专利名称：：肽和蛋白的定量方法
技术领域：
：本发明涉及测定方法，其能够高精度地和容易地定量以痕量包含的特定蛋白或肽，甚至不使用任何昂贵的试剂。
背景技术：
：作为定量以痕量包含在测定样品中的特定蛋白的方法，使用特定蛋白的抗体的ELISA是已知的。然而，为了制备抗体，需要制备用作抗原的高纯度的肽或蛋白，以及通过给药该肽或蛋白至动物来制备抗血清，因此该方法非常麻烦。此外，抗体可以与高度同源的蛋白反应，因此需要检查是否仅特定蛋白被测定。此外，由于热变性等，蛋白与抗体的反应性改变。因此，在灭菌产品例如食品中，即使通过上述ELISA测定特定蛋白，也不可能高精度地确定蛋白含量。近年来已经快速发展的蛋白的定量分析方法，包括使用高效液相色谱串联质i脊(下文中称为LC/MS/MS)的方法。已开发以下方法以用于鉴定蛋白，其包括通过二维电泳进行分离包含许多种蛋白的样品，以及通过LC/MS/MS测定通过酶处理所得的斑点获得的肽。如果测定通过LC/MS/MS进行，有以下优点可以减少预处理的步骤，这是因为不需要在传统GC/MS中所需的衍生化，以及可以测定聚合物化合物例如蛋白或肽。在通过LC/MS/MS筌定蛋白的方法中，能够通过以下鉴定蛋白通过第一MS,确定使用特定的蛋白酶从样品蛋白中产生的肽片段的质量；使所述肽片段化；进行第二MS以预测肽的氨基酸序列；并且将所有预测的肽序列与数据库比较。作为通过LC/MS/MS定量蛋白的方法，已经报道了这样的方法，其包括用氘标记在目标肽中的氨基酸和测定所述氨基酸(参见例如非专利文献l)。然而，在该方法中，将氘标记的氨基酸用作内标物质，由于氘标记的氨基酸非常昂贵和稀少，使用该方法的肽合成限制其应用。此外，7>开了通过LC/MS/MS^r测在复杂混合物中的动物源蛋白的方法(参见例如专利文献l)。然而，该方法在除去千护C物质和将污染物水平维持在低水平上存在困难，并且还需要繁瑣的步骤。需要这样的测量方法，其能够高精度地和容易地定量以痕量包含的特定蛋白或肽，甚至不使用任何昂贵的试剂。[专利文南史l]JP2005-513481BDavidR.Barnidge等，AnalyticalChemistry,Vol.75,No.3,2003。
发明内容发明要解决的问题本发明的目的在于提供测定方法，其能够容易地和更高精度地定量蛋白或肽，而不使用任何昂贵的试剂。用于解决问题的方案本发明的发明人已经探求能够更高精度地定量蛋白或肽的测定方法。结果，发明人已经发现以下方法。在测定蛋白A的情况下，首先，用酶分解蛋白A以产生肽B。肽B的部分氨基酸序列被取代以产生肽C,使用肽C作为内标进行借助LC/MS/MS的测定。同时，在将蛋白A从测定样品中分离然后用酶分解的情况下，为了校正分离操作中的回收率，需要将与蛋白A具有相似性质的蛋白作为用于蛋白A的内标。因此，与蛋白A更相似但不是蛋白A的蛋白D可以通过用肽C的序列:f又代在蛋白A中的肽B的序列来获得。发明人已经发现通过使用蛋白D作为内标，可以以与^吏用肽C的情况相同的方式测定肽B。如上所述，本发明的发明人已经发现将通过改变在要测定的蛋白中特定肽的氨基酸序列中的部分氨基酸结合顺序，而不改变原始肽的大部分性质获得的肽，用作内标，可以通过LC/MS/MS定量要测定的蛋白或肽，由此该发现引起本发明的完成o通过改变在要测定的蛋白的特定肽中的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序，在要测定的蛋白中的特定肽和内标肽在第一MS中表现为具有相同分子量的物质，并且两种肽能够在第二MS中基于氨基酸序列的差异而分离。基于通过第二MS确定的各肽的信号强度的比例，能够定量要测定的蛋白的浓度。与一步MS相比，本发明的测定方法可以提高测定精度，因为基于质量的选捧以两步进行。此外，该方法可以确保仅特定蛋白被测定，因为可以通过第二MS在任何时间获得氨基酸序列的信息。同时，其中将包括氘标记的氨基酸的肽用作内标的传统方法在第一MS中切换目标肽的测定和内标肽的测定的状态下进行，导致测定中精度的降低。另一方面，本发明的方法能够高精度地进行，因为目标肽的分子量与内标肽的相同。如上所述。本发明的方法可以仅改变在氨基酸序列中的氨基酸的结合顺序来进行，因而分析方法简单。此外，测定可以不使用任何昂贵的试剂来进行。此外，内标肽可以使用已有的肽合成仪制备，因而本发明的方法在成本方面优于传统测定方法。