治疗幽门螺旋菌感染的新方法

专利名称：治疗幽门螺旋菌感染的新方法
治疗幽门螺旋菌感染的新方法
技术领域：
本发明涉及作为幽门螺旋菌(He//c^^"^^_y/0W) Y谷氨酰基转肽基 酶(HPGGT)片段的多肽；包含它们的免疫原性组合物，包含HPGGT失 活形式的免疫原性组合物；所述多肽和HPGGT失活片段的用途；针对和 特异性结合所述多肽和HPGGT失活形式的抗体、适体、和镜像异构适体 (spiegelmer);用于识别候选药物的方法，用于开发疫苗的方法；HPGGT 的配体的用途。
幽门螺旋菌是革兰氏-阴性病原菌，其选择性定居于人的胃粘膜，并 普遍存在于世界人口的多于50%中。该感染通常持续一生，并在胃和十二
指肠溃疡、胃粘膜-相关淋巴样组织淋巴瘤、和胃癌的发病机制中有所涉及。 幽门螺旋菌感染的标志是慢性的活跃性胃炎，其特征在于嗜中性粒细胞、 淋巴细胞、和单核细胞/巨噬细胞对粘膜的密集浸润。若干研究提供了这样 的证据，即在幽门螺旋菌相关胃炎过程中，增加并活化T-辅助1型细胞， 显示出体内上调CD25和CD69。还引起了针对多种幽门螺旋菌抗原的强 烈体液应答。尽管其是炎性应答，宿主免疫系统不清除该感染。因此，似 乎幽门螺旋菌干扰免疫系统，后前仍不清楚其独特的机制。
一些研究解决了这个问题，并描述了幽门螺旋菌逃脱免疫应答的被动 和主动方式。报告了幽门螺旋菌对吞噬作用的抗性，并且其依赖于编码IV 型分泌装置组分的毒力基因，诸如v/r57和v/M77。 Zabaleta等报告幽门螺 旋菌精氨酸酶抑制T-细胞增殖并减少T-细胞受体匸链的表达。显示出幽门 螺旋菌的促炎肽通过活化单核细胞产生反应性氧自由基诱导淋巴细胞功 能异常。这些数据强调了细菌和非-特异性免疫应答的相互作用；然而，特 异性T-细胞应答对消除细菌似乎是决定性的，因为在T细胞或干扰素i (IFN-力缺陷的小鼠中疫苗接种试验失败了 。
尽管付出这些努力，但是关于胃病原菌的慢性持续性的原因仍不清 楚。1已经显示出CD4阳性T细胞对细菌消除是关键的2但它们的增殖受到幽门螺旋菌的抑制。在该上下文中，若干小组研究了来自幽门螺旋菌的 蛋白质的免疫抑制作用。Knipp和同事部分纯化了所谓的"增殖-抑制-蛋 白(PIP)"，其独立于毒力因子CagA (细胞毒素相关基因A)和VacA (空 泡细胞毒素A)减少淋巴细胞和单核细胞的增殖。4
相反地，两个小组近期报告了淋巴细胞增殖在高浓度的纯化的VacA 的存在下受到抑制。5'6然而，自相矛盾的是，VacA-缺陷型幽门螺旋菌突 变体在它们的增殖抑制特性上没有缺陷。5另外，早期公认了在受到VacA-表达的螺旋菌株感染的患者中胃炎不改变或甚至不增加。7，8
早期显示，幽门螺旋菌的分泌产物通过诱导细胞周期停滞在G1阶段 来抑制T淋巴细胞增殖。3这种作用与已知的毒力因子包括蛋白质VacA和 CagA无关。
尽管关于幽门螺旋菌逃脱宿主消除作用的可能机制的工作增加了，在 开发特异性治疗或预防幽门螺旋菌感染的临床方法中尚未获得实质的成 功。
作为本发明基础的问题是提供适合于在动物或人中引起免疫应答的
多肽，其中所述免疫应答赋予针对幽门螺旋菌感染和与幽门螺旋菌有关或
由其引起的任何疾病的保护。
作为本发明基础的另一个问题是提供适合于引起所述免疫应答的免
疫原性组合物。
作为本发明基础的另一个问题是提供确定用于治疗和/或预防幽门螺
旋菌感染的新型候选药物的方法，以及治疗和预防这种感染的方法。
这些和其他问题是通过独立权利要求的主题解决的。由从属权利要求
可以获得优选的实施方案。
更具体地，在第一方面通过包括氨基酸序列的多肽解决问题，其中所
述多肽的氨基酸序列与HPGGT区域的一段连续氨基酸序列至少80%相
同，所述HPGGT区域包括对应于SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列，其中通过
以下各项定义所述区域
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和 其中所述多肽适合于引起能够抑制HPGGT催化活性的免疫应答。在第一方面的实施方案中，所述多肽包括约15-约30个氨基酸。 在第二方面，通过多肽，优选地，按照第一方面的多肽解决问题，其 中所述多肽包括对应下列各项的氨基酸序列
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括约15-约30个氨基酸。
在第二和第一方面的实施方案中，所述多肽的氨基酸序列与所述位置 的一段15-30个连续氨基酸的序列一致。
在第二和第一方面的实施方案中，所述多肽包括选自由下列各项组成 的组的一个序列
QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANAIEANKRPL (SEQ.ID.No.4)和 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
在第三方面，通过免疫原性组合物解决问题，所述免疫原性组合物包 括一种或数种按照第一和第二方面的多肽。
在第四方面，通过免疫原性组合物解决问题，所述免疫原性组合物包 括HPGGT的失活形式。
在第五方面，通过免疫原性组合物解决问题，所述免疫原性组合物包 括HPGGT的片段，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的 一段连续氨基酸序列组成。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物用于动物或人的 疫苗接种。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物能够在动物或人 中诱导免疫应答。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述免疫应答是抗体应答。 在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述抗体应答包括对 HPGGT，更优选地，对HPGGT的特异性活性具有抑制作用和/或对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制具有消除作用的抗体。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物用于在患有幽门 螺旋菌感染或处于发展为幽门螺旋菌感染风险中的患者中促进淋巴细胞 的活化和增殖。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述淋巴细胞是B或T细胞。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物包括一种或数种 佐剂。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物包括一种或数种 来自幽门螺旋菌的抗原。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述抗原选自包括外膜蛋白 的组。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述抗原选自包括HpaA、 Ompl8和其组合的组。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述组合物用于预防和/或 治疗由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感 染引起的或与之相关的疾病。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述疾病选自包括下列各项
的组幽门螺旋菌感染、由幽门螺旋菌引起的胃与十二指肠病症、胃炎、
慢性胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
在第三、第四和第五方面的实施方案中，所述免疫原性组合物是疫苗。 按照第六方面，通过按照本发明第一方面的多肽用于制备药物的用途
解决作为本发明基础的问题。
在第七方面，通过按照本发明第三、第四和第五方面的免疫原性组合
物用于制备药物的用途解决作为本发明基础的问题。
在本发明第六和第七方面的实施方案中，所述药物是疫苗。 在本发明第六和第七方面的实施方案中，所述药物用于预防和/或治
疗由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染
引起的或与之相关的疾病。
在第八方面，通过按照第一方面的多肽用于检测样品中抗体的用途解决作为本发明基础的问题，其中所述抗体针对HPGGT。
在第八方面的实施方案中，所述抗体能够抑制HPGGT酶活性和/或
HPGGT对淋巴细胞增殖的抑制活性。
在第九方面，通过特异结合按照第一方面的多肽的抗体解决作为本发
明基础的问题。
在第九方面的实施方案中，所述抗体具有对HPGGT，更优选地，对 HPGGT的特异性活性的抑制作用和/或对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性 淋巴细胞抑制的消除作用。
在第十方面，通过编码按照第九方面的抗体的核酸解决作为本发明基 础的问题。
在第十一方面，通过特异结合按照第一方面的多肽或结合HPGGT的 片段的核酸分子解决作为本发明基础的问题，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段连续氨基酸序列组成，其中所述核酸 分子选自包括适体和镜像异构适体的组。
在第十一方面的实施方案中，所述核酸具有对HPGGT，更优选地， 对HPGGT的特异性活性的抑制作用和/或对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖 性抑制的消除作用。
在第十二方面，通过按照第九方面的抗体用于制备药物的用途解决作 为本发明基础的问题。
在第十三方面，通过按照第十一方面的核酸用于制备药物的用途解决 作为本发明基础的问题。
在第十二和第十三方面的实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防 由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染引 起的或与之相关的疾病。
在第十四方面，通过用于确定治疗疾病的候选药物的方法解决作为本 发明基础的问题，所述方法包括评估候选药物的下列各项的步骤
a. 对幽门螺旋菌的7-谷氨酰基转肽基酶的特异性活性的抑制作用和
b. 对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除作用。 在第十四方面的实施方案中，所述疾病是由幽门螺旋菌引起的或与之
相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染引起的或与之相关的疾病，和更优选地，人中的幽门螺旋菌感染。
在第十五方面，通过用于开发疫苗的方法解决作为本发明基础的问 题，所述方法包括下列步骤
a) 提供包括HPGGT或至少一个它的片段的免疫原性组合物；
b) 用所述免疫原性组合物免疫动物，并由此产生抗体；
