专利名称：：使用吸附于滤纸上的样品的筛选方法使用吸附于滤纸上的样品的筛选方法发明领域本发明公开了一种诊断试验和方法，其用于将血液或者另一种生物液(biologicalfluid)或样品与试验化合物混合，并将血液点样在滤纸上以便随后分析试验化合物对血液或液体样品的作用。一般背景血液是主要由血浆和细胞组成的复杂的混合物(1-3)。通过离心和其他技术可将血浆与细胞分离。如果将血浆静置，它将通过凝固凝结成块，从而可分离血清与血凝块。可通过加入不同的抗凝剂(包括EDTA、EGTA、肝素、柠檬酸盐和其他剂)抑制凝固。血液的细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、红细胞以及包括造血干细胞的各种干细胞。此外由巨核细胞产生的血小板也大量存在。血浆含有上千种蛋白质，基本上含有人类蛋白质组的任何蛋白(4，5)。其中一些蛋白参与运输、血液凝块或免疫防御，而其他的起到血液细胞和组织细胞间信号分子的功能。尤其，免疫系统的细胞(树突细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)的活性通过信号分子(例如，白细胞介素、趋化因子、生长因子)、组织抗原和受体的复杂网络来调控(3,6-9)。免疫系统细胞的活性和特异性可通过几种方法和测定来研究和定量。T细胞、B细胞和其他细胞可通过使用细胞表面标记分子的抗体的荧光激活细胞分选术定量(10，11)。特异的T细胞可通过细胞毒性测定、铬释放测定和细胞因子释放测定(例如ELISPOT)(12-16)以及通过使用不同的肽-主要组织相容性复合物(MHC)蛋白构建体(constmct)来测量(17,18)。B细胞的活性可通过测定从B细胞释放的特异性抗体的水平来测量(19，20)。测量从血液细胞释放的信号分子中的主要问题是与定量相关的贮藏和运输的问题。许多血液成分(例如细胞因子)是不稳定并短寿命的，导致其在孵育、贝i藏和运输期间降解。由于这一原因，比较性分析和诊断试验必须在中心实验室的血液收集和孵育后立刻完成。理想地，所有待比较的样品应使用校准的仪器连续分析。这并不总是可行的，例如，当在偏远地区采集血液样品时，当进行体外和体内时间性研究时或当比较来自大量不同个体的样品时。这一问题的一种解决方法是在运输和贮藏时冷冻样品。然而，这一方法不能保证成分的保存，需要巨大的冷冻、运输和贮藏容量，需要在每次进行分析时解冻、并且容易受到电力供应短缺的损害。由于这一原因，需要血液和生物样品保存的可靠方法，并且需要采用可靠的样品保存与样品处理结合的诊断试验。使用滤纸进行血液点样以用于随后的分析是众所周知的，例如用于新生儿血液样品的遗传代谢疾病分析(21)。这样的优点是血液成分的良好保存、容易运输和容易长期lt藏。然而在与试验化合物孵育后使用滤纸以及类似方法来干燥和贮藏血液样品以前尚未#皮^使用或描述过，可能因为这被预期为不可能或不可行的。发明概述本发明公开了一种诊断试验和方法，其用于将血液或另一种生物液与试验化合物混合，并将血液点样在滤纸上以便干燥、保存和随后在此后的任何时间分析试验化合物对血液的作用。发明的详细公开内容本发明公开了一种诊断试验和方法，其包括将血液或另一种生物液样品与试验化合物混合，并将血液点样在滤纸上以便随后分析试验化合物对血液的作用。所述生物液可以是脑脊液、腹膜液(peritonealfluid)、嚢液(cystfluid)、羊膜液(amnioticfluid)、灌洗液(lavagefluid)、唾液、细胞提取液或组织提取液。所述化合物在以下中选择氨基酸、肽、蛋白质、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂质、脂蛋白、粘多糖、激素、类固醇、维生素、影响血液而导致血液组成改变的低分子量合成或天然化合物，例如毒素、变应原、自身抗原、细菌蛋白或多糖、病毒蛋白、真菌蛋白或多糖、寄生虫蛋白或多糖、细菌脂多糖或与疾病相关的任何其他化合物。