根据基因技术的发展，通过取代氨基酸序列获得的蛋白非常容易地通过在基因水平上取代序列来制备。如果在氨基酸序列中的氨基酸的结合顺序上具有改变的蛋白能够用作内标，可以实现高精度地测定，因为所述蛋白以与要测定的蛋白几乎相同的方式表it见为内标。本发明涉及通过使用在要测定的肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的肽作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的肽的方法；通过使用在要测定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的肽作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的蛋白的方法；以及通过使用在要测定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的蛋白作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的蛋白的方法。在本发明中，将不能用酶裂解的氨基酸聚合物例如在测定中所用的胰岛素定义为肽。同时，在本发明中，将能够用酶裂解的氨基酸聚合物定义为蛋白。因此，本发明包括以下构成。(1)通过LC/MS/MS定量肽的方法，包括将在要测定的肽(2)通过LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括将在要测定的(3)通过LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括将在要测定的蛋白的氨基酸序列的顺序上具有改变的蛋白用作内标物质。(4)根据权利要求l-3任一项所述的定量蛋白的方法，其中要测定的蛋白为牛乳铁蛋白、牛乳过氧化物酶、牛血管生成素和牛半胱氨酸蛋白酶抑制剂C中的任一种。发明的效果在氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的蛋白或肽可以非常容易地通过在基因水平上改变结合顺序来制备。认为作为内标的在氨基酸的结合顺序上具有改变的蛋白或肽以与要测定的蛋白几乎相同的方式表现，从而能够更高精度地实现测定。在本发明方法中，与单步MS相比，能够改进精度和特异性，这是因为基于质量的筛选以两步进行。此外，该方法能够确保仅特定蛋白被测定，这是因为在氨基酸序列上的信息可以通过第二MS在任何时间获得。同时，在其中将包括氘标记的氨基酸的肽用作内标的传统方法中，在切换目标肽的测定和内标肽的测定的状态下，进行第二MS,导致测定的精度降低。另一方面，在本发明方法中，能够进行高精确地测定，这是因为目标肽的质量与内标肽的相同。如上所述。本发明的方法可以仅改变在氨基酸序列中氨基酸的结合顺序来进行，因而分析方法简单。此外，测定可以不使用任何昂贵和稀少的试剂来进行。此外，内标肽可以使用已有的肽合成仪制备，因而本发明的方法在成本方面<尤于传统测定方法。图l描述了要测定的肽(LFP01)与内标肽(LFP02)之间的浓度比和此时的面积比(实施例6)之间的关系。具体实施例方式本发明涉及通过使用在要测定的肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的肽作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的肽的方法；通过使用在要测定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序具有上改变的肽作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的蛋白的方法；以及通过使用在要测定的蛋白的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的蛋白作为内标物质，通过LC/MS/MS定量要测定的蛋白的方法。在本发明方法中，首先，确定在要测定的肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的内标肽，以及制备确定的肽。在确定要用作内标的肽时，满足以下条件的肽是合适的。