c) 评估所述抗体对幽门螺旋菌的Y-谷氨酰基转肽基酶的特异性活性 的抑制作用和它们对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除作用和
d) 选择合适的免疫原性组合物。
在第十五方面的实施方案中，所述疫苗是针对人中幽门螺旋菌感染的 疫苗。
在第十六方面，通过HPGGT配体制备用于预防和/或疾病的药物的 用途解决作为本发明基础的问题，其中所述配体显著抑制HPGGT活性并 消除淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制。
在第十六方面的实施方案中，所述疾病是由幽门螺旋菌引起的或与之 相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染引起的或与之相关的疾病。
在第十六方面的实施方案中，所述配体是按照第九方面的抗体，或按 照第十一方面的核酸。
在第十六方面的实施方案中，在淋巴细胞增殖测定中评估淋巴细胞增 殖和/或活化。
在第十七方面，通过HPGGT用于制备免疫抑制刑组合物的用途解决 作为本发明基础的问题。
在第十八方面，通过免疫抑制剂组合物解决作为本发明基础的问题， 所述免疫抑制剂组合物是可以在容许HPGGT特异性活性的培养基中培养 HPGGT和谷氨酰胺后作为上清液获得的。
在不希望受到任何理论局限的条件下，本发明人意外地发现针对幽门 螺旋菌的Y-谷氨酰基转肽基酶(HPGGT) (E.C.2.3.2.2.)的配体可以用于治 疗和/或预防幽门螺旋菌感染，具体地，胃与十二指肠病症，其中所述配体 是HPGGT催化活性的抑制剂并与对照相比恢复淋巴细胞增殖，所述对照 在存在该酶的条件下受到抑制。此外，本发明人发现当与HPGGT—起培 养时，淋巴细胞的增殖受到HPGGT特异性活性的阻断，所述HPGGT特异性活性导致淋巴细胞中的Gl细胞周期停滞，并由此抑制淋巴细胞增殖。
因此，HPGGT特异性活性的抑制消除淋巴细胞增殖的抑制，并因此使幽
门螺旋菌不可能逃脱宿主的免疫系统。因此，如本发明提示的配体的使用 预防或至少基本减少幽门螺旋菌定居在宿主/患者中。最后，本发明人发现
幽门螺旋菌的Y谷氨酰基转肽基酶(GGT)的催化活性对于抑制淋巴细胞增 殖，特别是宿主中T细胞增殖是必需的。这由下列证据清楚地证实，所述 证据显示在GGT活性中有缺陷的突变细菌丧失消除淋巴细胞增殖的能力， 并同时不能定居在小鼠中。对淋巴细胞的抑制作用由重组HPGGT完全呈 现。关于其对T细胞中信号转导的作用的分析提示Ras信号传导通路的中 断，从而导致诱导Gl细胞周期停滞。重要地，注意到每种幽门螺旋菌株 具有HPGGT，且由抑制配体耙向该酶将提供适用于每种幽门螺旋菌感染 的新型疗法，由此避免与抗生素疗法相关的问题(抗性、副作用、突变体 选择等)。按照本发明，优选地，对幽门螺旋菌感染的保护是通过抑制 HPGGT的催化活性和由此破坏免疫抑制而赋予的，所述免疫抑制否则阻 止针对幽门螺旋菌的有效免疫应答。
HPGGT广泛分布于动物、植物和细菌中。其代表异源二聚体蛋白， 其作为单多肽链翻译，并在翻译后分裂为两个具有不同分子量的亚单位。 该酶的哺乳动物形式是膜-结合的蛋白质，所述蛋白质主要表达于全身的腺 体和导管腔表面上。 一些细菌性GGT，包括幽门螺旋菌同源物的细胞定位 与哺乳动物的酶的细胞定位不同。先前显示，HPGGT被分泌到细胞外培 养基中(Bumann等2002)。另外，不同GGT同源物氨基酸序列的排列揭 示HPGGT与人和其他哺乳动物GGT之间22%的低同源性，而对细菌性 同源物的较高同源性。HPGGT和来自其他物种的同源物之间的另一个重 要区别是在HPGGT的C-末端缺乏GY-残基(Chevalier等1999)。因此，关 于HPGGT和其哺乳动物同源物之间的细胞定位和蛋白质结构的基本区别 是明显的。
Y-谷氨酰基转移酶还称为谷氨酰基转肽基酶；a-谷氨酰基转肽基酶；g-谷氨酰基肽基转移酶；g-谷氨酰基转肽基酶;g-GPT; g-GT; g-GTP; L-g-谷氨 酰基转肽基酶;L-g-谷氨酰基转移酶;L-谷氨酰基转移酶；GGT; g-谷氨酰基 转肽基酶。特异性(催化)活性是如下概述的谷氨酰基残基转移(5-L-谷氨酰基)-肽+氨基酸=肽+ 5-L-谷氨酰基氨基酸
该反应或进行所述反应的能力在本文中也指HPGGT的酶活性或 HPGGT的特异性活性。
可以用本领域技术人员巳知的方法(例如，使用L-Y-谷氨酰基 -p-nitroanilide作为供体底物；见下)评估GTT活性。可以如本文中所详 述地，在存在或缺乏HPGGT和/或配体的条件下进行淋巴细胞增殖测定。
早期，其他小组已经描述了 GGT作为来自幽门螺旋菌的因子对体内 定居很重要。"，13然而，该发现的基础原因尚不清楚。
本发明提供关于人T淋巴细胞增殖的GGT-依赖性抑制和由幽门螺旋 菌诱导Gl停滞的明确证据。这在一方面通过使用细菌的同基因 (isogenic)GGT敲除突变体得到证实，其未能抑制抗原-刺激的初级人T细 胞以及PBMC的增殖。在另一 方面，大肠杆菌(Eco")中表达的重组HPGGT 在缺乏幽门螺旋菌分泌的其他蛋白的条件下，抑制T细胞增殖。有趣地， 我们的数据显示哺乳动物的GGT缺乏这种抑制功能。如上提及地，报告 了哺乳动物和HPGGT的结构和定位中的区别。我们的结果指出哺乳动物 和HPGGT的催化机制和/或底物特异性的其他差别，这是哺乳动物GGT 不能抑制淋巴细胞增殖的原因。
使用了结构研究和诱变实验来确定丝氨酸残基451和452对GGT催 化活性而言是必需的。21本文显示HPGGT丝氨酸451/452位置-定向诱变 为丙氨酸导致完全消除其针对淋巴细胞的催化活性和特别地，抑制活性， 这与现有技术的技术教导相反，在现有技术中报告了氨基酸位置380 (T380)对HPGGT的催化活性很关键31。因此，用GGT抑制剂阿西维 辛(acividn)培养HPGGT完全消除该酶的催化活性以及抑制功能。所以， 我们的数据证明HPGGT的催化结构域的结构完整性是其免疫抑制作用的 必要先决条件。按照来自幽门螺旋菌的GGT在体内定居过程中的重要作 用1U3，我们发现该酶甚至在宿主胃粘膜中存在的低pH值下是催化活性 的。
非常确定地，人胃中的上皮细胞形成连续的屏障，所述屏障限制分子在内部和外部区室之间运动。另外，多种机制，包括紧密和粘着连接阻止 大分子被动扩散经过该屏障的细胞旁空间。因此，出现了这样的问题，即 幽门螺旋菌分泌的GGT蛋白如何能够与上皮屏障另一侧的宿主免疫系统
相互作用，从而抑制T细胞增殖。在该上下文中，先前己经证明了HP能 够通过若干机制减弱胃上皮的屏障功能。另外，以前已经证明了由HP蛋 白VacA和CagA引起上皮连接复合物的破坏以及由幽门螺旋菌脲酶引起 增多的胞转蛋白(tmnscytotic protein)穿过上皮屏障传递。这些机制最终 导致固有层中存在增多的HP蛋白，和它们与作为幽门螺旋菌感染的结果 浸润胃粘膜的免疫系统细胞的相互作用。支持HPGGT对胃粘膜中T细胞 的影响，我们的结果显示明确的血清抗体应答HP感染的而非未感染的对 照患者中的这种毒力因子。这支持抗原处理GGT蛋白组分和将这些抗原 呈递给免疫系统的组分，包括胃粘膜中的T淋巴细胞的想法。因此，通过 HPGGT抑制胃粘膜中的T淋巴细胞增殖可以有助于幽门螺旋菌的免疫逃 脱机制，从而促进其在人胃中的慢性持久性。
解释本发明的研究的结果揭示了在与幽门螺旋菌野生型上清液和还 有与重组HPGGT温育的过程中T细胞活化的重要机制是完整的。这与本 发明人先前的研究一致，所述先前的研究显示细胞表面抗原CD69和CD25 (IL-2受体a-链)的表达在存在幽门螺旋菌上清液的条件下不减少。3另 夕卜，证明了 HPGGT对淋巴细胞的抑制功能受到与凋亡无关机制的介导， 因为通过Annexin V-FITC染色测量的磷脂酰丝氨酸的暴露，在存在幽门螺 旋菌上清液和重组HPGGT的条件下不增加。早期描述了 HPGGT诱导胃 上皮细胞中的氧化压力和凋亡。12'16然而，先前没有确定该酶对免疫系统 的细胞的作用，且观察到的区别可以反映靶细胞之间的区别。
本发明人分析了在T细胞中用细胞周期进展干扰HPGGT，并发现 HPGGT通过引起细胞周期Gl阶段中的停滞，抑制淋巴细胞的增殖。Gl 停滞的特征在于增多的Cdk-抑制子p27的量以及减低的细胞周期蛋白细 胞水平。Ras-和PDK-依赖性途径在用它们的催化配偶体诱导、合成和装 配D-型细胞周期蛋白的过程中非常重要。22'23 Ras-信号传导的活化通过涉 及c-Raf和其他激酶的蛋白级联诱导细胞周期蛋白D-转录。24另外，确定 了诱导Ras信号传导导致增强合成c-Myc蛋白25，这在调节细胞周期、细胞生长、和转化过程中起重要作用。26先前的研究证明了 PI3K-信号传导 不依赖于T细胞中的Ras-信号传导而进行。17尽管重要介体PI3K-信号传 导(AKT， p70S6K和Foxo3)的活化状态在存在HPGGT的条件下不改变，我 们在用HPGGT培养的细胞中发现了降低的c-Raf磷酸化和c-Myc蛋白水 平。因此，我们的数据提示由来自幽门螺旋菌的GGT引起的Ras-而非PI3K-依赖性信号传导的中断在诱导T细胞中细胞周期停滞的过程中起作用，从 而导致消除的细胞增殖。
另一个重要问题是酶，如HPGGT如何能够影响导致细胞周期停滞和 抑制增殖的细胞内信号传导事件。在转肽基反应过程中，GGT催化Y-谷氨 酰基部分从供体转移到受体基质中。"通过系统氨基酸消耗分析，本发明 人发现在缺乏来自培养基的氨基酸谷氨酰胺的条件下完全消除HPGGT的 抑制作用，这提示来自幽门螺旋菌的GGT的抑制作用受到转肽基作用过 程中形成代谢物的间接介导。这通过我们这样的观察得到支持，即与 HPGGT —起预培养培养基并随后在加入到细胞前使酶失活足以抑制淋巴 细胞增殖。
先前的研究描述了幽门螺旋菌的若干不同于GGT的因子，其抑制人 T淋巴细胞的增殖。Wang和同事显示处于300的MOI (300个细菌/T细 胞)的幽门螺旋菌通过诱导凋亡，抑制T细胞的增殖。然而，这种高细菌 量是否接触到人胃的固有层中的T细胞是不确定的。在我们先前的公开文 献中(胃肠病学(Gastroenterology) 2005 2005;128(5):1327-39)，本发明 人显示甚至比l (l个细菌/T细胞)低300倍的MOI足以在我们的系统中 抑制淋巴细胞增殖。当与淋巴细胞一起培养的HP培养物上清液的浓度升 高超过100pg/ml时，观察到与Wang等相似量的凋亡。这提示本文中所述 的HP对淋巴细胞的抑制作用与该小组所述的机制相比更明确 (pronounced)并且不同。
由Zabaleta等进行另一项研究描述了细胞质HP蛋白精氨酸酶抑制T 细胞增殖3、作者使用来自HP的全细胞溶解物，其包含细菌的细胞质和 膜-结合蛋白。相反，本发明人使用来自HP包含其分泌的蛋白的培养物上 清液。由于HP不分泌精氨酸酶，所以该酶针对T细胞可能的抑制作用是 于此使用的系统中不可检测的，且不太可能在体内发生。Gebert等进行的工作提示由幽门螺旋菌分泌的空泡细胞毒素A (VacA) 抑制T细胞增殖。作者使用了是我们在我们目前工作中使用浓度(10pg/ml) 的25倍的浓度(250ng/ml)的细菌上清液。在先前的研究中，本发明人证明 了高HP培养物上清液浓度(2100吗/ml)在淋巴细胞中诱导显著量的凋亡。 另外，在我们的系统中存在或缺乏VacA对HP针对淋巴细胞的抑制没有 影响(Gastro 2005)。
