专利名称：电极催化剂和酶电极的制作方法
技术领域：
本发明涉及电极催化剂和酶电极，更详细地说，涉及作为生物传感器、 燃料电池等各种电化学器件的电极使用的酶电极，以及在酶电极中使用的 电极催化剂。
背景技术：
酶是使生物体内的化学反应(代谢)进行的生物体催化剂，以蛋白质为 基本结构。酶也有的仅由蛋白质构成，但大多数酶为了发挥酶活性或者提 高酶活性，需要除蛋白质之外的成分(辅因子)。
酶有下述(l)、 (2)等特征
(1) 在接近常温、常压的温和条件下显示催化作用；
(2) 同时具有只对特定的底物(通过酶而受到作用的物质)发挥作用的 "底物特异性"，以及对特定的化学反应显示催化作用、并不引起副反应的 "反应特异性"。
在酶中，将催化生物体内的氧化还原的酶称为"氧化还原酶 (oxidoreductase)"。另外，将以氧作为电子受体而使底物氧化的酶特别地 称为"氧化酶(oxidase)",将使底物还原的酶特别地称为"还原酶 (reductase)"。如果在电>^面固定某种氧化还原酶，则可以通过酶的催化 作用而在电极上选择性地只进行特定的氧化还原反应，从而通过电极将氧 化还原反应所产生的物质转换成电信号。将这样的电极称为"酶电极"，可 以在各种生物传感器、燃料电池等的电极中使用。
为了使用酶作为电极催化剂，必须将酶固定在适当的载体表面。但是, 因为酶一般是水溶性的，所以在使用中存在酶容易流出等问题。另外，酶具有与底物特异性地结合、接受催化作用的部位(活性中心)。 因为很多时候活性中心被埋在具有复杂的立体结构的蛋白质的内部深处， 所以难以与电极之间直接进行电子授受。在这样的情况下，通常要并用侵 入到酶的活性部位、与酶进行电子迁移、再将电子运送到电极的低分子物 质。这样的低分子物质被称为"介体"。但是，因为酶/介体之间的电子移动 速度依赖于各自的分子运动，所以未必充分，有可能成为限制酶电极的电 流密度的主要原因。
因此，为了解决该问题， 一直以来人们提出了各种方案。 例如，专利文献l公开了一种含氮碳系复合材料，该复合材料具有多 孔体，所述多孔体含有由碳原子和氮原子形成骨架的含氮碳系材料，并且 该复合材料还具有担载在上述多孔体上的氧化还原酶。
上述文献中还记载了下述要点(l)、和(2):
要点(l)因为含氮碳系材料在细孔表面存在极性位点，所以如果在其 上担栽氧化还原酶，则会与蛋白质表面的亲水基团之间生成氬键等新的结 合，从而蛋白质与载体的结合^^口强；
要点(2)作为担载在载体上的氧化还原酶，可列举漆酶、心肌黄酶、 脂肪氧合酰胺脱氢酶(Lipoxyamide dehydrogenase)、醇脱氢酶、葡萄糖氧 化酶(包括以其它糖为底物的氧化酶)、葡萄糖脱氢酶(包括以其它糖为底物 的脱氢酶)。
另外，专利文献2公开了一种酶电极，该酶电极具有导电性部件、酶、 第1和第2介体，第1介体和第2介体通过载体固定在导电性部件上，并 且第l介体与第2介体氧化还原电位彼此不同。
上述文献中还记载了下述要点(l)、 (2)和(3):
要点(l)通过采用这样的构成，可以提高导电性部件的单位实效表面 积的酶担载密度；
要点(2)除可以进行与酶之间的高速的电子移动的第1介体之外，可 以通过进一步使用在第l介体与导电性部件之间进行电荷传递的第2介体， 从而与酶进行高速电子移动；要点(3)作为酶，可列举葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、胆红素氧化 酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、抗 坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢 酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、乳酸脱氢 酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱 氢酶、氨基酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌 黄酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、NADH-细胞色素b5 还原酶、NADPH-皮质铁氧还蛋白还原酶、细胞色素b5还原酶、皮质铁氧 还蛋白还原酶、硝酸还原酶。
专利文献l:特开2005-343775号7>才艮
专利文献2:特开2006-058289号公报
发明内容
氧化还原酶一般除了与底物结合的活性中心之外，具有用于进行与活 性中心之间的电子授受的部位(电子传递门)。因为在生物体内对酶的电子 传递通常是介由介体来进行的，所以酶的电子传递门多埋在蛋白质的口袋 内部。如果将这种状态的酶固定在电极表面，则电子传递门与电;^面的 距离无论如何也会增大。由于电子移动速度的常用对数与距离成比例地减 慢，故而现有已知的酶得不到高电子传递效率。
为了解决该问题，正如专利文献2所公开的那样，人们考虑了并用介 体。但是，仅仅通过并用介体的方法，电子传递效率的提高有限。另外， 目前没有报道适用于能够得到充分量的电流密度的酶电极的酶的例子。
本发明要解决的课题是，提供含有电子传导效率高的氧化酶的新型电 极催化剂、以及使用该电极催化剂的酶电极。
为了解决上述课题，本发明所涉及的电极催化剂含有CueO。
另外，本发明所涉及的酶电极具有碳多孔体；以及担载在上述碳多 孔体表面的、含有CueO的电极催化剂。
当将作为多铜氧化酶的的一种的CueO作为酶电极用的催化剂使用时，则可得到高于以往的氧化还原酶的电流密度。
i人为这是由于以下原因。
(1) 因为CueO的酶分子中，催化氧化反应的活性中心与电子传递门分 传递。、 、 - 、 s 、， '
(2) 因为CueO中电子传递门更接近分子表面，所以在固定于固体表面 的状态下，电子传递门与电极的距离减小，故而电子移动的效率提高。
由于以上那样的原因，本发明的电极催化剂电子传递效率优异，并可
以得到高于以往的氧化还原酶的电流密度。即，固定了本发明的电极催化 剂的酶电极，电极催化剂的单位固定化量所得的电流值较大，即使在有限 的面积上固定电极催化剂的情况下，也可以得到高电流值。具体地说，可 以得到与使用铂催化剂的电极同等的电流密度。而且，因为固定了本发明 的电极催化剂的酶电极即使固定少量的电极催化剂，也可得到高电流值， 所以可以降〗氐成本。
进而，因为本发明的电极催化剂的电子传递效率高，即，电极-电极催 化剂之间的电子移动速度非常快，所以即使为了提高酶电极中的电极反应 速度而不使用介体，也可以得到高电流值。
另外，因为本发明的电极催化剂电子传递效率高、电极-电极催化剂之 间的电子移动速度非常快，所以在固定了本发明的电极催化剂的酶电极中 所得的催化电流与其说是受该电极催化剂的酶活性限制，不如说是受对电 极的氧供给速度限制。即，固定了本发明的电极催化剂的酶电极可以显示 稳定的电极活性，从而得到稳定的输出功率。因此，可以通过使用固定了 本发明的电极催化剂的酶电极，实现提高燃料电池的输出功率、使得氧检 测型传感器高灵敏度化。
图l是一种作为多铜氧化酶的来自大肠杆菌的CueO的分子结构。 图2是含有各种多铜氧化酶的酶溶液的循环伏安图。图3是含有担载在各种碳载体上的各种多铜氧化酶的酶电极的循环伏 安图。
具体实施例方式