(1)该肽通过以下产生用能够使蛋白酶促反应的变性剂溶解蛋白，用对特定氨基酸具有高度特异性的肽链内切酶，优选例如胰岛素或赖氨酰肽链内切酶(lysylendopeptidase)分解蛋白。具有高度特异性的肽酶是期望的，这是因为如果在复杂的样品系统中蛋白用具有低特异性的肽酶分解，反应效率的改变可能引起要测定的肽的产量的改变。(2)可以使用以上项目(1)中的任何肽，只要该肽通过LC/MS离子化。在通过裂解蛋白获得的肽中，优选当通过LC/MS检测时显示高离子化效率和高检测灵敏性的肽。这是因为，如果将测定目标限定为以最高灵敏性检测的肽，存在该肽不能满足以下条件(3)的担心，因此将所有能够被检测的肽当作目标。(3)此外，为了将肽用作内标，可以4吏用任何肽，只要其在如上项目(2)所述的肽的氨基酸序列中的部分氨基酸上具有改变即可。理想地，优选在通过LC/MS的分离中在相同保留时间洗脱的月太。这是因为，通常可以使用具有不同保留时间的物质或完全不同的物质作为内标进行测定，因此保留时间可以不必然相同，但是在MS/MS中的离子化和片段化优选在相同时间进行。在确定要用作内标的肽时，除了期望满足上述条件以外，还期望满足以下条件的肽。.该肽未磷酸化或未通过糖链改性。.该肽不包含半胱氨酸。-该肽在色谱中在开始后和紧挨终点前不立即洗脱。.该肽难以产生多价离子。此外，测定优选在满足以下注意事项的情况下进行。(A)测定更优选使用具有部分序列与以上项目(3)所述的肽的部分序列相同的要测定的蛋白作为内标来进行。这是因为在部分序列上具有改变的蛋白具有相同的分子量，并且在具有高分离能力的电泳中显示几乎相同的行为等，由于在复杂系统中的测定可能经常需要提取步骤等，但是100%的回收率实际上是不困难的。注意对于要测定的蛋白和用作内标蛋白优选在酶促处理等的效果上不优选不同。(B)通过MS/MS产生的肽为测定的目标。测定目标优选能够以更高灵敏性被检测且与要测定的肽具有不同分子量的肽。确定在要测定的肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序上具有改变的内标肽之后，制备内标肽。该肽通过通用方法例如固相肽合成等制备。此外，已有的肽合成仪例如ABI431A(Boc固相合成法)、ABI433A(Fmoc固相合成法)等可以用于肽制备。肽合成方法可以为当4吏用肽合成仪合成肽时通常进行的方法。通过改变在要测定的蛋白中特定肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序，在要测定的蛋白中的特定肽和内标肽在第一MS中表现为具有相同的分子量的物质，在第二MS中基于氨基酸序列上的差异将肽分离。基于在第二MS中依赖于各肽的信号强度的比，定量要测定的蛋白的浓度。在本发明中，如下进行通过LC/MS/MS的定量。然而，当使用LC/MS/MS时该方法为通用方法，并不是进行本发明的特定方法。通过使用HPLC系统梯度洗脱进行肽的分离。使用具有柱的MAGIC2002HPLC系统(装备有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm)的MAGICC18)以2^L/min的流速分离肽。使用溶液A(2。/o乙腈-0.05。/o甲酸)和溶液B(90。/o乙腈-0.05Q/o曱酸)，溶液B范围从2%至65%,进行梯度洗脱20分钟。要测定的离子为母离子m/z853.8,MS/MS目标离子m/z876.4;以及内标目标离子m/z862.4,MS/MS的目标范围为860.9至877.9。使用LCQAd飄tage进行MS。下文中，通过实施例和测试实施例更具体i也描述本发明。然而，描述仅仅是示例性的，本发明不限于这些实施例。注意在实施例中描述的内标肽中带有下划线的氨基酸为取代的氨基酸。在实施例中描述的术语"SRM(选择反应监测)"是作为目标通过LC/MS/MS产生的二次离子的测定，并且与术语"SIM(选择离子监测)，，形成一对，其指作为目标通过LC/MS产生的一次离子的测定。术语"SRM目标"是指实际上测定的肽。在第一MS中检测通过酶裂解的肽，在第二MS中通过电能在具有特定长度的特定长度位置使该肽分离。测定所得的肽以计算值。在SRM目标中具有单下划线的序列代表作为要测定的目标产生的二次离子被测定的氨基酸序列部分。