因此，不管前述由幽门螺旋菌引起T细胞抑制的其他方式，在本文 中使用的系统中，细菌分泌的GGT对抑制T细胞增殖是必需的和充分的。
总之，解释本申请的数据提供一种由幽门螺旋菌应用的免疫逃避的新 型机制，其利用分泌的蛋白质抑制免疫效应子细胞的细胞周期进展。显示 了酶GGT是造成幽门螺旋菌抑制T细胞增殖的原因，因为在细菌的GGT-缺陷型突变体中抑制作用完全消除。该作用明显依赖于GGT的催化活性， 因为重组HPGGT蛋白的酶失活突变体缺乏抑制T细胞增殖的能力。另外， 显示了仅在存在来幽门螺旋菌的GGT条件下诱导细胞周期停滞在T细胞 的Gl期。再一次，在不希望受到任何理论限制的条件下，其他结果指出 由HPGGT引起的Ras-而非PI3K-依赖性信号传导的中断是Gl停滞和抑制 的T细胞增殖的原因。将HPGGT鉴定为淋巴细胞抑制因子形成在动物模 型中观察的生物基础，显示HPGGT对于幽门螺旋菌定居的重要作用。在 WO 00/01825和WO98/17804中讨论了 HPGGT及其在宿主细胞的定居中 的可能作用。然而，这两篇文献没有提供这样的证据，即HPGGT活性是 造成宿主免疫系统抑制的原因，且它们没有记载HPGGT对宿主细胞内T 细胞增殖和免疫抑制的影响。
本发明人发现不仅所述HPGGT，优选地，具有按照SEQ.ID.No.l的 氨基酸序列的野生型HPGGT，可以作为用于产生抗体、适体、和镜像异 构适体的抗原使用，而且其不同片段也可以，所述抗体、适体、和镜像异 构适体各自优选地与所述抗原特异性结合，这适合于抑制HPGGT的特异 性活性禾卩/或对淋巴细胞增殖的淋巴细胞抑制的HPGGT依赖性抑制的消 除作用。
因此，在一方面，本发明涉及特异性多肽。所述多肽包括氨基酸序列， 其与HPGGT不同区域的一部分或一段氨基酸序列相同或相对应。优选地，HPGGT的氨基酸序列包括按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。
优选地用于本文时，如果氨基酸的序列或顺序在氨基酸性质和其彼此 间相对位置方面相同，则氨基酸序列与另一个氨基酸序列相同。
优选地用于本文时，如果氨基酸的序列或顺序在氨基酸性质和其彼此 间相对位置方面相同，则氨基酸序列与另一个氨基酸序列相同。在另一个 实施方案中， 一致的序列的一级氨基序列是相同的。
如本文所优选使用的，如果氨基酸的序列或顺序在氨基酸性质和其彼 此间相对位置方面相同，则氨基酸序列与另一个氨基酸序列相同。在另一 个实施方案中，彼此对应的序列的一级氨基酸序列相同，其中这两个对应 的氨基酸序列的全部邻近序列(context)相同或不同。由该氨基酸序列的 一个或两个末端相邻的氨基酸定义氨基酸的全部邻近序列。
本领域中技术人员应该公认彼此相同或对应的序列具有至少80 %， 85%， 90%, 95 %或100 %的序列同源性。
在实施方案中，按照本发明的多肽包括或由与HPGGT的一段保守氨 基酸序列相同或对应的氨基酸序列组成。优选地，且对本发明的任何实施 方案和方面适用地，HPGGT具有按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。本领 域技术人员应该公认可以存在HPGGT的变体和突变体，其应该包括在术 语HPGGT之内。本发明还包括，如果HPGGT的序列与如SEQ.ID.No.l 中指定的HPGGT之一不同，则本文中关于具有如SEQ.ID.No.l中指定的 氨基酸序列的HPGGT所公开的内容也适用于HPGGT的所述不同形式。 更具体地，本领域中技术人员应该识别处于所述不同形式的氨基酸，其在 其位置、化学性质和/或功能方面，与具有如SEQ.ID.No.l中指定的氨基酸 序列的HPGGT中确定的氨基酸和位置分别对应。
如本文中公开地，按照本发明的多肽与HPGGT不同区域的氨基酸序 列相同或对应。在一个实施方案中，所述区域是由按照SEQ.ID.No.l的氨 基酸序列的氨基酸位置150-200定义的区域。在另一个实施方案中，所述 区域是由按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的氨基酸位置410-480定义的区 域。
本发明人意外地发现由氨基酸150-200定义的HPGGT部分和由氨基 酸410-480定义的HPGGT部分特别有益于作为产生能够抑制HPGGT的催化活性的抗体的抗原或疫苗使用，由此提供这样的先决条件，即免疫应 答是针对幽门螺旋菌，或至少针对受到幽门螺旋菌感染或处于其感染风险 中的生物体中的HPGGT引起的。
在不希望受到任何理论限制的条件下，本发明人假定由氨基酸位置
150-200和氨基酸位置410-480定义的区域都具有与HPGGT酶活性的特殊 关系。更具体地，认为由氨基酸位置410-480定义的HPGGT区域与HPGGT 的活性中心有关或接近。更具体地，该HPGGT区域包括与所述活性中心 直接接触的环区域和所述活性中心本身的一部分。因此，这部分HPGGT 的阻断是抑制HPGGT酶活性的合适方法，大概是通过阻断HPGGT催化 活性物质的进入。这些，在原则上，对于由氨基酸位置150-200定义的 HPGGT区域也是正确的。按照SEQ.ID.No.l的HPGGT的氨基酸位置 150-200的区域涉及或形成处于HPGGT活性中心外的环(的一部分)，然 而，其与底物的结合袋紧密空间接近。由于这些，所以任何特异干扰这些 区域的分子是如本文中更详细描述地能够关于具有这种类型结合特性的 抗体使用的试剂。除抗体外，可以分别产生和使用如现有技术中所述的肽 适体、抗促成素(anticaline)、适体和镜像异构适体，以获得本文中关于 抗体公开的多种目的。
本申请提供多肽，其序列与下列氨基酸位置对应或相同
(a) (150 + n) — (150 + n + m)，其中n是0-35之间的任何整数，且 m是15-30之间的任何整数。应该理解由此定义的位置是由n和m的任意 组合产生的那些。还应该理解所述组合优选地仅限于这样的范围内，即由 此定义的上游位置是约200;由(150 + n)定义的位置也称为下游位置；且 由(150 + n + m)定义的位置也称为上游位置。
(b) (410 + n) —(410 + n + m)，其中n是0-55之间的任何整数，且 m是15-30之间的任何整数。应该理解由此定义的位置是由n和m的任意 组合产生的那些。还应该理解所述组合优选地仅限于这样的范围内，即由 此定义的上游位置是约200;由(410 + n)定义的位置也称为下游位置；且 由(410 + n + m)定义的位置也称为上游位置。
在另一个实施方案中，按照本发明的多肽是HPGGT的片段，优选地， HPGGT的免疫原性片段，和更有效地，适合于在宿主生物体内引起免疫应答，优选地抗体应答的HPGGT免疫原性片段，其中所述抗体具有对 HPGGT，更优选地对HPGGT的特异性活性的抑制作用，和/或对淋巴细 胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除作用。优选地，按照本发明的免疫原 性片段包括HPGGT的氨基酸451和或452。该片段可以是任何长度。然 而，使用10-约50个氨基酸残基的肽，更优选的10-40、 10-30，或最优选 的10-20。为了基于肽的疫苗的设计，在此应用表位预测算法。优选地用 于本文时，宿主生物体是动物，优选地哺乳动物，或人，其优选地能够针 对抗原形成免疫应答。
优选地用于本文时，氨基酸是a-氨基酸。也优选地用于本文时，氨 基酸是D-或L-氨基酸，优选地，L-氨基酸。更优选地，氨基酸是天然存 在的氮基酸。
本发明人还意外地发现将HPGGT的丝氨酸残基451和域452诱变 为丙氨酸完全消除重组HPGGT的酶活性，并消除其对T细胞增殖的抑制。 然而，丝氨酸残基385的取代(S385A)不减少对T细胞增殖的HPGGT 依赖性抑制作用，因管显著降低这种突变HPGGT的催化活性(即，约 50%)。因此，治疗幽门螺旋菌感染的合适药物物质需要满足2个要求，即 (i)它必须表现出对HPGGT催化活性的抑制作用，且在与HPGGT—起 培养时还必须恢复T细胞增殖。按照本发明用于识别合适候选药物的有效 方法因此包括这两种评估。
由于这些发现，本发明的另一方面涉及HPGGT失活形式的用途。 HPGGT的失活形式是HPGGT的一个实施方案，其缺乏如本文中所 示的HPGGT酶活性。本领域中技术人员应该公认，存在多种提供所述 HPGGT失活形式的方法，包括删除一个或数个氨基酸，改变一个或多个 氨基酸，总是与酶活性的HPGGT相比较。HPGGT失活形式的一个实施 方案是在按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的位置451和452处缺少丝氨酸 氨基酸的HPGGT。在一个实施方案中，HPGGT的失活形式仍能够引起如 本文中所述的免疫应答，优选地，动物和/或人中的抗体应答，其包括具有 对野生型HPGGT，更优选地，对HPGGT的特异性活性的抑制作用和/或 对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除作用的抗体。优选地用于本 文时，术语HPGGT的特异性活性与酶活性，和更具体地，如本文中所述的HPGGT的酶活性，.以同义方式使用。HPGGT失活形式的另一个实施 方案是具有野生型氨基酸序列的HPGGT，但通过向HPGGT的酶活性添 加抑制剂抑制酶活性。所述抑制剂可以是抗体、镜像异构适体、适体或剥 夺HPGGT的HPGGT酶活性所需的因子包括离子的任何分子。
应该理解，多肽、HPGGT失活形式和HPGGT在本文中也称为耙分 子，具体地，和与之特异结合的抗体、适体和镜像异构适体的产生有关。
本发明的另一方面涉及抗体，所述抗体针对按照本发明的多肽、 HPGGT的失活形式或HPGGT，优选地典型具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基 酸序列的野生型HPGGT。
本文中优选使用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其制备和产生 分别为本领域中的技术人员所熟知。
特异于所述靶标的抗体的制备是本领域中技术人员己知的，例如，记 述在Harlow, E,，和Lane, D.,"抗体:实验室手册"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷 泉港，纽约(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。优选地，单克隆抗体可 以连同本发明使用，其可以按照K6hlei"和Milsteiii的方案和基于此的其他 发展方案而制备。抗体，用于本文时，包括，但不仅限于，完全抗体、抗 体片段或衍生物，诸如Fab片段、Fc片段和单链抗体或抗促成素，只要它 们适合于且能够结合于所述靶标。除单克隆抗体外，也可以使用和/或生成 多克隆抗体。多克隆抗体的生成也是本领域中技术人员已知的，例如，记 述在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗体:实验室手册"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),冷 泉港，纽约(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。优选地，用于治疗目的 的抗体是人源化的或人抗体。
