测定待分析物浓度的方法

文档序号:5831902阅读:369来源:国知局

专利名称::测定待分析物浓度的方法
技术领域
:本发明涉及测定流体样品中待分析物总浓度的方法,其中所述待分析物至少部分地以配合物形式,通常为免疫配合物存在。本.发明还涉及测定这些流体中待分析物总浓度在游离形式和配合物结合形式待分析物之间的分布的方法。
背景技术
:免疫原性是特定物质能激^起免疫应答诸如抗体产生的能力或程度。在免疫原性研究中,测量并量化在免疫配合物中"隐藏"的成分的兴趣日益增力口。例如,在蛋白质药物诸如治疗抗体的研究中,令人感兴趣的是检测被诱发而出4氐抗所述药物的抗体。然而,由于药物在血清中以相当高的浓度存在,所述抗药物抗体可能很大程度上与药物形成免疫配合物,在用于诱发抗特定疾病引发蛋白的免疫反应的免疫治疗蛋白的情况下,情况则相反。抗体远超过抗原,令人感兴趣的是知道多少抗原是配合物结合的,这是由于高水平的免疫配合物可启动配合物活化。然而时至今日并没有方便有效的技术用于测定血清样品中游离的和配合物结合的待分析物总浓度,或者用于测定为游离形式和为配合物形式的待分析物分别有多少。Moxness,M.S.等,"Irn應n()genicityTestingforAntibodiesDirectedAgainstTherapeuticHumanMonoclonalAntibodiesUsingElectrochemiluminescentDetection",摘要59和海才艮,37'hAnnualOakRidgeConference,2005年4月14、15日,巴尔的摩,马里兰州,公开了用于监测抗人类治疗单克隆抗体(药物)的免疫应答的一企验方法。对每个药物有特异性的兔多克隆抗体被用作代用待分析物并被加入到血清中。然后加入药物,用酸(pH3.3)处理血清一小时从而解离待分析物-药物配合物,恢复中性pH并进行检验,在所述检验方法中,已中和的血清样品与(i)轭合了能通过电致发光(ECL)发光的钌配合物的药物,以及(ii)轭合了生物素的药物温育过夜。然后将混合物转移到配备了电极以俘获生物素-药物/待分析物-钌药物配合物的链霉亲合素涂覆板上,在ECL-分析仪上测量ECL信号并在每次检验中根据负对照进行归一化。然而,所有配合物结合待分析物均未被测量到,这是因为在两个结合位点的生物素-药物轭合物或者在两个结合位点的钌-药物扼合物不能被检测到,因此无法实现待分析物总浓度的测量,Tomimori-Yamashita,J.等,Lepr.Rev.(1999)70:261-271公开了麻风病患者体内抗-PGL-I特异性循环免疫配合物的测量。血清中的循环免疫配合物通过加入聚乙二醇而沉淀,并通过离心分离沉淀物。在EDTA中溶解沉淀物之后,溶液经HCl-甘氨酸酸化,然后用磷酸氩二钾中和。在30分钟之内通过ELISA测试抗PGL-I的IgG或IgM水平,包括将所述溶液在PGL-I涂覆孔中温育90至180分钟,与酶轭合物和底物反应,然后对酶活性产生的颜色进行光谱读数。然而,如在本领域中已知,PEG不能沉淀所有复合的待分析物,因此无法实现待分析物总浓度的测量。以上所述两种现有技术方法要求长时间的温育,因此不适用于流动池4金验方式。因此需要快速易用的检验方法能测量游离的以及复合的待分析物,所述方法能一企测所有复合的待分析物并且也适用于流动池应用。