依照本发明的诊断试验和方法分析样品的细胞因子、趋化因子和生长因子和/或神经递质以及其他多肽和蛋白的含量，所述蛋白例如CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、特异性(即抗原特异性)抗体、运铁蛋白、白蛋白和/或运曱状腺素蛋白。在诊断试验中，通过免疫测定、生物测定、质谱分析法、HPLC、GC、GC-MS来分析试验化合物的作用，这些测定和分析法例如ELTSA测定、FLISA测定、DELFIA测定、Luminex测定、发光测定、电化学发光测定、闪烁亲近测定(scintillationproximityassay)、》文射免疫测定、MALDI-MS、ESI-MS和开放式MS(ambient-MS)(例如DESI-MS)。本发明还公开了用于将血液或者另一种生物液或样品与试验化合物混合，并将所述混合物点样在滤纸上以便在随后分析试验化合物对所述血液、生物液或样品的作用之前贮藏、运输和/或处理的方法。定义分析物意指可通过分析方法检测或定量的任何化合物。试验化合物的作用纟皮理解为其和血液或者任何其他生物液或样品的成分相互作用以导致血液组成的任何种类的变化。干燥意指水的去除。滤纸意指适于收集、干燥并贮藏血液的任何一张纸、布或其他材料。PKU纸意指用于对新生儿的血液样品进行苯丙酮尿症筛选的纸/滤纸。点样意指将血液样品或者任何其他生物液或提取液或样品施加在一张适于精确血液采样的标准化纸上。通过将固定体积的血液施加在一张纸上或通过将血液施加于纸直到已界定的区域辟皮血液覆盖来进行点样。接下来，将所述纸完全千燥并在低湿度条件下直接贮藏或运输至贮藏处以便进行随后的分析。试^Mt合物意指可与血液或者任何其他生物液或样品混合或者可被加入其中的任何化学的、生物的或自然界的化合物或物质。试验样品意指试验化合物的任何制剂或混合物。使用了以下的缩写BCG意指卡介苗(BacillusCalmette-Guerin)BDNF意指脑源性神经营养因子BSA意指牛血清白蛋白CRP意指C反应蛋白DBSS意指干血斑点样品(driedbloodspotsample)EGF意指表皮生长因子ELISA意指酶联免疫吸附测定ELISPOT意指酶:f关免疫斑点测定ESI意指电喷雾电离FLISA意指荧光免疫吸附测定(fluorescence-linkedimmunosorbentassay)GC意指气相色语G-CSF意指粒细胞集落刺激因子GM-CSF意指粒细胞巨噬细胞集落刺激因子HPLC意指高效液相色语IFN意指干扰素Ig意指免疫球蛋白IGF意指胰岛素样生长因子Il意指白细胞介素LPS意指脂多糖MALDI意指基质辅助激光解吸/电离M-CSF意指巨噬细胞集落刺激因子MCP意指单核细胞趋化蛋白MHC意指主要组织相容性复合物MIF意指巨噬细胞移动抑制因子MIP意指巨噬细胞炎性/抑制蛋白MMP意指基质金属蛋白酶MS意指质谱分析法NT意指神经营养蛋白PBS意指磷酸盐緩沖盐水(phoaphate-bufferedsaline)PCR意指聚合酶链反应PKU意指苯丙酮尿症(phenylketoneuria)PPD意指纯化蛋白衍生物TGF意指转化生长因子TNF意指肿瘤坏死因子TREM意指骨髓细胞上表达的触发受体VEGF意指血管内皮生长因子本发明公开了一种诊断方法，其中起动试验化合物和血液样品或者任何其他生物液或样品之间的反应，使反应持续一定时间，然后通过将试验样品在滤纸上点样和/或干燥结束反应，接着将所述滤纸随后用于分析试验化合物对血液、液体或样品以及它们的^壬何成分的作用。在一个优选的实施方案中，使用标准的抗凝固EDTA、肝素或柠檬酸盐(citrate)血液容器或玻璃器皿从人抽取血液样品(例如10ml)。血液样品被分为两等4分，并将试验化合物加入血液的一个等份中，而另一个等份被用作对照参考，其中只加入溶解试验化合物的緩冲液/溶液。试验化合物还可作为固体粉末加入，以直接溶解在血液中。伴随或不伴随混合或搅拌，将血液样品于室温或规定的温度(例如5°C、20°C、37°C)孵育。于一定时间间隔(例如0、lmin、2min、5min、10min、20min、30min、lh、2h、3h、4h、5h、10h、15h、20h、24h、48h)从血液样品抽取等份并点样在滤纸(例如，PKU纸)上，并使其尽快干燥。