按照本发明可以使用的抗体可以具有一个或数个标记或标签。所述标 记或标签可以在其诊断应用或其治疗应用中有效检测抗体。优选地，所述 标记和标签选自包含抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、金和荧 光素的组，并用在例如ELISA法中。这些和其他标记以及方法，例如记述 在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗体实验室手册"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。另外地或备选地，本文中所述的抗 体以及任何其他靶拮抗剂或相互作用配偶体可以是如本文中更一般描述 的带有标签的拮抗剂。
本发明还包括所述标签或标记表现出除检测以外的其他功能，诸如与 其他分子相互作用。所述相互作用可以是，例如与其他化合物的特异性相 互作用。这些其他化合物可以是使用抗体的系统如人或动物体中所固有的 那些，或在通过使用各自抗体进行分析样品中固有的那些。合适的标记可 以，例如，是生物素或荧光素，其具有其特异性相互作用配偶体，诸如抗 生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白等，所述配偶体存在于与由此标记或带有 标签的抗体相互作用的各种化合物或结构上。而且，这也应用于本文中所 述的其他靶相互作用配偶体，诸如适体和镜像异构适体。
在实施方案中，所述抗体是具有针对HPGGT表位的特异性活性的抗 体，优选地单克隆抗体，其包括重组HPGGT的氨基酸451和/或452。在 另一个实施方案中，所述抗体应该靶向在空间上接近这些氨基酸位置的表 位，优选地，靶向并特异结合于邻近所述位置的环，更优选地，所述表位 由下述序列所定义或包含在下述序列中由SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基 酸位置150-200，更优选地，位置174-190定义的这段HPGGT序列，或通 过SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基酸位置410-480，更优选地，位置423-443 所定义的这段HPGGT序列，和其在这样的附带条件下的衍生物，所述附 带条件是它们显示基本相同的免疫反应性。
优选地，本发明的抗体以至少50%,更优选地至少70%,最优选地至少 80或90%,抑制HPGGT特异性活性并抑制宿主中淋巴细胞增殖的HPGGT 依赖性抑制。还优选地，体外评估时，按照本发明的抗体还表现出对 HPGGT特异性活性的抑制作用，并消除T细胞增殖的HPGGT依赖性抑 制。
按照本发明可以 以与所述抗体相同方式并由此为了相同目的使用的 另一类相互作用配偶体是所谓的"抗促成素"，其为耙结合多肽的特殊形 式。其中，抗促成素及其制备方法，记述在德国专利申请DE 197 42 706 中。
可以以与所述抗体相同的方式并由此为了相同的目的使用的另一类分子是所谓的肽-适体。利用靶标，可以使用筛选方法生成肽适体，所述筛选方法利用如本文中更详细描述的多肽文库。选择标准是分泌的多肽实际上并特异地结合于所述靶标。
更特别地，可以通过利用按照现有技术的方法，诸如噬菌体展示生成所述肽适体。基本上，生成肽文库，诸如处于噬菌体形式，且这类文库与靶分子接触。随后，从各个反应中去除这些结合靶分子的肽，优选地，作为与靶分子的复合物。本领域中技术人员已知结合特征，至少在一定程度上，依赖于具体实行的实验设置，诸如盐浓度等。在将以较高亲和性或较大强度结合靶分子的那些多肽与所述文库中的非-结合成员分开后，且任选地，还在从耙分子和多肽的复合物中去除靶分子后，可以随后表征各个多肽。表征前，任选地，实行扩增步骤，诸如，例如，通过增殖编码所述多肽的噬菌体。表征优选地包括测序所述靶结合多肽，和最后对作为如本文中定义的靶标的拮抗剂或相互作用配偶体的多肽进行测序。基本上，所述多肽不受其长度的限制，然而，优选地，具有约8-20个氨基酸长度的多肽是在各种方法中优选获得的。所述文库的尺寸可以是约102-1018，优选地，108-1015个不同的多肽，然而，不受其限制。
本发明的另一方面涉及针对按照本发明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，优选地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的适体。
适体是单链或双链的D-核酸，且其与靶分子特异性相互作用。适体的制备或选择，例如，记述在欧洲专利EP0 533 838中。基本上，实行下列步骤。第一，提供核酸混合物，即潜在的适体，其中每种核酸典型地包括若干，优选地至少8个随后的随机化核苷酸的区段。该混合物随后与靶分子接触，其中与候选混合物相比，所述核酸，诸如基于对所述靶标增强的亲和性或与其更大的强度结合靶分子。随后将结合核酸从混合物的残余物中分离。任选地，利用，例如聚合酶链反应扩增由此获得的核酸。这些步骤可以重复若干次，从而最终提供具有增高比例的特异性结合于靶标的核酸的核酸混合物，然后任选地从所述核酸混合物中选择最终结合核酸。这些特异性结合核酸指适体。显然地，在生成或识别适体的方法的任何阶段，可以采用各种核酸的混合物样品，利用标准技术确定其序列。本发明包括可以固定适体，诸如，例如通过引入定义的化学基，这些化学基是生成适体技术领域中技术人员己知的。所述修饰可以例如存在于核苷酸糖部分的2'-位置处的氨基引入中。目前使用适体作为治疗和诊断剂。然而，本发明还包括由此选择或生成的适体可以用于耙标确认和/或用作开发药物，优选地基于小分子的药物的引导物质。这实际上是通过竞争测定完成的，其中靶分子和适体之间的特异性相互作用受到候选药物的抑制，其中根据从靶标和适体的复合物中替换适体，可以假定各种候选药物容许特异性抑制靶标和适体之间的相互作用，且如果该相互作用是特异性的，则所述候选药物应该，至少原则上，适合于阻断所述靶标并由此在包括所述耙标的各种系统中降低其生物学有效性或活性。然后，由此获得的小分子可以进行进一步的衍生化和修饰，从而最优化其物理、化学、生物学和/或医学特性，诸如毒性、特异性、生物降解能力和生物有效性。
本发明的另一方面涉及针对按照本发明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，优选地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的镜像异构适体。
镜像异构适体是特殊形式的适体。可以按照本发明利用所述耙标使用
或生成的镜像异构适体的生成或制备基于相似的原则。镜像异构适体的制
备记述在国际专利申请WO 98/08856中。镜像异构适体是L-核酸，这意
味着它们由L-核苷酸组成，而不是向适体那样由D-核苷酸组成。镜像异
构适体的特征在于这样的事实，即它们在生物学系统中具有非常高的稳定
性，且类似于适体，与它们针对的靶分子特异性相互作用。为了生成镜像
异构适体的目的，在存在例如所述靶标的天然存在的L-对映异构体的D-
对映异构体的情形中，创建了D-核酸的异源群体，且该群体与耙分子的光
学对映体接触。随后，分离不与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-
核酸。然而，对与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸进行分离、
任选地确定和/或测序，并且随后基于获自D-核酸的核酸序列信息合成相
应的L-核酸。这些与前述与靶分子的光学对映体相互作用的D-核酸序列
相同的L-核酸应该与天然存在的靶分子，而非其光学对映体特异性相互作
用。类似于生成适体的方法，还可能重复所述多种步骤若干次，并由此富集与靶分子的光学对映体特异性相互作用的那些核酸。在另一方面，本发明涉及免疫原性组合物。所述免疫原性组合物包括至少一种按照本发明的多肽和/或HPGGT的失活形式，具体地，如本文中
所述的HPGGT失活形式，和/或野生型HPGGT。应该理解所述按照本发明的多肽和/或所述HPGGT的失活形式，具体地如本文中所述的HPGGT失活形式，和/或所述野生型HPGGT，在一个实施方案中，缀合于载体物质，诸如KLH或匙孔血蓝蛋白、BSA、卵清蛋白等，从而以这样的方式对宿主的免疫系统呈现各自的抗原，所述方式容许或促进引起免疫应答和引起高滴度抗体。
应该理解，根据本发明，可以体外或体内使用免疫原性组合物。在后者的情形中，所述免疫原性组合物典型地是疫苗，且优选地配置为所述疫苗。免疫原性组合物、包括所述免疫原性组合物的药物和疫苗，分别可以用于预防幽门螺旋菌感染，优选地，在儿童中，或用于治疗和/或预防患有或处于患有幽门螺旋菌感染和由所述生物体引起或与其相关的任何疾病的风险中动物和人。
在实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括一种或数种佐剂。优选地，佐剂是提供免疫系统一般剌激的试剂。佐剂是本领域中已知的，且包括，但不仅限于，聚阳离子多聚体、免疫刺激脱氧核苷酸(ODN)、合成KLK肽、神经活性化合物、alumn、弗氏完全或不完全佐剂、霍乱毒素。优选地，聚阳离子多聚体是聚阳离子肽和/或其中神经活性化合物是人生长激素。
在另一方面，免疫原性组合物包括幽门螺旋菌的外膜蛋白，诸如BabA、 HpaA、 Omp 18和其组合物。HpaA和Ompl8，例如，记述在Volandp.等.，感染和免疫性(Infection and Immunity) , 2003年7月，3837-3843页中。本发明包括术语BabA,HpaA和Omp18，该术语不仅包括全长多肽，还包括其任何的免疫原性片段或肽。HpaA是推定的N-乙酰神经氨糖酸基乳糖(N-acetylneumminyllactose)-结合血凝素，Bab A是与路易斯血型抗原结合的黏着蛋白。应该理解，其他抗原和优选地蛋白质和多肽，和其各自的片段，可以用于增加针对幽门螺旋菌的免疫应答。可以在本发明的实施方案中使用的优选蛋白质和多肽，分别是外膜蛋白，所述外膜蛋白典型地被引入幽门螺旋菌的外质膜中，并对例如，离子运输、粘着、结构和渗透稳定性和细菌毒力很重要。
可以获自幽门螺旋菌和可以是按照本发明的免疫原性组合物的一部
分的其他抗原是记述在公开的美国专利申请20070042448中的那些。
应该承认，优选地配制本发明的多肽和蛋白质，包括HPGGT的失活形式和野生型HPGGT，以及本文中所述的意欲施用于动物或人体的任何其他化合物。所述制剂是本领域中技术人员已知的。在一个实施方案中，所述制剂如美国专利6,838,089中所述。该美国专利中所述的制剂是包括许多多聚体粒子的递送系统，其中不溶于水的蛋白质抗原与所述多聚体粒子结合，所述多聚体粒子包括基质多聚体，其包括一种或多种同聚物和/或共聚物，其中所述方法包括(a)混合水相(W)和有机相(0)，所述水相包括处于其临界微团浓度的0.1-100倍浓度的不溶于水的试剂诸如蛋白质和一种或多种亲水性表面活性剂，所述有机相包括处于有机溶剂中的基质多聚体，所述溶剂不变性蛋白质抗原且其中O与W不混溶，从而产w/o乳剂，其中W或O或二者还包括一种或多种稳定剂，所述稳定剂在混合前加入，从而在存在增溶剂的条件下稳定w/o乳剂，并在步骤(b)