发明内容以上的以及其他的目的和优点由用于测量游离的和复合的待分析物的总浓度的方法所提供,其中样品首先经处理以分解任何待分析物配合物从而使得所有待分析物为游离形式。然后样品经处理以使得在游离待分析物能重新形成配合物之前对样品中的游离待分析物的浓度进行测量的同时,待分析物能重新形成配合物至任意程度。游离待分析物的测定浓度将能表示样品中待分析物的总浓度。在一个方面,本发明提供了测定流体样品中待分析物总浓度的方法,其中至少一部分待分析物以与待分析物结合物种相结合而成的配合物存在,所述方法包括以下步骤合亲合力从而足以基本离解任何待分析物配合物并提供基本均为游离形式的待分析物,b)将样品置于一定条件下恢复待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力,和c)在结合亲合力恢复之后,但在待分析物基本重新形成任何配合物之前,立即测定所述样品中游离待分析物浓度在优选实施方式中,游离待分析物的测定包括将所述样品与其上固定有待分析物结合配体的固体载体相接触从而使待分析物与固定配体相结合。在另一个方面,本发明提供了测定样品中配合物结合待分析物的方法,所述方法包括以下步骤a)根据以上方面所述的方法测定样品中待分析物总浓度;和b)测定所述样品中游离待分析物的浓度t在步骤a)和b)中得到的浓度之间的差异表示配合物结合待分析物的浓度。中的一种或多种物种相结合形;配合:的能力的方法,所述方法包括步骤合亲合力从而足以基本离解任何待分析物配合物并提供基本均为游离形式的待分析物,b)将样品置于一定条件下恢复待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力,c)在结合亲合力恢复之后,但在待分析物基本重新形成任何配合物之前,立即将样品与其上固定有待分析物的固体载体相接触,和d)分析与被固定的待分析物相结合的物种参考以下详细描述和附图可获得对本发明更完整的理解,及其更多特征和优势。图1是基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器系统的示意性侧视图。图2是在商业生物传感器仪器的集成^1流筒中流动路径的部分示意图。图3是描绘了混合其中两股流体的一种变体的微流系统的部分示意图。图4A和4B是描绘了混合其中两股流体的另一种变体的微流系统的部分示意图。具体实施例方式如上所述,本发明涉及测定流体样品中待分析物总浓度的方法,其中所述待分析物至少一部分以与待分析物结合物种相结合而成的配合物存在,通常为免疫配合物。6根据本发明,样品首先置于一定t^牛下以解离样品中存在的任何配合物(通过降低待分析物和待分析物-结合物种之间的结合亲合力),通常是通过向所述样品中加入离解剂,从而使得所有待分析物为游离形式。然后将样品置于一定条件下恢复结合亲合力,并在待分析物优选为通过其与待分析物特异性配体相结合而重新形成任何配合物之前,立即测定样品中游离待分析物的浓度。品,其中所述4分析物至;部分地-配合物形式、:然而:所述样品通常是来着哺乳动物,优选为人的血清或血浆样品,而所述配合物是免疫配合物(即,抗原-抗体配合物)。所述待分析物例如可以是对药物例如蛋白质药物诸如治疗抗体作出应答而被诱发出的抗体。本文中所使用的术语"抗体"指天然的,或者部分或完全合成的免疫球蛋白,并且也包括活性片段,包括Fab抗原-结合片段、单价片段和双价片段。该术语也涵盖具有与免疫球蛋白结合域相类似的结合域的任何蛋白。这些蛋白可以来自于天然来源,或者部分地或完全地合成制造。示例性抗体是免疫球蛋白同型和Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dAb和Fd片段。其他需要解离从而能测量待分析物的待分析物配合物(通常为蛋白-配合物)的例子包括PSA(前列腺特异性抗原),PSA是很大程度上为配合物形式的蛋白,并且测定其配合物比例是非常令人感兴趣的。在血液中,约70-90%的PSA与a-l-抗糜蛋白酶形成配合物,但也已知PSA与例如蛋白C抑制剂、a-l-抗胰蛋白和a-2-巨3求蛋白形成配合物。游离PSA占总PSA的比率将是有用的前列腺癌的标志,但目前并没有能用于检测与a-2-巨球蛋白形成的配合物的抗体,在配合物中?8八完全被01-2-巨球蛋白包裹(Balk等.(2003)J.Clin.Oncology21,383-391)。对于其他蛋白配合物大概也是这样的情况。各种试剂和条件可用于实现含有待分析物的配合物的解离。