值"m/z"通过用在LC/MS检测器中实际上观察到的离子的质量(m)除以其电荷数(z)来计算。虽然在MS设备中各肽的带电状态不同，肽的实际质量(分子量M)通过以下数学表达式计算M=((m/z)-l)承z注意术语"单，，是指单同位素质量(分子量)，其通过从最大丰度天然出现的同位素的同位素质量计算组成式(compositionalformula)获得。实施例1(牛乳铁蛋白内标肽的制备)在定量牛乳铁蛋白时，测定在肽的氨基酸序列中氨基酸的10结合顺序上具有改变的内标肽，然后使用肽合成仪如下制备内标肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。测定目才示月太(LFP01);MW1305.645(单)；m/z653.83单+2;GluThrThrValPheGluAsnLeuProGluLys式(1)SRM目标；m/z876.4单+1GluThrThrValPheGluAsnLeuProGluLvs式(l)保留时间(min);10.29内标肽(LFP02);MW1305.645(单)，m/z653.83单+2GluThrThrL^HPheGluAsnYMProGluLys式(2)SRM目标；m/z876.4单+1GluThrThrPheGluAsnValProGluLvs式(2)j呆留时间(min);10.28。实施例2(牛乳过氧化物酶内标肽的制备l)在定量牛乳过氧化物酶时，确定在肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序具有改变的内标肽，然后使用肽合成仪如下制备内标肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。观寸定目才示月太l;MW1497.765(单)；m/z749.89单+2;SerTrpGluValGlyCysGlyAlaProValProLeuValLys式(3)SRM目标；m/z652.4单+1SerTrpGluValGlyCysGlyAlaProValProLeuValLys式(3)保留时间(min);12.10内标肽1SerTrpGluGlyCysGlyAlaProValPro:MValLys式(4)SRM目标；m/z638.4单+1SerTrpGluLeuGlyCysGlyAlaProValProValValLysj呆留时间(min):12.15实施例3式(4)(牛乳过氧化物酶内标肽的制备2)在定量牛乳过氧化物酶时，确定在肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序具有改变的内标肽，然后使用肽合成仪如下制备内标肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。观寸定目才示月太2;MW1466.799(单)；m/z734.408单+2lieHisGlyPheAspLeuAlaAlalieAsnLeuGlnArg式(5)S固目标；m/z754.4单+1lieHisGlvPheAspLeuAlaAlalieAsnLeuGlnArg式(5)保留时间(min);11.42内标肽2;MW1466.799(单)，m/z734.408单+2lieHisAlaPheAspLeuAlaGlvlieAsnLeuGlnArg式(6)SRM目标；m/z768.4单+1lieHisAlaPheAspLeuAlaGlylieAsnLeuGlnArg式(6)保留时间(min);11.36实施例4(牛血管生成素内标肽的制备)在定量牛血管生成素时，确定在肽的氨基酸序列中的氨基酸的结合顺序上具有改变的内标肽，然后使用肽合成仪如下制备内标肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。观'J定目才示月太；MW1534.757(单)；m/z768.386单+2TyrlieHisPheLeuThrGinHisTyrAspAlaLys式(7)SRM目标；m/z1122.6单+1TyrlieHisPheLeuThrGinHisTyrAspAlaLys式(7)保留时间(min);9.99内标肽；MW1534.757(单)，m/z768.386单+2TyrAlaHisPheLeuThrGinHisTyrAspIi￡Lys式(8)SRM目标；m/z1164.6单+1TyrAlaHisPheLeuThrGinHisTyrAsplieLvs式(8)保留时间(min);9.94实施例5(牛半胱氨酸蛋白酶抑制剂C内标肽的制备)在定量牛半胱氨酸蛋白酶抑制剂C时，确定包括在肽的氨基酸序列中氨基酸的结合顺序具有改变的氨基酸序列的内标肽，然后使用肽合成仪如下制备内标肽(Fmoc固相合成法(ABI433A))。