过程中促进多聚体粒子中的不溶于水的蛋白质的引入；和(b)通过将所述乳剂分散在流动的基质中而形成所述W/0乳剂的小滴，和从所述W/O乳剂小滴的O相中去除所述溶剂，从而形成引入不溶于水的蛋白质抗原的多聚体粒子。
在另一个实施方案中，关于本文中所述的试剂和化合物的制剂和递送试剂是微球系统，诸如，如美国专利6,372260中所述的那些。
在本发明的一方面，按照本发明的多肽、HPGGT的失活形式、抗体、镜像异构适体和适体、包括按照本发明的任意这些的免疫原性组合物、药物组合物优选地用于预防和/或治疗由幽门螺旋菌引起的或与之相关的，更优选地由幽门螺旋菌感染引起的疾病。在一个实施方案中，所述疾病是由幽门螺旋菌感染引起的胃与十二指肠病症。在另一个实施方案中，所述疾病是胃炎，大部分慢性胃炎。由于慢性胃炎涉及胃或十二指肠溃疡或甚至胃癌和MALT淋巴瘤的发病机理，本发明的方法和以上试剂可以用于预防这些疾病。其还可以用于治疗，例如胃和十二指肠溃疡病和(MALT)淋巴瘤。按照本发明，使用一般术语"治疗"一 除非另外明确定义一 作为任何形式的治愈、减轻、诊断或预防病理学病症。
在另一方面，本发明和关于其对淋巴细胞增殖，具体地T细胞增殖
的抑制作用，HPGGT在宿主中诱导免疫抑制，并由此可以作为新型免疫
抑制剂来应用。免疫抑制剂可以，例如，用于减小移植后的器官移植排异风险，或用于治疗自体免疫疾病，诸如风湿性关节炎、局限性回肠炎或特
应性湿疹。HPGGT的催化活性需要存在谷氨酰胺，以起到y谷氨酰基的供体/受体的作用。因此，包括HPGGT的免疫抑制剂组合物优选地还包括
谷氨酰胺。
而且，本发明人可以显示用谷氨酰胺、亮氨酸和组氨酸和活性HPGGT预培养应用于淋巴细胞增殖测定的细胞培养基对T细胞表现出抗-增殖作用，甚至在随后对HPGGT进行失活时。因此，总结出免疫抑制作用是HPPGT依赖性的；然而，尚未确定该作用模式中涉及酶反应的直接或间接产物。因此，本发明的一个实施方案涉及能够通过优选地，在药用培养基中，培养HPGGT和谷氨酰胺、亮氨酸和组氨酸和容许HPGGT特异性反应获得的免疫抑制组合物。然后将该反应的上清液作为合适的免疫抑制组合物应用。优选地，该组合物包括谷氨酰基-肽，例如，通过向所述物质转移谷氨酰基产生的多-谷氨酰基-谷氨酸(glutamate)或谷氨酰基-衍生物。
本发明包括根据这个方面使用的HPGGT是任何具有本文中所述的特异性酶活性的HPGGT。在这种情况下，术语HPGGT包括野生型HPGGT、全长HPGGT和任何的衍生物和更特别地，其具有这种酶活性的任何片段。本领域中的技术人员可以通过利用本领域中熟知的方法生产所述衍生物和片段。
优选地用于本文时，术语促进淋巴细胞的增殖意指在优选的实施方案中促进淋巴细胞的活化和增殖。
在另一方面，本发明涉及生产HPGGT，更具体地重组HPGGT的方法，所述重组HPGGT缺乏分泌序列(信号肽)或具有非-功能性分泌序列。所述缺乏功能性分泌序列，即氨基酸1-26，在pos. 26和27: LSA-AS之间的分裂位点的HPGGT有利地属于这样的范围，即所述HPGGT在宿主细胞中产生过程中不从所述宿主细胞中分泌出来。根据这个方面，宿主生物体优选地是原核生物，诸如大肠杆菌(E.coli)，然而，不局限于此。本领域中的技术人员已知制备所述缺乏功能性分泌序列的HPGGT的方法。例如，这可以通过表达编码无分泌前导序列的蛋白质的基因而实现。
所述修饰的HPGGT蛋白应该保持在其宿主细胞中，并由此可以从中纯化出来。
在另一方面，本发明涉及按照本发明的多肽和按照本发明的失活HPGGT用于制备抗体的用途。在密切相关的方面，用于免疫动物，从而分别产生抗体和提供起始细胞和细胞系，产生本领域中技术人员已知的杂交瘤细胞系。本领域中技术人员应该承认可以进一步培养和进一步选择所述杂交瘤。因此，本发明还包括按照本发明的多肽和按照本发明的活性和失活HPGGT用于筛选测定，从而识别产生针对和/或特异性结合按照本发明的多肽和按照本发明的失活HPGGT的抗体的那些杂交瘤细胞系。具体地，可以通过应用HPGGT活性测定进行筛选来选择杂交瘤，从而识别产生消除HPGGT催化和抑制功能的抗体的杂交瘤。
在另一方面，本发明涉及编码按照本发明的多肽和按照本发明的失活HPGGT的核酸。本领域中技术人员应该承认已知在宿主生物体中是遗传密码和，任选地密码子来表示所述核酸，本领域中的技术人员可以制备所述核酸。在另一方面，所述核酸包含在载体，优选地表达载体中。在一个实施方案中，术语载体包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和通常用于遗传工程领域中的其他载体。在另一方面，本发明涉及包括所述载体的宿主生物体。在实施方案中，所述宿主生物体和具体地宿主细胞是重组宿主细胞，其瞬时或稳定地包含本发明的核酸分子或载体。理解宿主细胞或宿主生物体是能够吸收体外重组DNA并，如果是这种情形，则合成由本发明核酸分子编码的蛋白质的生物体。优选地，这些细胞是原核或真核细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。优选地，本发明的宿主细胞的特征在于这样的事实，即引入的本发明的核酸分子对于转化的细胞而言是异源的，即它不天然存在于这些细胞中，或局限于基因组中的一个位置，该位置与相应的天然存在的序列的位置不同。
本发明的另一个实施方案涉及分离的蛋白质，其表现出HPgGT，优选地，其中正常存在的分泌序列被除去或是非-功能性的，并由本发明的核酸分子编码的HPgGT的生物学性质，以及涉及用于它们的生产的方法，其中，例如，在容许合成所述蛋白质的条件下培养本发明的宿主细胞和随后从培养的细胞和/或培养基中分离所述蛋白质。重组生成的蛋白质的分离和纯化可以通过常规方法，包括制备性层析法和涉及单克隆或多克隆抗体亲合层析法的亲合和免疫学分离执行。用于本文时，术语"分离的蛋白质"包括基本无与之天然结合的其他蛋白、核酸、脂质、碳水化合物或其他物质的蛋白。然而，所述蛋白质不仅包括重组产生的蛋白质，还包括分离的天然存在的蛋白质、合成产生的蛋白质、或通过这些方法的组合产生的蛋白质。用于制备所述蛋白质的方法是本领域熟知的。本发明的蛋白质优选地处于基本纯化的形式。
因此，本发明还涉及在原核或真核宿主细胞制造蛋白质的一般方法，外部应用时对所述细胞是有害的，所述方法包括(a)在一定条件下培养用编码所述蛋白质的核酸序列转染的宿主细胞，所述蛋白质具有删除的或非-功能性分泌信号序列，所述条件是表达所述蛋白质；和(b)从所述细胞中回收所述蛋白质。也对用编码按照本发明的多肽的核酸转染的宿主细胞应用相同的方法，所述多肽是可以从所述细胞中回收的。
应该理解，优选地，可以将按照本发明的抗体、抗促成素、肽适体、
适体和镜像异构适体认作为针对幽门螺旋菌的Y谷氨酰基转肽基酶(HPGGT)的配体。
本发明包括术语野生型HPGGT或相似的表述优选地意指野生型的HPGGT，其缺乏分泌序列，但是是催化活性的，更具体地，催化本文中关于HPGGT所述的酶反应。
现在通过附图和实施例进一步说明本发明，从所述附图和实施例可以获得其他特征、实施方案和优点。


图1A是一个表，其指示根据Kim等和Bumann等9'1Q，从幽门螺旋菌中分泌的具有分子量30-66kDa的蛋白。
图1B是银染色后的SDS-PAGE，显示了来自大小排阻层析的洗脱馏分中的蛋白质，其中只有馏分b-f抑制了人T细胞的增殖，而所有其他馏分没有；由箭头标记了与馏分的抑制特征相对应的蛋白质条带。
图1C是柱形图，表示通过如实施例1中所述的分光光度测定确定的凝胶过滤馏分的酶GGT活性。(HP-幽门螺旋菌)。图2A-C是柱形图，显示在通过311-胸苷引入测定确定存在或缺乏指定的HPSN的条件下受刺激的PBMC(A)和分离的初级人T淋巴细胞(C)的细胞增殖；构建的敲除株的GGT表现型是通过酶活性测定和利用针对大GGT-亚单位的多克隆抗体的免疫印迹证实的(B)。为了免疫印迹，使用了 30jiig的HPSN蛋白。对抗-VacA抗体的免疫印迹用作装载对照(见插入图)。数据表示三次独立实验的平均值± SD。认为如通过StudenU-检验确定的+P值〈001是显著的。(m^幽门螺旋菌，SN:上清液，WT-野生型)。
图3A和B描述对纯化的具有针对其大亚单位的抗-GGT抗体的重组HPGGT馏分银染色(A)和免疫印迹(B)后的凝胶，其显示了 GGT的处理。星号表示***原-形式，**大和*小亚单位。
图3C-3E是柱形图，其显示由大肠杆菌中表达的重组HPGGT(rHPGGT)引起的酶活性(C)和人PBMC的增殖抑制(D)。作为对照使用的来自大肠杆菌的LPS不抑制PBMC增殖。重组HPGGT在pH 2-10显示出催化活性(E)。数据表示三次独立实验的平均值士 SD。认为如通过StudenU-检验确定的申P值〈.001是显著的。(FT-流经，ffi^幽门螺旋菌)。图4A-D是柱形图，显示从马肾中纯化的GGT表现出催化GGT活性
(A) 但缺乏针对淋巴细胞的增殖-抑制作用(B)。重组HPGGT在Ser451/452 (S451/452A)处的位点定向诱变消除GGT酶活性(A)和抑制作用
(B) 。用阿西维辛(50pM)在37。C预培养HPWTSN2小时消除GGT活性
(C) 和PBMC增殖的抑制(D)。数据表示三次独立实验的平均值士SD。认为如通过Studentf-检验确定的申P值<.05是显著的。(HP-幽门螺旋菌，SN-上清液，WT-野生型)。
图5A和B是图表，显示由PBMC产生的细胞因子IL-2 (A)和IFN-y(B)，如实施例中所述地，这是在通过ELISA24小时后测量的。数据表示三次独立实验的平均值土 SD。指示通过Student ,-检验确定的P值。
图5C描述Jurkat T细胞的FACS-分析结果，所述Jurkat T细胞是如所示(灰色曲线)处理了24小时，并用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭染色的。通过测试10000个事件的FACS-分析确定凋亡Jurkat T细胞的比率。抗癌药星形孢菌素(空白曲线)，用作阳性对照，在lpM的浓度时强烈诱导凋亡。(^>=幽门螺旋菌，WT^野生型)。
图6A显示在存在或不存在指定的HPSN的条件下处理了 24小时的JurkatT细胞的细胞周期分析结果。描述了处于Gl-期(左下)、早和晚S-期(左上和右上)和G2-期(右下)中的细胞的百分比(y-轴BrdU-FITC;x-轴PI)。通过免疫印迹在相同细胞中确定细胞周期调节蛋白的细胞水平。
图6B是获自107 PBMC的蛋白质的SDS PAGE,所述PBMC是在不同浓度的HPWT和HPAGGTSN或rHPGGT中培养了 24小时和48小时并随后被溶解的。通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹分析35pg总蛋白。利用相应的抗体确定指定的蛋白质的水平。以相似结果重新数据2次。(HP-幽门螺旋菌，SN-上清液，WT:野生型)。