以下，对于本发明的一种实施方式进行详细说明。 本发明所涉及的电极催化剂含有CueO。
氧化还原酶是催化氧化还原反应的酶，蛋白质的立体结构中具有活性 中心和电子传递门。所谓"活性中心"是指底物与之特异性地结合、接受催 化作用的部位。所谓"电子传递门"是指用于进行与活性中心之间的电子授 受的部位。
氧化还原酶大致分为使底物氧化的氧化酶、和使底物还原的还原酶。 使用哪一种作为电极催化剂用酶根据电极极性不同而不同。即，在使用酶 作为正极侧的材料时，使用能够通过反应接受电子(换而言之，能够催化以 质子和氧为底物生成水的反应)的氧化酶。另一方面，在使用酶作为负极侧 的材料时，使用通过反应释放电子的还原酶。
另外，氧化还原酶是具有固有的三维结构的巨大分子，活性中心、电 子传递门通常处于埋在三维结构的开口部分(凹陷、裂缝)的深处的状态。 这时，活性中心和电子传递门可以位于同一开口部，或者可以位于不同的 开口部。
其中，就具有含有电子传递门的第1开口部和含有活性中心的第2开 口部的氧化还原酶而言，在酶催化底物时，底物移动与电子移动不相干扰。 因此，与在同一开口部含有活性中心和电子传递门的酶相比，酶/电极间的 电子传递效率提高。
特别是，就含有电子传递门的第1开口部位于含有活性中心的第2开 口部对面的氧化还原酶而言，可以通过使第1开口部接近电极表面从而极 为顺利地进行电^l/电子传递门之间的电子传递。因此，酶/电极间的电子传 递效率进一步提高。
这里，所谓"第1开口部位于第2开口部的对面"是指第1开口部所处的面的法线方向与第2开口部所处的面的法线方向所成的角大于卯°。优 选2条法线所成的角较大，越接近180。越好。
在氧化还原酶中，多铜氧化酶催化下述反应，即使用从底物取出的 电子将分子态氧进行4电子还原，从而生成水的反应。多铜氧化酶有作为 电子传递门的单核蓝铜(I型Cu)、和作为活性中心的三核铜簇(II型Cu、 III型Cu),单核蓝铜与三核铜蔟分别位于不同开口部的内部。而且，2个 开口部分别在由蛋白质形成的立体结构的表面和里面。因此，多铜氧化酶 或者将其通过基因操作进行了变化的修饰酶特别适合作为在生物传感器、 燃料电池等各种电化学器件中使用的酶电极的正极用催化剂。
作为多铜氧化酶，具体地说有漆酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、 血浆铜蓝蛋白、CueO、芽孢杆菌属细菌的内生孢子外壳蛋白CotA等。其 中，在使用CueO (特别是大肠杆菌的铜代谢相关氧化酶CueO (来自大肠 杆菌的CueO))作为酶电极用电极催化剂时，得到了高于以往的氧化还原酶 的电流密度。
所谓"CueO"是指从各种菌林采集的一种多铜氧化酶。另外，所谓"来 自大肠杆菌的CueO"是指从大肠杆菌采集的CueO。序列表的第1序列示 出了天然型成熟CueO的C&紗列(swissprot登记号Q8X947)。
CueO可以是从菌林直接采集的天然型CueO，或者可以是在不使催化 活性和电子传递能力消失的范围内，通过基因操作改变、删除天然型CueO 的一部分氨基酸序列而得的修饰型CueO。
接着，对于本发明所涉及的酶电极进行说明。
本发明所涉及的酶电极具有碳多孔体、以及担载在碳多孔体表面的含 有CueO的电极催化剂。CueO特别优选来自大肠杆菌的CueO。其中，因 为关于CueO和来自大肠杆菌的CueO如上所述，所以省略说明。
担载酶的载体使用碳多孔体。因为碳多孔体不仅可以顺利地进行酶/ 电极间的电子传递，而且在细孔径适当的情况下，可以将酶物理性地担载 在细孔内，并且可以抑制酶失活，所以特别适合作为载体。