例如,通过将配合物分别置于低pH或高pH条件下的酸化剂或碱化剂能解离免疫配合物。通过将被酸化或被碱化的样品置于基本中性pH下可实现待分析物结合活性的恢复。其他试剂和条件例如包括离液盐、高离子强度或低离子强度、有机盐。本发明的基本特征是在样品经处理例如通过酸化样品或碱化样品的中和从而恢复结合能力(相对于配体以及配合物形成物种)后基本上立即进行待7分析物浓度的测量。"基本上立即"是指待分析物没有时间重新形成可被斗全测到的配合物(取决于待分析物、配合物形成物种和所使用的检马&殳备)。另一方面,必须为处理样品诸如中和从而恢复待分析物结合能力提供足够的时间使a进行测量之前基本完成(这取决于试剂和所使用的检'^i殳备)。然而,确定每个特定检验系统进行测量的最优化时间是在本领域技术人员能力范围之内的。优选为,在测量待分析物浓度时,不超过约5%的待分析物为配合物形式,更优选为不超过约1%。通过测定未经配合物解离的待分析物浓度,可以确定样品中游离待分析物占配合物结合待分析物的比例。优选为,采用其中包括固体载体表面和固定待分析物特异性配体的异质检验系统测量待分析物浓度,其直接或间接检测待分析物(直接检验,包括夹心式检验;或者置换检验)或者可检测待分析物类似物(竟争检验)与固体载体表面的结合量。如本领域中已知,固体栽体表面可具有各种形状,但通常包括小容器或者孔,诸如萄i孔或者优选为流动池的表面积。在待分析物是抗体的情况下,固定配体可以是抗原。另一方面,当待分析物是例如PSA时,固体载体表面可具有固定在其上的例如抗-PSA,并优选a-],抗糜蛋白酶、蛋白C抑制剂、a-l-抗胰蛋白和a-2-巨球蛋白。基于本发明概念的异质检验也可用于所谓的配体垂钓。例如,假设希望知道哪一种物种诸如蛋白在活体内与特定蛋白相结合。可将所述特定的蛋白固定与固体载体表面,在用第一解离配合物处理表面之后立即将含有所述特定蛋白的样品(例如细胞提取物或血浆)与所述表面相接触,然后恢复相互作用的物种的结合亲合力。(^十样品进行如此处理,则所有或者基本所有结合蛋白将与样品中的特定蛋白相结合,结合蛋白与表面的结合则不能得到或者几乎很少得到)。与固定在表面上的特定蛋白相结合的蛋白将通过诸如质谱进行鉴别。如上所述,重要的是在样品经处理恢复待分析物的结合能力之后立即与固体载体表面,或者检测区相接触。在流动池的情况下,后者可因此可包括入口,所述入口通过接头与第一和第二导管相连。含有已离解的配合物的样品可导入第一导管,含有用于恢复待分析物结合能力的流体可导入第二导管,因此两股流体在流动池入口导管的接头处混合,然后所混合的流体流过流动池的4企测区。8检测区和接头之间的距离,和第一和第二导管中的流体iiit应当经选择使得当经混合的流体到达4t测区时,待分析物的结合能力基本恢复,例如经酸化的样品经碱性流体基本中和,但待分析物基本上还未重新形成配合物。任选地是,可通过例如在将混合物重新导向流动池之前将混合流体导入侧通道或环道中,或者通过其他方法改善混合。用于测量待分析物浓度的检测系统可基于标记的使用,或者优选为无标记。优选的是,使用传感器,诸如生物传感器进行^^、测,在此情况下,固体载体表面是(生物)传感器的传感表面。生物传感器被广泛地定义为使用生物识别成分(例如具有固定抗体的层)的装置,所述生物识别成分或者与固态物理化学传感器直4妾相连,或者与和所述传感器相连的移动载体小珠/微粒相连。尽管这些传感器通常基于检测固定层的质量、折射率或厚度的无标记技术,也有一些生物传感器基于一些类型的标记。用于本发明的目的的典型传感器包括但不限于质量检测方法,诸如光学方法和压电或声波法,包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微平衡(QCM)法。