干燥之后，可将滤纸立即用于分析或贮藏以用于随后的分析。在一个特定实施方案中，在于实验室中贮藏或分析前，滤纸可^皮运输(例如通过平信)一定的距离。如下完成血液的点样、千燥和贮藏用毛细管、吸液管或类似物将血液在滤纸上点样成一层，并于室温(例如在通风良好的橱内或在开放位置(ambientplace))干燥。为了贮藏，可将滤纸保存在纸信封、塑料袋或类似的容器，优选气密容器中以保持尽量低的湿度。-20°(:或更低的贮藏温度是优选的，但只要保持纸千燥，室温也是可以的。无论如何，只要保持低的湿度以避免样品的变质，贮藏就可以于室温或低于0。C的温度(例如-20"C、-50°C、-80。C、-180。C)下进行。可将样品保存持久的一段时间(例如几个月-几年)。试验化合物可以是影响血液而导致血液组成产生可测量变化的任何化合物(例如，氨基酸、肽、蛋白质、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂质、脂蛋白、粘多糖、激素、类固醇、维生素、低分子量的合成或天然化合物)。尤其有用的试验化合物是毒素、变应原、自身抗原、细菌蛋白和多糖、病毒蛋白、真菌蛋白和多糖、寄生虫蛋白和多糖、细菌脂多糖和与疾病相关的任何其他化合物。使用这些试验化合物将得到关于某些化合物如何对细胞以及细胞间的信号起作用的重要知识。在一个实施方案中，所述诊断试验和方法用于测定有毒化合物对血液的作用，例如作为毒理学试验程序或临床前的试验程序的部分。可通过大量不同的技术(例如免疫测定、生物测定、质谱分析法、HPLC、GC、GC-MS)来进行千血样品的分析。优选的分析方法是ELISA测定、FLISA测定、DELFIA测定、Luminex测定、发光测定、电化学发光测定、闪烁亲近测定、；故射免疫测定、MALDI-MS、ESI-MS、PCR。可通过使用任何适合的緩冲液或溶剂来进行DBSS的提取。在一个优选的实施方案中，从滤纸上的DBSS或标准物中穿孔取出滤纸圓片(例如直径为3.2mm)，并将其一起放于微量滴定孔中。将或180^1(分别用于两份或三份测量)提取緩冲液、含有"具有乙二胺四乙酸(EDTA)的完全蛋白酶抑制剂混合物，，(Roche,Germany)的PBS(每25ml测定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)溶解1片)力。至每个孔，并在设定为600rpm的平板振荡器上于室温避光提取分析物60分钟。在本发明的一个实施方案中，通过Luminex测定如下测量分析物依照制造商的使用说明书进行捕获抗体对羧基化珠(Luminexcorp.,AustinTexas,US)的偶联将2.5X106个珠用活化緩冲液(0.1mol/l磷酸钠，pH6.2)洗涤两次，重悬于80^1活化緩冲液中，并用声波处理直到观察到珠的均一分布。加入均在活化緩沖液中稀释至50mg/ml的10^1N-羟基硫代琥珀酰亚胺(硫代-NHS，来自Pierce,Rockford,US)溶液和l-乙基-3(3-二曱基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC，来自Pierce)以稳定反应并活化珠。混合后，将珠于室温在黑暗中旋转孵育20min。随后将活化的珠用偶联缓冲液(mmol/12(N-吗啉代乙磺酸，MES)，pH5.0)洗涤，加入500^1不含叠氮化物的捕获抗体溶液(lOO^g/ml)并旋转孵育2小时或过夜。通过于4。C在3升PBS中过夜透析(Slide-A-Lyzer⑧透析卡，MWCO=10000,来自Pierce)从抗体中除去叠氮化物。孵育后，将珠用清洗緩冲液(含有0.05%Tween20的PBS)洗涤并重悬于75pi封闭/贮藏緩冲液(含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%叠氮化钠的PBS)中。用血球计对所述珠进行计数，用封闭/贮藏緩沖液调至20X106个珠/ml的浓度并于2-8'C避光贮藏。