图7是来自幽门螺旋菌阳性(泳道l-9)和阴性(泳道10-14)的血清的免疫印迹，其中通过如实施例1中所述的免疫印迹测试患者是否存在针对HPGGT的抗体。使用兔抗-GGT抗体(aGGT)作为阳性对照。星号表示HPGGT蛋白的"f原-形式和**大亚单位。
图8是柱形图，显示HPGGT抑制淋巴细胞增殖依赖于谷氨酰胺，但不受谷氨酸或g-谷氨酰基谷氨酰胺，也不受谷氨酰胺消耗的介导。用PMA/伊屋诺霉素(除基础外的所有)刺激并如所示处理PBMC。以2pg/ml使用的Rek. HPGGT在24小时后失活。然后，改变培养基并在刺激后，将HPGGT-处理的培养基加入到PBMC中。同时(未显示)或也在24小时后，以2mM加入谷氨酰胺，从而研究可能的谷氨酰胺消耗。BPMC刺激后加入谷氨酸或g-谷氨酰基谷氨酰胺，从而研究可能的抑制作用。不具有(w/o)谷氨酰胺的氨基酸用于显示抑制作用对谷氨酰胺的依赖性。
图9是图表，显示来自免疫的或感染的小鼠的血清对HPGGT酶活性的抑制作用。小鼠受到指定的制剂的免疫，或接受PBS作为对照，或受到活的幽门螺旋菌的感染。免疫或感染后6周时，从尾静脉获取血清，并分析针对GGT催化活性的抑制活性。CT—GGT，可溶性CT和失活GGT蛋白，[CT—GGT]enc，包封在微球中的CT和失活GGT蛋白。
实施例1:材料和方法
细菌培养。本研究中使用的幽门螺旋菌野生型菌株G27 WT (VacA+cagA+)获自A. Covacd (IRIS,锡耶纳，意大利)。将该细菌培养在增补了前述登特增补剂抗生素混合物的(Dent supplement antibiotic mix) (Oxoid,Wesel,德国)Wilkins-Chalgren或脑心浸液(BHI)板上。29在增补了 10%FCS(西格玛，慕尼黑，德国)和1。/。登特增补剂的BHI肉汤中进行HP的液体培养。为了生产HP上清液，使细菌在板上生长48小时，在磷酸盐缓冲液
(PBS)中清洗3次，并调节至OD6,m为K对应于大约2xl()S个细菌/ml)。在微需氧条件下，在PBS中剧烈摇动培养所述细菌2小时，并通过随后以3000xg和10000xg离心步骤沉淀去除细菌和膜。随后，利用超滤浓縮上清液(Amicon UltraMWCO 10kDa,微孔(Millipore) , Schwalbach,德国)。以牛血清清蛋白作为标准，通过布氏测定(Bradfordassay) (Bio-Rad实验室
(Bio-Rad Laboratories) ， Richmond, VA)测量上清液的总蛋白含量，并保存在-80。C。在Luria肉汤(LB)琼脂板(USB, Cleveland, OH)上，并且对于液体培养物在具有相关抗生素的LB肉汤中(USB)培养大肠杆菌。
幽门螺旋菌上清液的凝胶过滤层析。如上所述制备来自幽门螺旋菌野生型菌株G27的上清液。如前所述进行大小排阻层析3。简要地，将500)ig蛋白质加载到Superdex 200 10/300柱(GE卫生保健(GE Healthcare),慕尼黑，德国)上，并在4。C用脱气的PBS洗脱。标准蛋白a-淀粉酶(200kDa),乙醇脱氢酶(150 kDa),牛血清清蛋白(66 kDa)，和碳酸酐酶(29 kDa)用于进行洗脱的蛋白质的分子量评估。如下所述测试每种馏分的增殖抑制和GGT活性。
生成GGT突变菌株。通过天然转化将GGT k.o.质粒转化到幽门螺旋菌菌株G27中。在包含25 jug/ml卡那霉素(西格玛)的琼脂板上培养转化株。3天后，挑取克隆并涂布在具有卡那霉素的新鲜琼脂板上。质粒的插入是通过细菌 DNA 的 PCR (引物有义链5'-AAACGATTGGCTTGGGTGTGATAG-3' (SEQ.ID.No.6); 反义链5'-GACCGGCTTAGTAACGATTTGATAG-3' (SEQ.ID.No.7))和来自幽门螺旋菌AGGT上清液的蛋白质的Western印迹证实的。
细胞培养如前所述进行外周血淋巴细胞(PBMC)的分离3。在37。C，5% C02下培养所有的细胞。在具有10% FCS的RPMI 1640 (Invitrogen,Karlsruhe，德国)中培养Jurkat T细胞和PBMC。在增补了 10%马血清(Cambrex， Verviers,比利时)的DMEM(Invitrogen)培养EL-4 T细胞。
分离初级人T淋巴细胞。通过按照制造商的说明书，使用PanT细胞分离试剂盒II (Miltenyi生物技术(Miltenyi Biotech) , Bergisch Gladbach，德国)，通过阴性选择，从来自未感染幽门螺旋菌的健康志愿者的暗黄覆盖层或肝素化的外周静脉血中分离初级人T细胞。
细胞增殖测定在96-孔平底板的完全培养基中培养细胞(l()SpBMC,纯化的初级T细胞或104 Jurkat/EL-4细胞/孔)。用PMA(20ng/ml;西格玛)和伊屋诺霉素(100ng/ml;西格玛)一式三份地刺激PBMC，并使所有细胞在具有或不具有指定的幽门螺旋菌上清液或重组蛋白的总蛋白浓度下生长。如上所述用PMA/伊屋诺霉素或用处于1个珠/T细胞的抗-CD3/CD28珠(Invitrogen)刺激初级人T细胞。48小时后，使用Packard直接(3计数器矩阵9600 (Packard Direct Beta Counter Matrix 9600) (Packard仪器公司(Packard Instruments Co) ， Downer's Grove, IL)，通过甲基-[3司-胸苷(GEHealthcare)的引入确定细胞增殖。
制备重组蛋白。按照制造商的说明书，将幽门螺旋菌的GGT蛋白表达为6xHis-标记的蛋白质(Qiagen，Hilden,德国)。通过PCR扩增来自幽门螺旋菌的 GGT 蛋白的编码区(引物有义链5'-TGAAAGGAAAACCCATGGGACGGAG-3' (SEQ:ID.No.8);反义链5'-CAAAGGTACCAAATTCTTTCCTTGG-3' (SEQ，ID.No.9))。通过琼脂糖凝胶电泳分离并通过凝胶提取纯化PCR产物(Qiagen)。然而，用Ncol和Kpnl (新英格兰生物实验室(New England Biolabs) , Ipswich, MA)对其进.行限制性酶切，并随后在重新-纯化后将其连接到pQE-Tri系统载体(Qiagen)中。将由此产生的载体转化到大肠杆菌菌株M15中。用转化的细菌的过夜培养物接种增补了 lOOpg/ml氨苄青霉素(西格玛)和25pg/ml卡那霉素的LB肉汤，并在剧烈摇动下，在37。C生长，直到OD,达到0.6。重组HPGGT的表达通过添加最终浓度为lmM的异丙基(3-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG; Applichem， Darmstadt,德国)受到诱导，并在25。C进行4小时，从而最小化内含体的量。然后，在4。C离心(5000xg)全部培养物10分钟。为了在自然条件下的细胞溶解，将沉淀溶解在包含蛋白酶抑制剂(关于His-标记的蛋白质的蛋白酶抑制剂混合物，西格玛)的冰冷的结合缓冲液(20mM Tris/HCl, 500mM NaCl, 20mM咪唑(西格玛)，pH 7.4)中。然后，通过在液N2中进行的两个冷冻和融化循环和随后在冰上进行的超声波降解法(2xl分钟超声波降解，它们之间在冰上间隔5分钟)溶解细胞。离心(17500xg，在4。C)10分钟后，对上清液进行DNA和RNA消化。进一步离心步骤(22000xg， IO分钟，4。C)后，准备上清液，以进行纯化。在第一纯化步骤中，使用5ml HisTrapHP柱(GE卫生保健(GE Healthcare))。在RT下进行纯化，并将样品始终保持在冰上。将大肠杆菌的溶解产物，以lml/分钟，加载到Ni-琼脂糖柱上，并收集流出液。样品加载后，用10倍柱体积(cv)的结合缓冲液、10倍cv的清洗缓冲液(20mMTris/HCl， 900mMNaCl, 20mM咪唑，pH 7.4)和另外的10倍cv的结合缓冲液清洗该柱。利用阶梯式咪唑梯度(100mM阶梯)，用洗脱缓冲液(20mMTris/HCl， 500mMNaCl, 100-1000mM咪唑,pH 7.4)洗脱结合的蛋白质。将洗出液收集在一份馏分/阶梯度中。然后测试每份馏分的GGT酶活性，并进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。为了进一步纯化重组的HPGGT，汇集来自Ni-琼脂糖亲合层析的酶活性馏分，在4°C针对20mM Tris/HCl pH 7.5透析1小时，并进行第二纯化步骤。将透析的样品加载到Affi-Gel Blue (BioRad)柱(cv: 12.3ml)上。用2倍cv的结合缓冲液清洗该柱，并用洗脱缓冲液(20mMTris/HCl,50-1000mMNaCl， pH 7.5)，利用阶梯式NaCl梯度(50mM阶梯)洗脱结合的蛋白质。通过利用抗-GGT抗体的免疫印迹(见下)和通过GGT酶活性测定(见下)分析所有收集的馏分是否存在重组HPGGT。汇集活性馏分，;在4。C针对20mMTris/HClpH7.5透析90分钟，分成等分试样，并保存在-80。C直至进一步使用。
位点定向诱变。按照制造商的说明书，利用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene,阿姆斯特丹，荷兰)进行HPGGT的位点定向诱变。引物 序 列 如 下 W5〃45Z4 有 义 链 5'画CCAATAAGCGCCCTTTAGCCGCCATGTCGCCTACGATTGTG-3，(SEQ.ID:No. 10); W5〃CZ4 反义链
5'-CACAATCGTAGGCGACATGGCGGCTAAAGGGCGCTTATTGG-3'(SEQ:ID:No. 11)。通过测序证实了成功的诱变。
免疫印迹。为了免疫印迹分析，使用了 10"urkatT细胞或PBMC。在实验前，使Jurkat细胞在包含0.2% FCS的培养基中血清缺乏培养18小时。然后，用10。/。FCS释放并如所述地处理细胞。在指定的时间点处，收获细胞，用冰冷的PBS清洗一次，重新混悬在包含蛋白酶抑制剂(2.5mM焦磷酸钠，lmMJ3-甘油磷酸，lmMNa3V04, lpg/ml拟酶醛肽，lmMPMSF;西格玛)的lx细胞溶解缓冲液Cell Signaling Technology, Danvers, MA)中，并用微尖端超声波降解器在冰上超声波处理30秒。在4°C，以lOOOOxg离心溶解产物10分钟，上清液用于免疫印迹。通过Tricine-SDS-PAGE分离等量的蛋白质(通过Bradford测定确定，BioRad)，并将其电转移到硝化纤维膜上(BioRad)。为了检测，用初级抗体抗-p27、抗-细胞周期蛋白D3、抗-细胞周期蛋白E、抗-c-Myc (Dianova,汉堡，德国)，抗-Cdk2(Santa-Cruz生物技术(Santa-CruzBiotechnology),海德堡，德国)，抗-磷-AKT (Ser 473)，抗-磷-c-Raf (Ser 338),抗-磷-p70S6K (Thr 389;细胞信号传导(Cell Signaling)),抗-磷-FKHRLl/Foxo3 (Thr 32;上州，Placid湖，NY),抗-肌动蛋白(西格玛)和抗-VacA(南部生物学(Austral Biologicals) , SanRamon, CA)探测膜。利用合适的过氧化物酶缀合的第二抗体(Dianova)和化学发光试剂(Perbio Science, Bonn,德国)显示初级抗体的结合。为了检测HPGGT蛋白的大亚单位，使用多克隆兔-抗-GGT抗体，所述抗体是针对包括HP 1118基因产物(Charles River, Kisslegg,德国)的氨基酸残基356-371的合成肽IQPDTVTPSSQIKPGM产生的。