示例性光学检测法包括检测质量表面浓度的那些方法,诸如反射-光学法,包括外反射和内反射法,可以是角度、波长、偏光或相解析,例如4务逝波椭圓偏光法和d资逝波光谱(EWS,或内^^射光谱),两者可包括倏逝场增强,该增强是通过表面等离子体共振(SPR),布鲁斯特(Brewster)角折射计、临界角折射计、受抑全反射(FTR)、总内;^_射(STIR)(其可包括散射增强标记),光学波导传感器、外反射成像、倏逝波类成像诸如临界角解析成像、布鲁斯特(Brewster)角解析成像、SPR-角解析成像等等。此外,可提及光度和成^/显微方法,"本身"或者与反射方法相结合,基于例如表面增强拉曼光语(SERS)、表面增强共振拉曼光语(SERRS)、倏逝波荧光(TIRF)和磷光,以及波导千涉仪、波导耗散模式光谱、反射千扰光语(RIfS)、透射干扰仪、全息成像光谱和原子力显微光谦(AFR)。基于SPR和其他检测技术的生物传感器系统目前已可商购获得。示例性SPR-传感器包括上述Biacore⑧仪器。Biaco^M义器的技术方面和SPR现象的详细讨论和可在美国专利第5,313,264号中找到。用于生物传感器传感表面的基质涂层的更多信息在例如美国专利第5,242,828号和第5,436,161号中找到。此外,与1^3.0^@仪器联合使用的生物传感器芯片的技术方面的详细讨论可在美国专利第5,492,840中找到。上述美国专利的全部公开在此以引用的方式引入。参考图1和2,仅为描述性目的,现在将简单描述如何利用Biacore⑧或类似生物传感器系统实现本发明。Biacor^仪器的处理单元通常包括两个输液泵(一个用于保持通过传感器芯片表面的恒定液流,另一个用于处理样品)、自动进样器、集成微流筒(IFC)(含有液体输送通道、样品环和阀门)、检测器单元(包括用于形成和测量SPR响应的光学和电子部件)、由压在传感器芯片上的EFC形成的四个检测流动池,以及用于控制泵、自动进样器和IFC阀门,以及用于SPR信号基本处理的微芯片。检测系统的示例性描述显示在图l中。传感器芯片1具有金膜2,其支撑着俘获分子3(配体),例如抗体,所述俘获分子3暴露于流经流体通道5的含有待分析物4的样品流。连同传感器芯片l,流动通道确定了"流动池",金膜与抗体形成"传感器表面,,。来自光源7的单色p-偏振光6经棱镜8到达玻璃/金属界面9,光线在此被完全反射。由光学检测单元11(光检测器阵歹'J)检测反射光束10的强度。度变化并由此导致折射率变化,从而可检测到SPR响应。绘制出相互作用期间响应随时间变化图则将提供相互作用历程的量化测量。这样的绘图通常称之为感测图。在Biacore',系统中,SPR响应值以共振单位(RU)表示。一个RU表示最小反射光强度的角度的0.0001。的变化,对于大多数蛋白而言,这粗略等于传感器表面上约lpg/mm"-的浓度变化。将液体输送至传感器芯片是由上述IFC所控制,IFC由装在塑料壳中的一系列通道和气动阀门构成。样品由自动进样器注入IFC,IFC与检测器流动池直接相连。图2是81&0^@3000仪器的流动池和样品环部分的示意图,它与在以下实施例中所使用的Biacore⑧T100的IFC相似。在图2中,通道21,以下称之为环通道,在流动池22(为清楚起见仅显示了四个流动池中的一个)的入口端和靠近所述流动池的通道21上的接头23之间以环方式延伸。在典型的IFC中,环通道具有约100iil的容量。样品用入口通道24(自动进样器入口)在远离流动池入口的接头25处与通道21相连。连续液流(緩沖液)用入口通道26在接头27处与通道21.的环端部分相连。流动池22的出口端开口于第一废液通道28。第二废液通ii29则延伸自位于通道21上的接头23和25之间的接头30。第三废液通道31在接头32处与通道21相连。在通10ii21上提供有气动阀门33-36,在样品入口通it24上提供阀门37,在废液通道29和31上分别提供阀门38和39。阀门由压缩空气系统(未示出)进行操作。在接头25和32之间延伸的通ii2:l的一部分可用作以下所述的用于上样的"样品环,,。