测定目才示月太；1825.903(单)；m/z913.96单+2GinValValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuGlyArg式(9)SRM目标；m/z948.5单+1GinValValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuGlvArg式(9)保留时间(min)11.60内标肽；MW1825.903(单)，m/z913.96单+2Gln幽ValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuYaiArg式(10)SRM目标；m/z990.6单+1Gin幽ValSerGlyMetAsnTyrPheLeuAspValGluLeuValArg式(10)保留时间(min);11.58实施例6(肽的定量)通过在0.25至500fmol/VL的范围内改变在实施例l中使用的要测定的牛乳铁蛋白肽(LFP01)的浓度，以及使用牛乳铁蛋白内标肽(LFP02)(10fmol/|iL),制作标准曲线。测定方法如下。将每种肽溶解于0.1%曱酸、0.02。/o三氟乙酸(TFA)、和2%乙腈的水溶液，以达到预定的浓度，通过LC/MS/MS对2pL各溶液进行分析。LC/MS/MS的条件如下。使用具有柱(装备有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm,MichromBioresources,Inc.，USA)的MAGICCI8)的MAGIC2002HPLC系统(MichromBioresources,Inc.,USA)以2(iL/min的流速分离各月太。用溶、液八(2%乙腈-0.05%曱酸)和溶液8(90%乙腈-0.05%甲酸)进行梯度洗脱20分钟，同时乂人2%至65%改变溶液8的比例。要测定的离子为MS离子m/z653.8,MS/MS目标离子m/z876.4,内标目标离子m/z862.4，MS/MS的目标范围为860.9至877.9。使用LCQAdvantage(ThermoElectronCo.，USA)进行MS。各肽的峰面积从所得的色镨计算，计算各肽的面积的比。表l示出了面积的比。此外，要测定的肽(LFP01)和内标肽(LFP02)的浓度比和此时的面积比示于图1。14在图l中，水平轴表示要测定的肽(LFP01)和内标肽(LFP02)的摩尔比，纵轴表示通过LC/MS/MS确定的各肽的比。结果显示在2,000倍的范围内维持线性。此外，计算斜率为约l。从上述结果，发现要测定的肽和内标肽在离子化后的反应中显示几乎相同的行为，即，发现要测定的肽和内标肽具有几乎相同的离子化率和片段产率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例7(在脱脂乳中乳铁蛋白的测定)一天称量脱脂乳5次以制备要测定的样品。制备包含13至15mg/ml脱脂乳的水溶液，以1/1，000的量向其添加甲酸以制备样品溶液。干燥各溶液(10fil)，然后溶于包含8M尿素和lmM三(羧乙基)膦(TCEP)的20fi1O.IM的碳酸氢铵中，并在56。C下加热30分钟。使该溶液回到室温，添力口5pl100mM的碘乙酰胺溶液，在遮光条件下反应30分钟。添加超纯水(54pi),添力口lO[il0.1fig/ml的胰岛素和10|il0.1(ig/ml赖氨酰肽链内切酶，混合溶液在37。C下反应16小时。添加甲酸(ljil)以终止反应，将所得的溶液用作要测定的样品的肽溶液。各样品溶液用10fmol/nl内标肽(LFP02)(包含0.1。/。甲酸，0.02%三氟乙酸(TFA)，和2%乙腈)稀释6倍，通过LC/MS/MS分析2.5pl稀释的溶液。各肽的峰面积从所得的色谱计算，并且确定各肽的面积的比。