为了充分提高作为载体成分的酶的稳定性和活性，碳多孔体优选具备以下[l.~ [4.的4壬1个以上的条件。 [1.平均细孔径
碳多孔体优选平均细孔径为2~50nm。平均细孔径进而优选为2~ 20nm。如果平均细孔径不足2nm，则细孔的尺寸小于酶的尺寸的情况增多， 吸附性降低。另一方面，如果平均细孔径超过50nm，则引起比表面积降 低，从而吸附性降低。另外，如果平均细孔径超过20nm,则有可能在担 载一部分酶时容易产生不适合。
另外，碳多孔体的平均细孔径优选为酶的分子直径以上。平均细孔径 更优选为酶的分子直径的1~1.25倍。如果碳多孔体的平均细孔径为上述 范围，则酶容易固定在细孔内。因为酶一被固定在细孔内，细孔外壁就会 抑制热造成的酶结构变化，所以能够抑制热造成的酶失活，故而热稳定性 提咼。
此外，所谓平均细孔径，是指在由后述的由氮吸附等温线求得的细孔 径分布中，分布峰顶的细孔径值。 [2.细孔径分布
以细孔径分布区域在2~100nm范围的所有细孔容积为基准，碳多孔 体优选在平均细孔径的±25 %的范围内的细孔容量为60 %以上的碳多孔 体。如果细孔径的均匀性t匕这差，则可能除了细孔径最适合担载酶的细孔 之外的细孔变多，酶的稳定性和活性不充分。
对中孔碳粒子的制造方法不特别限制，例如，可以通过以下的方法制 造。即，对中孔规则排列的二氧化硅、二氧化钛等多孔粒子(铸型)，吸附、 浸渍蔗糖、糠醇等有机分子，然后在惰性气氛下进行碳化。然后，通过氬 氟酸、NaOH/EtOH等溶解、除去铸型，结果得到中孔碳粒子。作为铸型， 例如，可以使用二氧化硅中孔多孔体MCM-48。
对制造含氮炭黑凝胶的方法不特别限制，例如，可以通过以下那样的 方法制造。
(A)使用一氧化氮在炭黑凝胶中导入N原子的方法。 要在炭黑凝胶中导入N原子，例如，可以依据文献(P.Chambrkm等，Energy&Fuels， 11巻,681-685页(1997))所记载的方法来实施。即，在石 英反应管中配置炭黑凝胶，在氦气流下加热到950。C左右。然后将用氦气 稀释的NO(浓度1000ppm左右)导入反应管，在600 ~卯0。左右的反应温度 下进行反应。对该反应所需要的反应时间不特别限制，但如果延长反应时 间则i^V碳骨架中的氮量增加。
(B)通过热CVD法在炭黑凝胶表面析出含氮碳的方法。 该方法是在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，通过使该含氮有 机化合物热分解来在炭黑凝胶表面析出含氮碳的方法。即，首先，在反应 管中设置炭黑凝胶， 一边将氮气、氩气等惰性气体导入反应管， 一边加热 到规定温度。接着，维持加热状态不变，通过将气态的含氮有机化合物导 入反应管，从而在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，同时进行规定 时间的CVD反应。由此，可以在炭黑凝胶的细孔内析出由C原子和N原 子形成骨架的含氮碳。利用热CVD法进行的析出工序，因为在反应气氛 为氧化气氛的情况下发生碳燃烧，所以通常在氮气、氩气等惰性气氛下进 行。
作为这里所使用的含氮有机化合物，只要是含有N原子的有机化合物 即可，不特别限制，可列举例如，含氮杂环式化合物、胺类、亚胺类、腈 类等。作为含氮杂环式化合物，可列举含氮单环化合物和含氮稠环化合物。
作为含氮单环化合物，可列举作为5元环化合物的吡咯及其衍生物， 吡唑、咪唑等二唑类及其衍生物；以及作为6元环化合物的吡咬及其f;t生 物，喊溱、嘧啶、吡嗪等二嗪类及其衍生物，三嗪类以及三聚氰胺、氰尿 酸等三溱类衍生物等。
另外，作为含氮稠环化合物，可列举壹啉、菲咯啉、噤呤等。
作为胺类，可列举伯~叔胺、二胺类、三胺类、多胺类和氨基化合物等。