如下进行测定程序通过用测定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)预湿来准备滤板(MultiscreenMABVN1.2pm96-孔，Millipore,BurlingtonUS)。在提取后向每个孔中加入从微量滴定孔中吸出的样品(lOOpl分为两等份或150^1分为三等份)和50^1轭合捕获抗体的珠的悬浮液，在含有1%豚鼠/猪血清(1:1)的测定缓冲液中每种分析物1500个珠。捕获抗体与它们相应的抗原在r/2小时的孵育期间反应，并经由将》朱通过使用了MultiScreenVacuumManifold(M川ipore)的孔过滤从珠去除未结合的物质。用每孔200jil清洗緩沖液(含有0.5%Tween的PBS)洗涤珠两次。将目前捕获的抗原与各以1:1000在测定緩冲液中稀释的生物素酰化的检测抗体的混合物(50pl)反应r/2小时。将50pl链霉抗生物素-藻红蛋白于测定緩冲液中20昭/ml的溶液(MolecularProbes,TheNetherlands)加至孔并将孵育再持续30min。最后将珠用200ji1清洗緩冲液洗涤两次并重悬于清洗緩沖液中。振荡15min后，依照制造商的使用说明书在Luminex10(FM上分析样品。在一个优选的实施方案中，分析了样品的细胞因子、趋化因子和生长因子(侈'J^口，白细月包介素t者^口11-1、11-2、11-3、11-4、11-5、11-6、11-7、11-8、11-9、11-10、11-11、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、11-21、11-22、11-23、11-24、11-25、11-26、IFN、TNF、MCP、MIP、MMP-9、TREM、M匿CSF、G-CSF、GM-CSF，趋化因子诸如CC、CXC，生长因子诸如TGFa、TGFP、EGF、VEGF、IGFI、IGFII、胰岛素，炎症介质诸如组胺、前列腺素、白三烯、血栓烷)和/或神经递质的含量。在另一个实施方案中，分析了样品的标准和特异性临床参数例如CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、特异性(即抗原特异性)抗体、运铁蛋白、白蛋白、运甲状腺素蛋白等。在另一个实施方案中，待分析的生物液是脑脊液、腹膜液、嚢液、羊膜液、灌洗液、唾液、细胞提取液或组织提耳又液。在又一个实施方案中，细胞的来源是细胞系或分离的血液细胞、处理的细胞(manipulatedcell)、转基因的细胞、转染的细胞，或者任何细胞类型或者改变或处理的细胞类型。本发明可应用于来自包括转基因动物的任何物种和类型的动物(例如，人类、猴、小鼠、大鼠、牛、犬、马、猫、禽类、鱼类和任何其他物种)的血液和其他体液和组织提取液。在一个特定的实施方案中，所述试验化合物被固定在固体表面(例如滤纸)，然后用血液样品或者生物液或提取液孵育。孵育之后，将滤纸千燥或者将血液点样在滤纸上并干燥。在本发明的一个特别的用途中，调节血液、生物液或提取液的体积以使其与固定的化合物或在溶液中的化合物反应固定的时间而同时在滤纸上千燥。在本发明的一个用途中，向活体试验人或患者注入试验化合物并于一定时间间隔从所述人抽取血液样品，将血液样品点样在滤纸上，干燥并随后分析。可使用标准的针和装置从试验个体中抽取血液样品并由训练过的人员完成。但也可使用允许局部个体取样的设备完成血液的抽取。实施例实施例1.血液的抽取、孵育、点样、千燥和贮藏使用无菌的针和注射器从试验人抽取10ml血液放入抗凝试管。使用无菌抗凝试管将血液分为lml的等份。将来自一个样品的血液样品直接点样在纸上直到充满标记圈(使用的体积为约0.2ml)。向其他试管中，以预定的浓度加入^f寺试^r的样品并将试管在37。C或室温下孵育lh。之后将来自每个样品的0.2ml样品点样在滤纸上。用毛细管、吸液管或类似物将血液样品在滤纸上点样成一层并于室温(例如在通风良好的橱中或在开放位置)干燥。然后将样品在低湿度下于-20。C或室温贮藏，以使纸保持干燥。