入口通道24和26以及废谈通ii28、29和31延伸至IFC的远端(相对于流动池22),并于此处与连接器块(未示出)相连,所述连接器块具有两个分别用于緩冲液流和样品/试剂(自动进样针口)的入口。可按两种操作模式进行样品注入,由阀门和泵进行恰当控制的"直接注入"和"环注入"。在直接注射中,阀门34、36和38关闭而其余的阀门开放。将样品通过样品入口通道24和位于接头25和流动池22之间的环通道21的一部分直接泵入流动'池22。另一方面,在环注射中,阀门33、35和38首先关闭而其余阀门开放,样品通过样品入口管道24上样到环通道21中,同时恒定緩冲液流经入口管道26泵入并流过流动池22。然后开放阀门33和35并同时关闭阀门36、37和39,緩品流出样品环并进入流动池22。假定现在将检测样品中的抗体,其中所述样品含有与抗体形成抗原-抗体配合物的抗原,因此至少一部分目标抗体为配合物形式。为实施本发明的方法,图2中的流动池22的传感表面负载了抗原。样品首先经酸化以解离抗原-抗体配合物,然后经酸化的样品溶液被中和以恢复抗原的结合能力,含有游离抗体的经中和的样品溶液流经流动池以使得抗体与传感表面的固定抗原相结合。为确保在经中和的溶液到达流动池传感表面之前,没有出现任何抗原-抗体配合物的重新形成,如上所述,经S臾化的样品和中和溶液的混合应在靠近流动池入口的地方发生。已证实在81300化*仪器外混合溶液并例如以如上所述的直接注入方式注入经中和的样品将使得在到达流动池之前样品中过多地重新形成配合物。因此,开发了改进的诸如模式。在此模式中,参考图2,将中和溶液通过样品入口24导入并按照上述样品上样的相同方式上样到样品环21中,即阀门33、35和38关闭而其余阀门包括开放。如上所述,即通过打开阀门33和35并关闭阀门36和39并将緩沖液通过入口通if26泵入环通if21.,从而利用流经入口26的緩冲液将中和溶液诸如流动池22,同时通过样品入口24提供经酸化的样品溶液。经酸化的样品溶液和中和溶液因此在接头25处相遇并开始混合。通过改变流经样品入口24和入口26的液流的流速比可以改变经酸化的样品和中和溶液的比例。另一种方式,样品溶液当然可以装载到样品环中,并通过样品入口24提供中和溶液。如何混合两股流体的更详细的示意图在图3、4A和4B中示意性地描述,每幅图显示了微流系统的一部分,所述微流系统包括具有侧通道41和42的第一通道40,和具有侧通道44的交叉通道43。提供阀门(未示出)以控制流经通道系统的泵入流和流体的流经通路。图3显示了混合变化方式,其与4艮据以上图2所描述的混合方式相对应,其中直接混合两种溶液并直接导入流动池。酸化样品溶液45导入侧通道42,中和溶液46导入侧通道41,反之亦然。两种溶液在其流向流动池(未示出)的途中通过通道44混合。一种混合变化方式描述在图4A和4B中,其中溶液混合物在重新导向流动池之前首先导入侧通道(或环)。经酸化的样品溶液45和中和溶液46分别导入侧管道42和41。然而,在第一步(图4A)中的混合溶液45和46并未如图3直接经过侧通道44进入流动池,而是在通道43中流动经过侧通道4妻头。液流然后被截停并反向将混合流体泵入并流经通道44至流动池(图4B)。每次小流量重复进行从而使得两种溶液不会过长时间混合(以防止重新形成配合物),即,多次脉沖式的而不是长时间注入的混合流体将流入流动池。与图3的混合变化方式相比,图4A和4B中的混合过程将确保两种溶液相互更好地混合,从而因此减少与传感器芯片的非特异性结合。当然,还有大量其他方法改进微流系统中的混合。这些包括例如,一方面,涉及通道系统以包括静态压缩、弯曲等破坏层流,或者另一方面,采用主动搅拌器。在后一种情况中,诸如在上述Biacore②3000和Biacore⑧T100仪器的微流系统中存在的阀门膜,膜可通过振动作为致动器形成破坏层流的搅动。另一种方式,一股液流或者两股液流均被间歇扰动从而分割样品和中和緩沖液,优选为被分割成非常小的液段。