作为伯 叔胺，可列举甲胺、乙胺、二曱胺和三曱胺等脂肪族胺；以 及苯胺等芳香族胺及其衍生物等。
作为氨基化合物，可列举乙醇胺等氨基醇等。作为亚胺类，可列举吡咯烷和氮丙啶等。
作为腈类，可列举乙腈等脂肪族腈和节腈等芳香族腈等。 作为其它含氮有机化合物，可列举尼龙等聚酰胺类、半乳糖胺等M 糖、聚丙烯腈糖的含氮高分子化合物、氨基酸和聚酰亚胺类等。
在利用热CVD法进行的析出工序中，当含氮有机化合物在常温下为 液态时，可以使用扩散器、质量流泵等，通过蒸气蒸发将含氮有机化合物 制成气态而导入反应管内。另外，这时优选使用氮气、氩气等作为载气来 导入气态的含氮有机化合物。进而，优选通过在反应管出口侧设置加入了 液体石蜡等的扩散器等来防止逆流，使得曾在反应管内流通的气体不从反 应管的出口侧逆流。
当含氮有机化合物在常温下为固态时，可以在反应管入口侧设置加热 蒸发(升华)器，从而通过加热将含氮有机化合物制成气态导入反应管。另 外，这时必须将蒸发器的温度调整到含氮有机化合物不热分解的温度。
在含氮有机化合物具有聚合性的情况下，可以采取预先使之在炭黑凝 胶的细孔内聚合，然后在反应管中、在惰性气氛下进行热分解的方法。
进而，在含氮有机化合物不因加热而气化的情况下，可以通过溶液吸 附法、蒸发干固法等预先在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，通过 将它们在惰性气氛下进行热分解，从而使炭黑凝胶的细孔内析出含氮碳。
利用热CVD法进行的析出工序中的反应温度，只要是含氮有机化合 物热分解和碳化的温度即可，不特别限制，优选为300~ 1000°C。反应温 度更优选为500~700°C。当反应温度不足30(TC时，由于含氮有机化合物 难以发生热分解，故而有含氮碳的析出速度减慢，反应时间和能量消耗增 大的倾向。另一方面，当温度超过1000。C时，由于碳骨架中难以残留碳， 故而N/C比降低。
在析出工序中，对在炭黑凝胶的细孔内析出的含氮碳的析出量不特别 限制，优选在以每克炭黑嶷胶的比表面积为Yn^的情况下，为(0.0001xY)g 以上。在含氮有机化合物的析出量不足(0.0001xY)的情况下，由于析出量 较少，故而有可能不能通过N原子提高吸附性。析出量与CVD反应时间是相关关系，可以通过调整CVD反应时间来 控制析出量。进而，析出量根据CVD反应温度、炭黑凝胶的种类、含氮 有机化合物的种类和导入含氮有机化合物时的流量等不同而变化，但在各 种情况下可以通过适当调整CVD反应时间来调整析出量。
接着，对本发明所涉友的酶电极的制造方法进行说明。
首先，在碳多孔体的表面担载酶。对酶的担载方法不特别限制，可以 1吏用升华法、浸渍法等各种方法，但优选浸渍法。
通过浸渍法来担载酶如下地进行。即，首先，^使酶溶解到水或緩冲液 中l吏得其为不生成沉淀的浓度(优选为0.1 ~ 1000mg/ml)。然后，在该溶液 不冻结、并且酶不变性的温度(优选为0 50。C)下，在其中悬浮粉末状的栽 体，或使其浸渍片状的载体中，从而使酶与载体接触。接触时间优选为至 少5分钟以上，更优选为30分钟以上。从而在栽体的表面或细孔内固定酶。
对在溶液中悬浮载体时的浓度不特别限制，优选为0.1 ~ 1000mg/ml 左右。另外，在担载工序之后，可以进一步有通过进行离心分离等来将载 体与溶液分离而取出的工序。或者，可以通过进行干燥等来除去液体成分。
对在载体上担载介体的方法，可以使用与在载体上担载酶的方法相同 的方法。还可以在载体上同时担载酶与电子移动介体。
接着，对本发明所涉及的电极催化剂和酶电极的作用进行说明。