血清印迹。为了检测人血清中的HPGGT特异性抗体，通过SDS-PAGE分离0.1 纯化的重组HPGGT蛋白，并如上所述转移到硝化纤维膜上。用丽春红S溶液(处于H20中的0.2%丽春红S， 3%三氯乙酸)对该膜进行染色，并切割成条带。封闭(lxTBS + 5Q/。低脂奶粉)后，在4。C，随着搅拌，分别用感染和未感染幽门螺旋菌的患者的血清(1:20000稀释在封闭缓冲液中)培养每个条带过夜。清洗后，用HRP-缀合的抗-兔二级抗体(Dianova;稀释1:10000)培养膜条带，并最后，在另一次清洗步骤后，如上所述，通过化学发光反应显示血清抗体与HPGGT蛋白的结合。利用常规幽门螺旋菌IgG ELISA评估患者幽门螺旋菌感染的状况。
细胞周期分析。分析前，使JurkatT细胞(5乂106细胞/分析)在包含0.2% FCS的培养基中血清缺乏培养18小时。用10% FCS释放并用指定的幽门螺旋菌菌株上清液处理细胞24小时后，通过使用FITC-缀合抗隱BniU抗体(BD生物科学(BD Bioscience),海德堡，德国)，按照制造商的说明书，通过BrdU-FITC/PI(西格玛)染色，进行细胞周期分析。在随后的荧光-活化细胞分类器(FACS)分析过程中，利用Becton-DickinsonFACScan流式细胞仪，获得10000个事件。利用Cell Quest软件包(生物科学(BD Biosciences))分析数据。
y-谷氨酰基转肽基酶(GGT)活性测定。根据Mdster等的方法改进了GGT活性的测定。27简要地，制备由20mM作为受体的甘氨酰甘氨酸(西格玛)、2.5 mM作为供体物质的L卞谷氨酰基-p-硝基酰苯胺(anilide)(Calbiochem, Schwalbach，德国)和100 mM Tris-HCl (pH 8.0)组成的反应缓冲液。在一些实验中，测定缓冲液的pH在2-10之间变化。加入不同幽门螺旋菌菌株的上清液、纯化的重组HPGGT或马肾GGT(西格玛)，且在37°C进行反应30分钟。通过分光光度法，在405nm处监测p-硝基酰苯胺的释放。将1活性单位定义为在37°C释放1 pmol p-硝基酰苯胺/分钟/mg蛋白的酶量。
ELISA。如所述地处理PBMC(各5xl()S)24小时。在指定的时间点，通过离心去除细胞，并按照制造商的说明书，通过ELISA分析上清液的IL-2 (eBioscience,圣地亚哥，CA)和IFN-y (生物来源(Biosource),索林根,德国)的量。检测的下限是4pg/ml。
分析凋亡。如所示处理5x105 JurkatT细胞。24小时后，通过离心收获细胞，清洗，重新混悬在500|^1 AnnexinV-结合缓冲液(10mMHEPES/NaOH, pH7.4, 140mM NaCl， 2.5mM CaCl2)中，并用5pl重组的Annexin V-FITC (Caltag， Burlingame， CA)和0.5pg/ml PI在室温，黑暗下各染色10分钟。通过FACS分析测量凋亡的细胞(见上)。利用Cell Quest软件分析数据。
统计学。将数据表示为平均值士标准偏差(SD)。为了统计学分析，使用Student Mt验。认为P-值〈0.05是显著的。
实施例2:确定作为幽门螺旋菌假定T细胞增殖抑制蛋白的GGT
先前显示了从幽门螺旋菌中分泌的低分子量蛋白抑制T淋巴细胞的增殖。3为了确定免疫抑制因子，对来自幽门螺旋菌菌株G27的上清液进行大小排阻层析。符合先前的工作，只有洗脱具有分子量30-66kDa的馏分抑制淋巴细胞的增殖，而所有其他馏分不抑制(数据未显示)。
先前，两个独立的小组通过不同的蛋白质组技术进行分泌的幽门螺旋菌蛋白的系统分析。9，10利用这些数据，列出了具有分子量30-66 kDa的所有分泌的幽门螺旋菌蛋白(图1A)。通过SDS-PAGE和银染色进一步分析所获得的层析馏分的蛋白质(图1A)。发现四种具有30-66 kDa尺寸的潜在候选者，其表现出与该馏分的抑制活性特征相匹配的洗脱特征(图1B;由箭头表示)。抑制馏分中的所有其他蛋白质条带也出现在非-抑制的馏分中，并因此可以不对T细胞增殖抑制负责。这四种候选蛋白中的两种的分子量(图1B)对应于分泌的幽门螺旋菌蛋白y-谷氨酰基转肽基酶(GGT,HP1118)的片段。位于60 kDa的第一条带可能代表GGT-原-形(MW 61kDa)，且位于38kDa的另一个条带可能代表GGT的大亚单位。"为了研究这些上清液馏分中催化活性HPGGT的存在，进行光度GGT活性测定。图1C显示只有抑制淋巴细胞增殖的馏分(b-f)也表现出GGT活性。
实施例3: GGT-缺陷型幽门螺旋菌突变体缺乏抑制T细胞增殖的能力
为了确定GGT是否对观察到的淋巴细胞增殖抑制负责，产生幽门螺旋菌的同基因GGT敲除突变体。如其他小组所述地，所述突变体正常体外生长，这说明GGT对幽门螺旋菌的存活不是必需的。"，。"测试这些突变体的上清液，以获得它们与相应的野生型菌株相比，对受到抗-CD3/CD28或PMA/伊屋诺霉素刺激的分离的人T细胞和PBMC的增殖抑制活性(图2A、 C)。与野生型菌株相反，完全消除了AGGT细菌针对初级人T细胞和PBMC的抑制潜力。为了排除GGT的自发重组和再活化，通过测量酶活性和通过利用我们针对HPGGT的大亚单位生成的多克隆抗体的免疫印迹验证来自GGT-缺陷型细菌的上清液。加载对照显示来自野生型和GGT-缺陷型细菌的上清液中存在分泌的VacA蛋白质(图2B)。因此，GGT对由幽门螺旋菌引起的T细胞增殖抑制负责。
实施例4:重组HPGGT抑制淋巴细胞的增殖。为了进一步显示观察到的抑制作用是通过HPGGT单独介导的，表
达了大肠杆菌中的重组His-标记的HPGGT蛋白。如"材料和方法"部分 中所述，通过层析法将蛋白质纯化为同质性。SDS-PAGE和银染色以及免 疫印迹显示将重组HPGGT合成为原-形，并随后分别处理为具有分子量 38和 20kDa的大和小亚单位(图3A、 B)。重组蛋白质显示强GGT活 性(图3C)并有效抑制PBMC增殖(图3D)。另夕卜，其他实验显示HPGGT 在pH2-10范围内的催化活性(图3E)支持感染位点存在功能酶。
实施例5: HPGGT的抑制作用依赖于催化GGT活性。
由于GGT也通过哺乳动物细胞包括人T细胞表达，所以我试图确定 哺乳动物GGT是否也抑制淋巴细胞增殖。从马肾中纯化的GGT表现出催 化活性(图4A)。然而，与HPGGT相比甚至4倍更高量的马GGT不能 抑制PBMC增殖(图4B)。为了探究抑制T细胞增殖是否需要GGT的催 化转肽基酶活性，我们生成了重组蛋白质的突变体。我们发现将丝氨酸残 基451和452诱变为丙氨酸(S451/452A)完全消除重组HPGGT的酶活性(图 4A)，并且还消除淋巴细胞增殖抑制(图4B)。
为了证实这些结果，用GGT抑制剂阿西维辛预培养来自幽门螺旋菌 野生型菌株G27的重组HPGGT和上清液。该化合物起到GGT的不可逆 转的竞争性抑制剂的作用。显示出由阿西维辛引起的GGT抑制涉及其在 结合附着于GGT的指定羟基的抑制种类中的酶后的转化。14，15酶GGT活 性的测量和淋巴细胞增殖的确定显示利用阿西维辛的预处理通过幽门螺 旋菌野生型上清液，完全抑制GGT活性(图4C)和PBMC增殖的抑制(图 4D)。对重组HPGGT获得了相似的结果(数据未显示)。
实施例6: HPGGT在不减少IL-2和IFN，分泌物的条件下和在不诱导凋亡 的条件下抑制淋巴细胞增殖。
至今尚不知HPGGT在抑制宿主免疫应答过程中的作用。本文中报 告的由HPGGT引起的淋巴细胞增殖抑制可以由干扰人PBMC的细胞因子 分泌而产生。为了测试该假说，用PMA和伊屋诺霉素刺激细胞，并在具 有或不具有处于不同浓度的幽门螺旋菌野生型和AGGT上清液或重组HPGGT的条件下进行培养24小时。与受刺激的对照相比，这些处理中没 有一种导致IL-2分泌物的减少(图5A)，已知这对于淋巴细胞增殖是必需 的。另外，IFN-Y分泌物没有减少(图5B)。因此，我们显示由HPGGT引 起的T细胞增殖抑制不是由这些细胞减少的活化引起的。先前的报告提示 在胃上皮细胞中由HPGGT诱导氧化压力和凋亡。12'16然而，尚不知来自 幽门螺旋菌的GGT对淋巴细胞的作用。
另外的报告提示由幽门螺旋菌在T细胞中诱导的凋亡作为通过该细 菌抑制T细胞增殖的机制(Wang等免疫学杂志(J Immunol) 2001)。为了 检查凋亡是造成由本文所述HPGGT引起的淋巴细胞增殖减少的原因的可 能性，利用JurkatT细胞进行了 Annexin V-FITC/PI染色和随后的FACS分 析(图5C)。来自幽门螺旋菌野生型和AGGT菌株的上清液或以导致强烈 淋巴细胞增殖抑制的浓度使用的重组HPGGT均不诱导凋亡的增加。因此， 由HPGGT消除T细胞增殖是由凋亡-依赖性机制介导的。
实施例7: HPGGT对T细胞中的细胞周期进展的作用。
接下来，我们试图进一步表征HPGGT对T细胞增殖中涉及的细胞 过程的作用。利用BrdU/PI-染色的分析显示由来自幽门螺旋菌的野生型而 非由GGT-缺陷型上清液诱导的Jurkat T细胞中的Gl细胞周期停滞(图 6A)。该停滞的特征在于在存在幽门螺旋菌GGT条件下，Gl期(图6A; 左下象限)中细胞从35°/。增加至46%。因此，在用幽门螺旋菌的野生型而 非GGT-缺陷型上清液处理过程中，与对照(基础的，55%)相比，S-期(左 上和右上象限)中的细胞量减少至38%。于此相符合地，相同样品的免疫 印迹分析显示细胞的细胞周期蛋白D3以及E1蛋白水平的明确减少。另外， Cdk-抑制剂p27Kipl的量以GGT-依赖性方式升高(图6A)。用10和 5pg/ml HP WT上清液处理的细胞之间的细胞周期蛋白水平的差别说明 为了对抗淋巴细胞增殖，必须超过GGT活性的阈值。这在上清液中总蛋 白浓度为10pg/ml的情形中非常明显。在较低浓度5pg/ml时，GGT需要 更长时间抑制淋巴细胞中的细胞周期进展。利用重组HPGGT蛋白，我们 观察到在低至2pg/ml浓度时细胞周期蛋白水平的完全减少。
在人PBMC情形中证实了这些结果，其在受到重组HPGGT或来自幽门螺旋菌野生型而非AGGT菌株的不同浓度上清液处理时，表现出相同
细胞周期调节蛋白甚至更强烈的减少(图6B)。我们的结果清楚的指出 GGT是造成由幽门螺旋菌诱导的T淋巴细胞中的Gl细胞周期停滞的因 素。
实施例8:在T细胞中用Ras-依赖性信号传导干扰HPGGT。
Ras-和PI3K-依赖性途径是细胞周期进展的关键调节子。由于显示出 这些途径在T细胞中不彼此依赖地发生17，我们研究了幽门螺旋菌上清液 以及重组HPGGT对这两个途径中重要成员活化状态的影响。免疫印迹分 析来自Jurkat T细胞和PBMC的细胞溶解产物显示AKT、 p70S6k和Foxo 3,即PI3K-信号传导的重要介体的细胞水平和磷酸化在存在HPGGT的条 件下不减少(图6A)。相反，c-Myc的细胞水平以及c-Raf蛋白，艮卩Ras-依赖性途径的中心介导子的磷酸化在相同细胞中存在HPGGT的条件下减 少(图6A、 B)。