在另一种方式包括使用将流体切分为微段的交替阀门、微型推进器、非稳定翻板、磁f生搅拌器、磁性小珠等。替代主动搅拌器,也可能使用外部场,诸如超声场或电场加速混合。在以下实施例中,为描述而非限制的目的更详细具体地公开本发明的各个方面。实施例12仪器T100(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)。该仪器基于传感器芯片的金表面上表面等离子体共振(SPR)检测,其使用微流系统(集成微流筒-IFC)使样品和緩沖液一个接一个地或者连续地流经四个独立的检测流动池,标为Fcl至Fc4。通过Biacore⑧T100仪器中的入坞机械装置挤压IFC与传感器芯片相接触。传感器芯片使用CM5系列(BiacoreAB,Uppsala,Sweden),其包括具有羧曱基修饰葡聚糖聚合物的共价连接水凝胶基质(约100nm)的金涂覆(约50nm)表面d仪器输出为"感测图",其为作为时间函数的检测器响应图(以"共振单位"RU进行测量)。IOOORU的增加对应于传感器表面上约:Ing/mn^的质量增力口。在以下实施例中,用连续排列的流动池Fcl至Fc4进^"分析。采用"原型注入",按照与上述参考图2所述的相似方式注入流动池期间,在邻近IFC的流动池处混合两种溶液。流动緩冲液使用18-1^+(0.01m:MHEPES、0.15MNaCl、3mMEDTA和0.05。/ov/v表面活性剂P20,pH7.4)(BiacoreAB)。除非另外指明,样品流速为5pl/min,中和溶液流速为30jal/min,温度为25。C。实施例l在高浓度HSA存在下緩沖液中少量抗-HSA抗体的测量人血清白蛋白(Sigma-Aldrich,密苏里,美国)在IOmM乙酸酉旨pH5.0中稀释至50|ig/ml,并采用标准胺偶联(胺偶联试剂盒,BiacoreAB)固定于BiacoreT100中的流动池3(Fc3)至约9kRU。制备含有UOng/mlHSA(Sigma-Aldrich)的:lOOpl样品和不同浓度的抗-HSA(内部试剂)。对照则使用不含有HSA的样品。,样品用50^d的0.2M甘氨酸pH2.8进行酸化。然后将每个样品注入Biacore⑧TK)0,使用原型注入将样品与HBS-EP+(0.1MHEPES、0.15MNaCl、3mMEI)TA和0.05。/。v/v表面活性剂P20,pH7.4-BiacoreAB)以15:85的比例混合,并在依次通过IFC的所有流动池之前中和样品。在Fc3中进行检测(之前的试验已经表明酸性样品和中和溶液的混合在流动池中为最佳,即Fcl和Fc2中,样品的中和未完成,而在Fc4中,开始重新形成配合物)。用10mM甘氨S臾p:H2.0(BiacoreAB)进行HSA的再生。结果如以下拟所示。13表I<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表中所示,在50倍摩尔过量的HSA的存在下可检测到5(ig/ml抗-HSA。实施例2卩-2-微球蛋白存在或不存在时緩沖液中抗-2-微球蛋白的测量采用标准胺偶联(胺偶联试剂盒,BiacoreAB)将IOmM乙酸酯pH4.5(BiacoreAB)中的20(ig/ml卩-2-微球蛋白((32(i)(内部试剂)固定于Biacra^T100中的流动池3(Fc3)至约1.7kRU。制备含有IOOjng/ml抗-卩-2-微球蛋白(抗-卩2^1)(内部试剂)的100^緩沖液样品和不同浓度的在1丑38-已.1)+(BiacoreAB)中的p-:Z-微球蛋白(p2〖1)(内部试剂)。緩冲液样品然后用50jJ的0.2M甘氨酸,pH2.8进行酸化。对照样品未被酸化。然后将每个样品注入Biacore⑧T100,使用原型注入将样品与HBS-EP十(BiacoreAB)以]5:85的比例混合,并在依次通过I:FC的所有流动池之前中和样品。