图1显示一种作为多铜氧化酶的来自大肠杆菌的CueO的分子结构 (Sue A. Roberts等，PNAS， 99巻(2002年)，2766-2771页)。如图1所示， 蛋白质的立体结构中，具有作为电子传递门而发挥作用的单核蓝铜(I型 Cu)、和作为活性中心的三核铜簇(II型Cu、 III型Cu)，单核蓝铜与三核 铜簇分别处于不同开口部的内部(片冈邦重，生化学，第77巻(2005年)， 第148页~第153页)。并且，2个开口部分别处于由蛋白质形成的立体结 构的表面和里面。而且，天然型CueO，其单核蓝铜的上部被称为螺4t 5 的螺旋状分子覆盖。
如果使用这样的CueO作为酶电极用的电极催化剂，则可得到高于现 有的氧化还原酶的电流密度。其详细原因不清楚，但i^为由于以下原因。
(1) 由于CueO的酶分子中，催化氧化反应的活性中心与电子传递门分 离，故而即使将酶固定在电极固体表面也能同时完成催化反应和电子传递。
(2) 因为CueO中电子传递门更接近分子表面，所以在固定于固体表面 的状态下，电子传递门与电极之间的距离减小，故而电子移动效率提高。
另外，在将CueO固定在载体上的情况下，如果使用具有规定的细孔 径、细孔分布和比表面积的碳多孔体，则可得到高电流密度。 认为这是由于下述原因(l)和原因(2):
原因(l)因为可以将大多数酶固定在碳多孔体的细孔内，所以载体/酶 之间的电子移动变得容易；以及，
原因(2)因为蛋白质立体结构的变化被细孔壁抑制，所以减轻了热造 成的失活，提高了热稳定性。
另外，如果使用炭黑凝胶作为碳多孔体，则可得到高电子传递效率。 i人为这是由于，具有大量适合担载酶的细孔、细孔相互连接而形成了三维 的网络等原因。
进而，如果使用含氮炭黑凝胶作为碳多孔体，则可以长时间地维持高 电子传递效率。认为这是囟为，通过在炭黑凝胶中导入氮而在细孔内壁导 入了极性基团，在与蛋白质表面的亲水基团之间生成了氩键等新的结合的 缘故。 实施例
(实施例1、比较例1、 2) [1.试验方法]
将来自大肠杆菌的CueO(实施例1)、来自漆树的漆酶(比较例1)、或来 自漆斑菌属(Myrotheciumu sp.)的胆红素氧化酶(BOD)(比较例2)溶解在磷 酸緩冲液(0.05M， pH7.0)中，调制8fiM的酶溶液。
使用预先饱和了氧的上述酶溶液，以HOPG(高定向热解石墨)电极作 为作用极，通过循环伏安图法(电位-50~650mV，扫描速度20mV/秒)， 来评价酶与电极之间的直#电子移动特性。对峙电极使用铂电极，参考电极使用银/氯化银电极。
使5.5g间苯二酚(和光纯药)和26.5mg碳酸钠(和光纯药)溶解在16.9g 蒸馏水中，然后加入8.1g的37%曱醛溶液(和光纯药)搅拌混合。混合溶液 为淡黄色透明。此外，各成分的摩尔比为间苯二酚碳酸钠甲醛-200:1:400。
接着，在得到的原液中加入水，以体积比计稀释到2倍。将稀释的溶 液装入管形瓶中密封，在室温静置24小时，在50。C静置24小时，进而在 卯。C静置72小时，从而得到水合的有机凝胶。
接着，为了除去有机凝胶中的水分，将有机凝胶浸渍在作为交换溶剂 的丙酮(和光纯药)中。 一将有机凝胶浸渍在丙酮中，有机凝胶中的水分就 扩散到丙酮中，从而可以将凝胶中的水分置换成丙酮。7JC分扩散饱和之后， 将丙酮换成新品，将操作重复几次，从而将凝胶中的水分完全置换成丙酮。 接着，将浸渍溶剂换成正戊烷(和光纯药)，反复进行溶剂交换-浸渍，直至 有机凝胶中的丙酮完全被正戊烷替换。进而，使溶剂置换成正戊烷的有机 凝胶风干，从而得到干燥有机凝胶。
将得到的干燥有机^i^在氮气流下(流量300ml/min)、在1000'C进行 加热，使有机凝胶碳化。加热时间为6小时。 [2.酶电极的制作]