为了这一目的，可使用一般的冷冻设备并且可将纸保存在信封或干燥器内。实施例2.滤纸的提取和分析从滤纸上的DBSS或标准物中穿孔取出两片滤纸圓片(直径为3.2mm)，并将其一起^:于微量滴定孔中。将140pl或180^1(分别用于两份或三份测量)提取緩冲液、含有"具有乙二胺四乙酸(EDTA)的完全蛋白酶抑制剂混合物"(Roche,Germany)的PBS(每25ml测定緩冲液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)溶解1片)加至每个孔，并在设定为600rpm的平板振荡器上于室温避光提取分析物60分钟。实施例3.Luminex测定抗体与珠的偶联依照制造商的使用说明书进行捕获抗体对羧基化珠(Luminexcorp.,AustinTexas,US)的偶联将2.5X106个珠用活化緩沖液(0.1mol/1磷酸钠，pH6.2)洗涤两次，重悬于80pl活化緩沖液中并用声波处理直到观察到珠的均一分布。加入均在活化緩沖液中稀释至50mg/ml的10^1N-羟基石克代琥珀酰亚胺(硫代-NHS,来自Pierce,Rockford,US)溶液和10pl1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC，来自Pierce)以稳定反应并活化珠。混合后，将珠于室温在黑暗中旋转孵育20min。随后将活化的珠用偶联緩冲液(mmol/12(N-吗啉代乙磺酸，MES),pH5.0)洗涤，加入500^1不含叠氮化物的捕获抗体溶液(100昭/ml)并旋转孵育2小时或过夜。通过于4。C在3升PBS中过夜透析(Slide-A-Lyzer⑧透析卡，MWCOIOOOO，来自Pierce)从抗体中除去叠氮化物。孵育后，将珠用清洗緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS)洗涤并重悬于75^1封闭/贮藏緩冲液(含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%叠氮化钠的PBS)中。用血球计对所述珠进行计数，用封闭/贮藏緩沖液调至20X106个珠/1111的浓度并于2-8X:避光贮藏。实施例4.测定程序通过用测定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)预湿来准备滤板(MultiscreenMABVN1.2pm96-孔，Millipore,BurlingtonUS)。在提取后向每个孔中加入50^1从微量滴定孔中吸出的样品(lOOpl分为两等份或150nl分为三等份)和50pl轭合捕获抗体的珠的悬浮液，在含有1%豚鼠/猪血清(1:1)的测定緩沖液中每种分析物1500个珠。捕获抗体与它们相应的抗原在r/2小时的孵育期间反应，并经由将珠通过使用了用每孔200W清洗i爰沖液(含有0.5%Tween的PBS)洗涤珠两次。将目前捕获的抗原与各以1:1000在测定緩冲液中稀释的生物素酰化的检测抗体的混合物(50^1)反应"/2小时。将5(^l链霉抗生物素-藻红蛋白于测定緩冲液中20pg/ml的溶液(MolecularProbes,TheNetherlands)加至孔并将孵育再持续30min。最后将珠用200^1清洗緩冲液洗涤两次并重悬于125pl清洗緩冲液中。振荡15min后，依照制造商的使用说明书在Luminex100上分析样品。实施例5.Gc球蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素和脂多糖(LPS)的细胞因子释放试验将以下851)lmlEDTA-血液(人X)+30pl批次11的Gc2)lmlEDTA-血液(人X)+30^1批次13的Gc3)lmlEDTA-血液(人Y)+批次11的Gc4)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1批次13的Gc5)lmlEDTA-血液(人X)+30^1PBS6)