用甘氨酸pH1.5(BiacoreAB)进行再生。结果如以下勤I所示。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>乂人表中可以看到,对于经酸化的样品,得到大约相同的响应水平,而与是否加入p2p无关(抗-p2jii和l32H的配合物被破坏),而对照样品(未经酸化),当存在(32以与抗-(32ji形成配合物)时,响应水平显著降低。实施例3卩-2-微球蛋白存在或不存在时人类血浆中中抗-2-微球蛋白的测量采用标准胺偶联(胺偶联试剂盒,BiacoreAB)将IOmM乙酸酯pH4.5(BiacoreAB)中的20吗/ml卩-2-微球蛋白(卩2fi)(内部试剂)固定于Biacore⑧T100中的流动池3(Fc3)至约1.7kRU。制备IOOjil人类血浆样品,其或者含有(i)50pg/ml抗-p2p,或者(ii)50(ig/ml抗-卩2(i和5(ig/ml卩2p,以及1%v/v表面活性剂P20(BiacoreAB)。(人类血浆样品通常含有约l(ig/ml的卩2(!)。血浆样品然后经15pl的lMHCl酸化(得到pH2-3)。然后将每个样品注入Biacore⑧T100,使用原型注入将样品与0.1MK2HP04,pH9.0,以及1%v/v表面活性剂P20(BiacoreAB)以15:85的比例混合,并在依次通过IFC的所有流动池之前中和样品。用甘氨酸pH.5(BiacoreAB)进行再生。结果如以下表m所示。表in血浆编号含有抗-(32|1的经酸化的含有抗-p2^i和(32p的经酸化的样品样品(RU)(RU)195314651419146014151954121311821175117919551142118111711301956101098199198019571144111811321120195811721142116411431961884866879878由表中可知,对于每个重复样品抗体响应基本一致,而与抗体是否与(32p形成配合物无关。血浆样品间不同的响应水平是由于在不同场合下使用不同的传感器芯片进行试验的事实。这由以下表IV所证实,其描述了如上所述但同时在同一传感器芯片上测试三个血装样品得到的结果。血浆样品含有l0015lag/ml抗-卩2p和10/。v/v表面活性剂P20。对照则使用在含有HBS-EP+,pH7.4中含有100pg/ml抗-(32p(内部试剂)和1%v/v表面活性剂P20的緩沖液样品。表IV血浆编号含有抗-(3&的经酸化的样品(RU)1953203919581836196117461958181219531857緩冲液1949由表中所示,在不同的血浆样品之间存在很好的一致性。血浆样品值也很好地对应于緩冲液中的抗体值。应当理解本发明并非受限于以上所述的本发明的具体实施方式,本发明的范围由所附权利要求进行确定。1权利要求1.测定流体样品中待分析物总浓度的方法,其中至少一部分待分析物以与待分析物结合物种相结合而成的配合物存在,所述方法包括以下步骤a)将样品置于降低待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力的条件下从而足以基本离解任何待分析物配合物并提供基本均为游离形式的待分析物,b)将样品置于恢复待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力的条件下,和c)在结合亲合力恢复之后,但在待分析物基本重新形成任何配合物之前,立即测定所述样品中游离待分析物浓度。2.如权利要求l所述的方法,其中所述样品中的游离待分析物的测定包括将所述样品与其上固定有待分析物结合配体的固体载体相接触从而使待分析物与固定配体相结合。3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述在步骤a)中降低结合亲合力和步骤b)中恢复结合亲合力的-M牛包括改变所述样品的pH值。