李小亭,赵志磊申请人:河北大学