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1PBS7)lmlEDTA-血液(人X)+30pl批次11的Gc+50^1来自肺炎克雷白4干菌(X/eZw,'e〃cf/wewmow/ae)的LPS(5mg/ml)8)lmlEDTA-血液(人X)+50|il来自肺炎克雷白杆菌的LPS(5mg/ml)9)lmlEDTA-血液(人Z)+30nl白喉类毒素(5.78mg/ml)10)lmlEDTA-血液(人Z)+30^1破伤风类毒素(993Lf/ml)11)lmlEDTA-血液(人Z)+30[il来自肺炎克雷白杆菌的LPS(5mg/ml)12)lmlEDTA-血液(人Z)+来自鼠伤寒沙门菌(&/附o"e〃a/少p/n'mw/7'wm)的LPS(5mg/ml)13)lmlEDTA-血液(人Z)+30plmilliQ水1min(A)、2h(B)、24h(C)和48h(D)后，将8种溶液中的每一种的180^点样在滤纸上并千燥。随后(于-20。C贮藏14天后)使用Luminex技术分析样品的细胞因子含量(22)。结果示于表l。从表中可以看出LPS引起了IL隱lb、TL-6、IL-8、MIP-la、MIP-lb大量增加，同时可看到其他分析物较小但统计学上显著的变化。白喉类毒素(diphteriatoxoid)引起了MIP-lb的增力口。MGc球蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素和脂多糖(LPS)的细胞因子释放试验(细节见实施例5)。除非另外标明，所有结果以pg/ml为单位。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例6.白喉类毒素、破伤风类毒素、结核菌素PPD和BCG的细胞因子释放试验。混合下列6种溶液并于37。C孵育1)1mlEDTA-血液(人Y)+30^1白喉类毒素(5.78mg/ml)2)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1破伤风类毒素(993Lf/ml)3)lmlEDTA画血液(人Y)+30^1BCG(4隱16x106cfu/ml)4)lmlEDTA-血液(人Y)+3(^1结核菌素PPD(0.4(ig/ml)5)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1milliQ水6)lmlEDTA-血液(人Y)+30|xlBCG疫苗溶剂(对照)lmin(A)、2h(B)、4h(C)、6h(D)和24h(E)后，将6种溶液中的每一种的180^1点样在滤纸上并干燥。随后(于-20"C贮藏30天后)使用Luminex技术分析样品的细胞因子含量(22)。结果示于表2。从表中可以看出，与对照相比BCG引起了IL-8和MIP-lb大量增加。类似地，白喉类毒素、破伤风类毒素和PPD引起了IL-8和MIP-lb增加，同时可看到其他分析物较小但统计学上显著的变化。表2.白喉类毒素、破伤风类毒素、结核菌素PPD和BCG的细胞因子释放试验(细节见实施例6)。除非另外标明，所有结果以pg/ml为单位。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>参考文献1.BeckWS(编辑).Hematology(血液学).MITPress1985.2.BloomAL,Thomas,DP(编辑).Haemostasisandthrombosis(痴血和血栓形成).Longman1987.3.JanewayCA,TraversP,WalportM,CapraJD.Immunobiology(免疫生物学).Elsevier1999.4.ThadikkaranL,SiegenthalerMA,CrettazD,QuelozPA,SchneiderP,TissotJD.Recentadvancesinblood-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