从面积比，基于图l中所示的标准曲线确定各肽的摩尔比。当通过LC/MS/MS测定时LFP02的浓度为通过用5/6乘以10fmol/pl来计算的值。在酶处理步骤将脱脂乳样品稀释10倍和用内标溶液稀释6倍。因此，目标肽的浓度通过以下表达式计算目标肽的浓度=各肽的摩尔比乂5/6x10x60。如果将乳铁蛋白的分子量限定为80,000,可以基于目标的摩尔浓度确定重量浓度。在脱脂乳中的乳铁蛋白含量可以基于称量的脱脂乳的量确定。测定结果示于表2。术语"CV"为用通过以下计算的变化系数用标准偏差(SD)除以平均值，然后将所得的值转化成百分比，并且表示分析精度。如在表2中所示，CV值为约8.9Q/0,其是令人满意程度的变化率。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例8(在脱脂乳中的乳铁蛋白的测定)称量脱脂乳五次以制备要测定的样品。制备包括与实施例l中使用的牛乳铁蛋白内标肽(LFP02)相同的序列的突变型牛乳铁蛋白。将突变型牛乳铁蛋白用作内标以测定在脱脂乳中要测定的乳铁蛋白。如下进行该方法。制备15至16mg/ml脱脂乳的水溶液，以1/1,OOO的量向其添加曱酸以制备样品溶液。向10pl各样品溶液中添加10pl30ing/ml的突变型牛乳铁蛋白，将所得的溶液干燥，然后溶于包含8M尿素和lmM三(羧乙基)膦(TCEP)的20(il0.1M碳酸氢铵中。将全体在56。C下加热30分钟。4吏溶液回到室温，向其添加5ji1100mM碘乙酰胺的溶液，在遮光条件下反应30分钟。向所得物添加超纯水(54(il)，向其添加10pl0.1ixg/ml的胰岛素和10)il0.1fig/ml赖氨酰肽链内切酶，使混合溶液在37。C下反应16小时。添加甲酸(l!il)以终止反应，将所得的溶液用作要测定的样品的肽溶液。各样品溶液用0.1%甲酸，0.02%三氟乙酸(TFA),和2%乙腈的水溶液稀释10倍，通过LC/MS/MS分析2.5pl的稀释液。使用包括柱(装备有5卞L肽捕集器(0.2mmIDx50mm,)的MAGICC18)的MAGIC2002HPLC系统以2fiL/min的流速分离各肽。用溶液八(2%乙腈-0.05%曱酸)和溶液B(90。/o乙腈-0.05o/o甲酸)进行梯度洗脱20分钟，同时从2%至65%改变溶液8的比。要测定的离子为母离子m/z853.8,MS/MS目标离子m/z876.4，内标目标离子m/z862.4，MS/MS的目标范围为860.9至877.9。使用LCQAdvantage(ThermoElectronCo.,USA)进行MS。各肽的峰面积从所得的色谱计算，并且计算各肽的面积的比。从基于图1中所示的标准曲线的面积比计算各肽的摩尔比。突变型牛乳铁蛋白和牛乳铁蛋白具有相同的分子量，添加的突变型牛乳铁蛋白的浓度为30jig/ml。因此，在脱脂乳溶液中的乳铁蛋白的浓度通过使各肽的摩尔比乘以30来计算。在脱脂乳中的乳铁蛋白基于称重的脱脂乳的量来计算。测定结果示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>结果，在脱脂乳中的乳铁蛋白为106.5mg/100g-脱脂乳。权利要求1.一种通过LC/MS/MS定量肽的方法，包括将在要测定的肽的氨基酸序列的顺序上具有改变的肽用作内标物质。2.—种通过LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括将在要测3.—种通过LC/MS/MS定量蛋白的方法，包括将在要测定的蛋白的氨基酸序列的顺序上具有改变的蛋白用作内标物质。4.根据权利要求l-3任一项所述的定量蛋白的方法，其中所述要测定的蛋白为牛乳铁蛋白、牛乳过氧化物酶、牛血管生成素和牛半胱氨酸蛋白酶抑制剂C中的任一种。全文摘要公开了一种测定方法，其能够高精度地和以简单的方式定量以痕量包含的特定蛋白或肽，而不需要使用任何昂贵的试剂。目标蛋白或肽可以通过LC/MS/MS通过使用蛋白或肽作为内标来定量，所述蛋白或肽包括在目标蛋白或肽的氨基酸序列中氨基酸残基的结合顺序重组的氨基酸序列。文档编号G01N30/88GK101600959SQ20078004827公开日2009年12月9日申请日期2007年12月27日优先权日2006年12月28日发明者小野爱子,川上浩,森田如一,芹泽笃申请人:雪印乳业株式会社