在含有5 % PDVF(聚偏氟乙烯)的NMP(N-曱基吡咯烷酮)溶液中悬浮其 量为6/7 %的炭黑凝胶(实施例Q或科琴导电碳黑(Ketjen Black)(实施例3)， 从而调制浆料，在直径6mm的玻璃碳电极(BAS公司制造，型号002012) 表面上添加上述浆料，通过旋涂(3000rpm)将炭黑载体涂布在电极表面上。通过将得到的碳修饰电极在来自大肠杆菌的CueO水溶液(12.5mg/ml)中在 4。C下浸渍l夜，从而将酶固定在碳修饰电极上。
另夕卜，按照同样的顺序，将来自漆树的漆酶固定在炭黑凝胶(比较例3) 或科琴导电碳黑(比较例4)修饰电极上。 [3.试验方法
将[2.]所得各种酶电极作为作用电极，利用循环伏安图法(在电位为 200 ~ 500mV之间进行电流扫描，扫描速度20mV/秒)来评价电极的电特性。 对峙电极使用柏，参考电极使用银/氯化银电极。电解质使用饱和了氧的 50mM磷酸钾緩冲液(pH7.0)。进而，在使电解液和酶电极两者都静止的状 态下进行电特性评价。 [4.结果
图3显示循环伏安图。根据图3可知，与科琴导电碳黑相比，在使用 炭黑凝胶的情况下，漆酶、CueO的电流量均增加。特别是，CueO/CG的 组合在200mV下的电流密度与漆酶/KB相比，增加到约7倍。
以上，对于本发明的实施方式进行了详细说明，但本发明不受上述实 施方式任何限制，可以在不脱离本发明的宗旨的范围内进行各种改变。
工业可利用性
本发明所涉及的电极催化剂可以作为生物传感器、燃料电池等各种电 化学器件、太阳能电池等的电极催化剂使用。
另外，本发明所涉及的酶电极可以作为生物传感器、燃料电池等各种 电化学器件、太阳能电池等的电极使用。
权利要求
1.一种含有CueO的电极催化剂。
2. 根据权利要求1所述的电极催化剂，所述CueO是来自大肠杆菌的 CueO。
3. —种酶电极，具有 碳多孔体；以及担载在所述碳多孔体表面的、含有CueO的电极催化剂。
4. 根据权利要求3所述的酶电极，所述CueO是来自大肠杆菌的 CueO。
5. 根据权利要求3所述的酶电极,所述碳多孔体是满足以下的(i)和(n)的条件的炭黑凝胶(I) 在扫描区域29 = 0.5 ~ 10。(CuKa线)中未看到X射线衍射峰；(II) 在由吸附脱附等温线计算出的细孔径分布中，在分布峰顶的细孔径值(d)处于2nm以上且不足10nm的范围的情况 下，在相对于上述细孔径值(d)为d士2nm的细孔径区域中，含有总细孔容 量的60%以上，在分布峰顶的细孔径值(D)处于10nm 50nm的范围的情况下，在相 对于上述细孔径值(D)为(0.75xD) ~ (1.25xD)nm的细孔径区域中，含有总细 孑L容量的60%以上。
6. 根据权利要求3~5的任一项所述的酶电极，还具有促进所述碳多 孔体-所述CueO之间的电子授受的介体。
全文摘要
本发明提供含有电子传递效率高的氧化酶的新型电极催化剂，以及使用该电极催化剂的酶电极。电极催化剂含有CueO。酶电极具有碳多孔体、以及担载在上述碳多孔体表面的含有CueO的电极催化剂。CueO优选是来自大肠杆菌的CueO。构成酶电极的碳多孔体优选是炭黑凝胶。另外，酶电极还可以具有促进上述碳多孔体-上述CeuO之间的电子授受的介体。
文档编号G01N27/327GK101529234SQ20078003274
公开日2009年9月9日 申请日期2007年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者上村惠子, 加纳健司, 加藤久雄, 梶野勉, 樱井武, 濑户山德彦, 片冈邦重, 辻村清也 申请人:丰田自动车株式会社;国立大学法人京都大学;国立大学法人金泽大学