4.如权利要求l、2或3中所述的方法,其中所述配合物是可酸解离的配合物,步骤a)包括酸化所述样品,和步骤b)包括中和所述经酸化的样品。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述配合物是免疫配合物。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述待分析物是治疗抗体的抗体,以及所述样品含有所述治疗抗体。7.如权利要求l至6中任一项所述的方法,其中在权利要求l的步骤c)中,待分析物浓度的测定是采用无标记检测技术进行测定的。8.如权利要求7所述的方法,其中所述无标记检测技术包括倏逝波传感,尤其是表面等离子体共振(SPR)。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其中至少步骤c)是在流动池中进行的。10.如权利要求9所述的方法,其中所述流动池包括具有固定配体的检测区,通过接头与第一和第二导管相连的入口,并且其中权利要求l的步骤b)包括使含有已解离的待分析物配合物的样品在第一导管中流动,使能恢复待分析物结合能力的流体在第二导管中流动,从而使得两股流体在流动池入口导管的接头处相混合,然后所混合的流体流过流动池的检测区。11,如权利要求10所述的方法,其中(i)检测区和接头之间的距离,和(U)第一和第二导管中的流体《dt经选择使得当经混合的流体到达检测区时,待分析物的结合能力基本恢复但4寺分析物基本上还未重新形成配合物。12.如权利要求10或1l所述的方法,其中在第一导管中流动的流体是经酸化的样品,在第二导管中流动的流体是石成性流体。13.如权利要求11和12所述的方法,其中,当经混合的流体到达所述检测区时,所述经酸化的样品已基本被中和但待分析物基本上未重新形成配合物。14.测定样品中配合物结合待分析物浓度的方法,所述方法包括以下步骤a)根据权利要求l至13中任一项所述的方法测定样品中待分析物总浓度;和b)测定所述样品中游离待分析物的浓度,15如权利要求:所述的方法,其^在步骤a)中待分析物总量和步骤b)中游离待分析物的测定包括将所述样品与其上固定有待分析物结合配体的固体载体相接触从而使待分析物与固定配体相结合。16.测定待分析物与含有所述待分析物的样品中的一种或多种物种相结合形成配合物的能力的方法,所述方法包括步骤分析物,^、、土口.''—"、丄、,,、b)将样品置于恢复待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力的糾下,c)在结合亲合力恢复之后,但在待分析物基本重新形成任何配合物之前,立即将样品与其上固定有待分析物的固体载体相4妄触,和d)分析与被固定的待分析物相结合的物种。全文摘要本发明涉及测定流体样品中待分析物总浓度的方法,其中至少一部分待分析物以与待分析物结合物种相结合而成的配合物存在,所述方法包括以下步骤a)将样品置于一定条件下降低待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力从而足以基本离解任何待分析物配合物并提供基本均为游离形式的待分析物,b)将样品置于一定条件下恢复待分析物和待分析物结合物种之间的结合亲合力,和c)在结合亲合力恢复之后,但在待分析物基本重新形成任何配合物之前,立即测定所述样品中游离待分析物浓度。还公开了测定样品中配合物结合待分析物浓度的方法。文档编号G01N21/05GK101583872SQ200780034357公开日2009年11月18日申请日期2007年9月12日优先权日2006年9月14日发明者A·拉森,H·伯林,H·鲁斯,T·贾赫德申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1