实施例9:针对HP-阳性患者血清中HPGGT的抗体应答
尽管显示出来自幽门螺旋菌的GGT由该细菌分泌到细胞外的培养 基中(Bumann等)，但是该蛋白质是否到达固有层中的T细胞，从而发挥 其免疫抑制作用尚不清楚。为了解决这个问题，我们测试了来自14名患 者(9名感染幽门螺旋菌的和5名未感染幽门螺旋菌的)的血清是否存在 HPGGT特异性抗体。结果显示在幽门螺旋菌-阳性(图7， 1-9)而非未感 染的患者(图7， 10-14)中针对HPGGT的原形和大亚单位的强烈抗体应 答，这提示了HPGGT与人免疫系统的相互作用。
实施例10:免疫而非感染后针对HPGGT的抑制免疫应答
用位于距幽门螺旋菌Y-谷氨酰基-转肽基酶(HPGGT)的催化中心远 程(fare distance)的肽356 IQPDTVTPSSQIKPGM 371或用与作为佐剂的 CT联合的失活重组HPGGT蛋白接种动物。只有在用HPGGT失活形式接 种的动物中，血清中的抑制性抗体是可以利用标准HPgGT活化测定检测 的。在仅接受缓冲液的对照动物中、在感染的动物中或在用肽356-371接种的动物中没有检测到抑制性免疫应答。这些结果证明针对HPGGT的抑 制性免疫应答是可以实现的，且高度依赖于抗原的选择。此外，幽门螺旋 菌的感染不引起所述抑制性应答。 结果显示在图9中。
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说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明特征可以独立地和以其 任何组合作为以其多种形式实现本发明的材料。
权利要求
1.包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与由包括对应于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT区域的一段连续氨基酸序列至少80％相同，其中所述区域通过以下各项定义(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽适合于引起能够抑制HPGGT催化活性的免疫应答。
2. 按照权利要求1的多肽，其中所述多肽包括约15-约30个氨基酸。
3. 多肽，优选地，按照权利要求1或2的多肽，其中所述多肽包括对应于下列各项的氨基酸序列-(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括约15-约30个氨基酸。
4. 按照权利要求3的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列对应于所述位 置的一段15-30个连续氨基酸的序列。
5. 按照权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述多肽包括选自包括下 列各项组中的一个序列QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANA正ANKRPL (SEQ.ID.No.4)禾口 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
6. 免疫原性组合物，包括一种或数种按照权利要求1-5中任一项的多肽。
7. 免疫原性组合物，包括HPGGT的失活形式。
8. 免疫原性组合物，包括HPGGT的片段，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段连续氨基酸序列组成。
9. 按照权利要求6-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物用 于动物或人的疫苗接种。
10. 按照权利要求6-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物能够在动物或人中诱导免疫应答。
11. 按照权利要求6-10中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫应 答是抗体应答。
12. 按照权利要求6-11中任一项的免疫原性组合物，其中所述抗体应 答包括对HPGGT，更优选地，对HPGGT的特异性活性具有抑制作用和/ 或对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制具有消除作用的抗体。
13. 按照权利要求6-12中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物 用于在患有幽门螺旋菌(//. j^/on')感染或处于发展幽门螺旋菌感染风险 中的患者中促进淋巴细胞的活化和增殖。
14. 按照权利要求13的免疫原性组合物，其中所述淋巴细胞是B或T 细胞。
15. 按照权利要求6-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物 包括一种或数种佐剂。
16. 按照权利要求6-15中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物 包括一种或数种来自幽门螺旋菌的抗原。
17. 按照权利要求16的免疫原性组合物，其中所述抗原选自包括外膜 蛋白的组。
18. 按照权利要求17的免疫原性组合物，其中所述抗原选自包括 HpaA、 Ompl8和其组合的组。
19. 按照权利要求6-18中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物 用于预防和/或治疗由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由 幽门螺旋菌感染引起的或与之相关的疾病。
20. 按照权利要求19的免疫原性组合物，其中所述疾病选自包括下列 各项的组幽门螺旋菌感染、由幽门螺旋菌引起的胃与十二指肠病症、胃 炎、慢性胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
21. 按照权利要求6-20中任一项的免疫 性组合物，其中所述免疫原 性组合物是疫苗。
22. 按照权利要求1-5中任一项的多肽用于制备药物的用途。
23. 按照权利要求6-21中任一项的免疫原性组合物用于制备药物的用途。
24. 按照权利要求22-23中任一项的用途，其中所述药物是疫苗。
25. 按照权利要求22-24中任一项的用途，其中所述药物用于预防和/ 或治疗由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌 感染引起的或与之相关的疾病。
26. 按照权利要求1-5中任一项的多肽用于检测样品中抗体的用途， 其中所述抗体针对HPGGT。
27. 按照权利要求26的用途，其中所述抗体能够抑制HPGGT酶活性 和/或HPgGT对淋巴细胞增殖的抑制活性。
28. 特异性结合按照权利要求1-5中任一项的多肽的抗体。
29. 按照权利要求28的抗体，其中抗体具有对HPGGT，更优选地， 对HPGGT的特异性活性的抑制作用和/或对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖 性淋巴细胞抑制的消除作用。
30. 编码按照权利要求28-29中任一项的抗体的核酸。
31. 特异性结合按照权利要求1-5中任一项的多肽或结合HPGGT的片 段的核酸，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的一段连续 氨基酸序列组成，其中所述核酸分子选自包括适体和镜像异构适体的组。
32. 按照权利要求31的核酸，其中所述核酸具有对HPGGT，更优选 地，对HPGGT的特异性活性的抑制作用和/或对淋巴细胞增殖的HPGGT 依赖性抑制的消除作用。
33. 按照权利要求28-29中任一项的抗体用于制备药物的用途。
34. 按照权利要求31-32中任一项的核酸用于制备药物的用途。
35. 按照权利要求33-34中任一项的用途，其中所述药物用于治疗和/ 或预防由幽门螺旋菌引起的或与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌 感染引起的或与之相关的疾病。
36. 用于确定治疗疾病的候选药物的方法，所述方法包括评估候选药 物的下列各项的步骤a.对幽门螺旋菌的Y-谷氨酰基转肽基酶的特异性活性的抑制作用和b.对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除作用。
37. 按照权利要求36的方法，其中所述疾病是由幽门螺旋菌引起的或 与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染和更优选地，人中的幽门 螺旋菌感染引起的或与之相关的疾病。
38. 用于开发疫苗的方法，所述方法包括下列步骤a) 提供包括HPGGT或其至少一个片段的免疫原性组合物；b) 用所述免疫原性组合物免疫动物，并由此产生抗体；c) 评估所述抗体关于它们对幽门螺旋菌的丫-谷氨酰基转肽基酶的特 异性活性的抑制作用和它们对淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制的消除 作用和d) 选择合适的免疫原性组合物。
39. 按照权利要求38的方法，其中所述疫苗是针对人中幽门螺旋菌感 染的疫苗。
40. HPGGT的配体制备用于预防和/或疾病的药物的用途，其中所述配 体显著抑制HPGGT活性并消除淋巴细胞增殖的HPGGT依赖性抑制。
41. 按照权利要求40的用途，其中所述疾病是由幽门螺旋菌引起的或 与之相关的疾病，更优选地，由幽门螺旋菌感染引起的或与之相关的疾病。
42. 按照权利要求40-41中任一项的用途，其中所述配体是按照权利 要求28或29中任一项的抗体，或按照权利要求31-32中任一项的核酸。
43. 按照权利要求40或42中任一项的用途，其中在淋巴细胞增殖测 定中评估淋巴细胞增殖。 —
44. HPGGT用于制备免疫抑制组合物的用途。
45. 免疫抑制组合物，所述免疫抑制组合物是在容许HPGGT特异性 活性的培养基中培养HPGGT和谷氨酰胺后作为上清液获得的。
全文摘要
本发明涉及包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与包括对应于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT区域的一段连续氨基酸序列至少80％相同，其中所述区域通过以下各项定义(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽适合于引起能够抑制HPGGT催化活性的免疫应答。
文档编号G01N33/50GK101594880SQ200780046762
公开日2009年12月2日 申请日期2007年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者克里斯蒂安·施梅斯, 马尔库斯·格哈德 申请人:马尔库斯·格哈德